劉 敏,董 強(qiáng),唐圣桃,陶依然,吳 錚,王鯤宇,王 文*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院,中國北京100053；2.河北北方學(xué)院,中國河北張家口075000；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院,中國甘肅蘭州730030；4.郴州市第一人民醫(yī)院,中國湖南郴州423000)

髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma,MB)是兒童易患的侵襲性腦腫瘤,占兒科腦腫瘤的20%,也是引起兒童癌癥發(fā)病率和死亡率升高的主要因素[1,2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)分類標(biāo)準(zhǔn),這種胚胎性小腦腫瘤屬于Ⅳ級(jí)惡性腫瘤,通常沿腦脊液循環(huán)途徑向腦內(nèi)其他區(qū)域及脊髓轉(zhuǎn)移。MB的病理類型分為4種:Wnt(Wingless signaling pathway-activated)、SHH(Sonic Hedgehog signaling pathway-activated)、group 3 和 group 4[3]。目前MB的治療包括手術(shù)的完整切除及術(shù)后全腦和脊髓的放療、大劑量化療。隨著手術(shù)方式的改進(jìn)及放化療策略的完善,MB患者死亡率和致殘率已明顯下降,但依然有大約三分之一的患者預(yù)后不佳,病情最終惡化[4]。因此,分子靶向治療成為MB治療的新方法[5]。隨著表達(dá)譜芯片、高通量測序等生物信息學(xué)的發(fā)展,研究者可以在全基因組水平上進(jìn)行大規(guī)模、高通量、高靈敏度、高精確度的基因序列測定及功能研究[6,7]。這為MB分子機(jī)制研究提供了新手段。

本研究通過下載GEO數(shù)據(jù)庫中原始數(shù)據(jù),利用R語言對髓母細(xì)胞瘤基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因篩選,然后通過DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能富集、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路分析；用STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)可視化分析,同時(shí)篩選網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的關(guān)鍵基因。以上分析可為MB分子機(jī)制的進(jìn)一步研究提供線索和思路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫下載基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE50161。本研究選取GSE50161數(shù)據(jù)集中22例髓母細(xì)胞瘤樣本和13例正常腦組織樣本進(jìn)行分析。

1.2 數(shù)據(jù)歸一化處理及差異基因篩選

GSE50161原始表達(dá)譜數(shù)據(jù)利用R語言(3.3.0；www.r-project.org)的“affy”包進(jìn)行表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化處理,利用limmar包以貝葉斯檢驗(yàn)的方法分析髓母細(xì)胞瘤與正常腦組織中差異表達(dá)的基因[8,9]。以|log2(fold change)|(|log2FC|)＞2且adjust P＜0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn),分析22例髓母細(xì)胞瘤組織樣本和13例正常組織樣本中差異表達(dá)比較明顯的基因。

1.3 GO功能富集和KEGG通路分析

DAVID數(shù)據(jù)庫是一個(gè)功能基因注釋的在線分析平臺(tái),它為研究人員提供了一套全面的功能注釋工具,以便了解大量功能基因的生物學(xué)意義[10]。通過DAVID分析工具,對差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析。同時(shí)從生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)方面對差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能富集分析。最后利用R語言中的“clusterProfiler”和“ggplot2”對GO功能富集和KEGG信號(hào)通路進(jìn)行可視化分析[11,12]。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)和關(guān)鍵基因分析

為了預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的調(diào)控關(guān)系,本研究使用STRING(https://string-db.org)在線分析工具構(gòu)建MB組織與正常腦組織中差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)[13]。另外,通過Cytoscape(http://cytoscape.org/download_old_versions.html)軟件進(jìn)行可視化蛋白質(zhì)互相網(wǎng)絡(luò)分析[14],采用cytoHubba插件定義蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的前10個(gè)關(guān)鍵基因[15]。

2 結(jié)果

2.1 差異基因

根據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),本研究分析了正常組織與髓母細(xì)胞瘤組織中具有明顯差異表達(dá)的基因。首先對兩組數(shù)據(jù)中的基因表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,標(biāo)準(zhǔn)化后以小提琴圖呈現(xiàn)(圖1A)。然后以|log2FC|＞2.0和P＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn),總共篩選出999個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因690個(gè),下調(diào)基因309個(gè),分別占總差異表達(dá)基因的69%和31%(圖1B)。最后對差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類熱圖分析,可視化差異基因在不同樣本中的表達(dá)(圖2)。

