伍君子,馬小倩,楊策軍,容鵬飛,聶 唯,王 維

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院細胞移植與基因治療中心,中國湖南長沙410013)

缺氧是移植胰島細胞團面臨的重大挑戰(zhàn)。一方面,經(jīng)分離提純后離斷動靜脈的胰島細胞團僅靠表面氧彌散作用無法滿足細胞團中心的血氧供應(yīng)[1～3],而具有分泌作用的β細胞恰好分布于細胞團中心部分。另一方面,缺氧導(dǎo)致細胞壞死的同時會引發(fā)炎癥,導(dǎo)致周邊腺泡雜質(zhì)額外耗氧量升高,從而加劇缺氧；同時在移植早期,立即經(jīng)血液介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)(instant blood-mediated inflammatory reaction,IBMIR)會在細胞團表面形成微血栓,激活的補體引發(fā)血小板級聯(lián)瀑布反應(yīng),進一步加劇胰島缺氧[4～6]。因此,體外培養(yǎng)及移植早期是胰島細胞缺氧最嚴(yán)重的時期,70%的移植胰島會在這一階段死亡[7,8]。此外,有研究證實早期低氧暴露可能導(dǎo)致人類胰島細胞基因標(biāo)記的持續(xù)變化和胰島素分泌的持久損失[9,10],而且即使不在缺氧核心部位,存活的缺氧胰島也表現(xiàn)為功能不佳或無功能。因此,在體外培養(yǎng)及移植早期采取干預(yù)措施,提高胰島細胞應(yīng)對缺氧能力,直接關(guān)系到胰島的存活及移植胰島的功能。

大量文獻報道,間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)與胰島細胞共培養(yǎng)或共移植有利于保存胰島的活性,提高胰島功能[11～16]。近期研究認為MSCs的旁分泌作用在其中占據(jù)重要地位[17],但關(guān)于MSCs對胰島細胞的缺氧損傷保護機制尚缺乏直接關(guān)注。本實驗選擇免疫原性低且已有研究證明確能通過異體移植改善非人類靈長類動物糖尿病