2.2 GO和KEGG分析

采用R語言clusterProfiler軟件包分別對999個(gè)差異基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析,包括生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)。以偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)＜0.05 且計(jì)數(shù)＞2 作為閾值,按P值排序選取前10位的功能富集類別,結(jié)果如圖3A所示。差異基因功能主要富集于有絲分裂的核分裂、染色體分離、組蛋白激酶活性、趨化因子活性、微管運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、微管蛋白結(jié)合、RAGE受體結(jié)合等生物學(xué)過程。KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示,差異基因主要富集于NF-κB信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、T細(xì)胞受體等與腫瘤相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路(圖3B)。

2.3 差異基因所編碼蛋白質(zhì)間的互作網(wǎng)絡(luò)分析

STRING是一個(gè)由已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)組成的數(shù)據(jù)庫。本研究將999個(gè)存在顯著差異表達(dá)的基因輸入STRING在線分析工具,分析其蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系,然后將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件,可視化蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò),并利用插件cytoHubba分析出CCNB1、AURKB、MAD2L1、CENPE、KIF2C、BUB1、BUB1B、NDC80、CENPF、CDC20 十個(gè) hub 基因(圖 4)。

3 討論

圖1 樣本基因表達(dá)量的背景校正和差異基因分析(A)校正后樣本表達(dá)量的小提琴圖。橫軸表示不同樣本組織(紅色代表髓母細(xì)胞瘤樣本,綠色代表正常樣本),縱軸表示基因表達(dá)量,中間菱形表示樣本表達(dá)的中位值；(B)差異表達(dá)基因的火山圖。紅色表示表達(dá)水平上調(diào)的基因,綠色表示表達(dá)水平下調(diào)的基因。Fig.1 Background correction of sample gene expression and the differential gene analysis(A)Violin plot of corrected sample expression.The horizontal axis shows different sample tissues(red represents medulloblastoma samples and green represents normal samples),and the vertical axis shows the expression level.The middle diamond shows the median value of the sample expression；(B)Volcano map of differentially expressed genes.Red and green indicate increased and decreased expression,respectively.

圖2 髓母細(xì)胞瘤組織與正常腦組織中差異表達(dá)基因的聚類熱圖綠色表示下調(diào),紅色表示上調(diào)；藍(lán)色表示正常的組織樣本,橙色為髓母細(xì)胞瘤樣本。Fig.2 Cluster heat map of differential expression genes between the medulloblastoma tissue and normal brain tissueGreen and red indicate down-regulated genes and up-regulated genes,respectively.Blue and orange represent normal tissue samples and medulloblastoma samples,respectively.

MB是兒童易患的惡性程度很高的侵襲性腦腫瘤,并且容易復(fù)發(fā)。最近研究顯示,MB的分子類型在復(fù)發(fā)和原發(fā)腫瘤中不完全相同,復(fù)發(fā)前后存在遺傳學(xué)差異[16,17]。所以,探索MB的發(fā)病機(jī)制,尋找MB早期診斷、復(fù)發(fā)和預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物是目前急需解決的問題。近年來,基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)成為腫瘤在分子水平進(jìn)行機(jī)制研究的主要方法[18～21],而基因芯片、高通量測序等現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展以及生物信息學(xué)方法的應(yīng)用為我們從分子水平探索MB的發(fā)生、發(fā)展提供了很好的手段。本研究采用生物信息學(xué)方法,比較分析了MB組織和正常腦組織中表達(dá)具有顯著差異的基因,定義了999個(gè)差異表達(dá)基因,同時(shí)對差異基因進(jìn)行了GO功能注釋及KEGG信號(hào)通路分析,并通過PPI網(wǎng)絡(luò)對MB差異基因所編碼蛋白質(zhì)間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了可視化分析。

對999個(gè)差異表達(dá)的基因(包括690個(gè)上調(diào)基因和309個(gè)下調(diào)基因)進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析,結(jié)果顯示:這些差異基因的生物學(xué)過程主要富集于有絲分裂的核分裂、染色體分離、組蛋白激酶活性、趨化因子活性、微管運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、微管蛋白結(jié)合、RAGE受體結(jié)合。它們通過調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂,影響細(xì)胞的分裂增殖,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。KGEE通路主要富集于NF-κB信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路。之前的研究顯示,這些信號(hào)通路與腫瘤的增殖、侵襲和遷移以及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[22～24],在MB發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

圖3 差異基因GO和KEGG分析(A)差異表達(dá)基因的GO富集?？v軸表示富集的生物學(xué)功能,橫軸表示每個(gè)生物學(xué)功能富集的基因個(gè)數(shù),柱子顏色表示P值大?。?B)差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路富集。橫軸表示通路富集分?jǐn)?shù),縱軸表示差異表達(dá)基因富集的信號(hào)通路,顏色表示P值大小。Fig.3 The GO and KEGG analysis of differential expression genes(A)GO enrichment of the differentially expressed genes.The vertical axis represents enrichment of biological functions,and the horizontal axis represents the number of genes enriched for each biological function,and the color of column indicates the P value；(B)KEGG signaling pathway enrichment of the differential expression genes.The horizontal axis represents the pathway enrichment fraction,and the vertical axis represents the signal pathway for differentially expressed gene enrichment,and the color indicates the P value.

圖4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Protein-protein interaction network

通過PPI網(wǎng)絡(luò)我們定義了CCNB1、AURKB、MAD2L1、CENPE、KIF2C、BUB1、BUB1B、NDC80、CENPF、CDC20十個(gè)關(guān)鍵基因。細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1,CCNB1)是有絲分裂M期蛋白質(zhì),被視為腫瘤抗原,可以用于評價(jià)腫瘤的惡性程度。De Haas等[25]的研究顯示,CCNB1在MB中高表達(dá),可以作為一個(gè)獨(dú)立的分子標(biāo)志物判斷患者的預(yù)后。AURKB是Aurora激酶家族成員,對染色質(zhì)凝集、分離和胞質(zhì)分裂起關(guān)鍵作用。Diaz等[26]研究發(fā)現(xiàn),通過抑制AURKB蛋白的表達(dá),能夠在體內(nèi)和體外抑制MYC過表達(dá)的group 3型MB細(xì)胞的增殖,同時(shí)能夠增強(qiáng)對group 3型MB治療的敏感性。有絲分裂停滯缺陷蛋白2(mitotic arrest deficiency protein 2,MAD2L1)是調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵蛋白質(zhì),在腫瘤中的表達(dá)情況跟腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)[27]。著絲粒相關(guān)蛋白E(centromere-associated protein E,CENPE)和著絲粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)是一類調(diào)控著絲粒運(yùn)動(dòng)的蛋白質(zhì),主要功能為通過調(diào)控細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞周期,影響細(xì)胞增殖和分裂,與多種腫瘤的增殖密切相關(guān)[28,29]。KIF2C又稱有絲分裂著絲粒相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白(mitotic centromere associated kinesin,MCAK),是驅(qū)動(dòng)蛋白家族的一員,通過參與微管解聚、二極紡錘體形成以及染色體分離,調(diào)節(jié)有絲分裂和細(xì)胞周期[30]。BUB1/BUB1B是一種可以檢測到紡錘體微管附著在著絲粒上的蛋白質(zhì),研究發(fā)現(xiàn)BUB1/BUB1B在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中有重要作用,可以作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤靶向治療的候選分子[31,32]。核分裂周期蛋白80(nuclear division cycle 80,NDC80)是有絲分裂調(diào)節(jié)因子的核心組成部分。NDC80是一種四聚體蛋白復(fù)合物,在細(xì)胞有絲分裂過程中起重要作用。研究顯示,NDC80在腫瘤中高表達(dá),可作為某些腫瘤的診斷標(biāo)志物[33,34]。細(xì)胞分裂周期蛋白20(cell division cycle protein 20,CDC20)是有絲分裂過程中所必需的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)分子,其主要通過活化APC形成一種E3泛素連接酶復(fù)合物,調(diào)控cyclin B的泛素化和降解,從而促進(jìn)有絲分裂后期的開始[35]。從上述分析可知,許多生物標(biāo)志物通過調(diào)控細(xì)胞周期途徑影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,其中包括本文篩選的10個(gè)關(guān)鍵基因。因此,進(jìn)一步對細(xì)胞周期相關(guān)的關(guān)鍵基因展開探索具有重要意義。

綜上所述,基于GEO數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)譜分析,本研究鑒定了正常腦組織和MS組織中差異表達(dá)的基因999個(gè),同時(shí)通過生物信息學(xué)的方法分析得到了 CCNB1、AURKB、MAD2L1、CENPE、KIF2C、BUB1、BUB1B、NDC80、CENPF、CDC20 十個(gè)關(guān)鍵基因。這些關(guān)鍵基因主要通過參與調(diào)控細(xì)胞周期通路影響MS的發(fā)生發(fā)展。它們可能是探索MS生物學(xué)機(jī)制的潛在生物標(biāo)志物,可用作MS診斷或干預(yù)治療的潛在靶標(biāo)。本研究為進(jìn)一步探索MS發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了新思路。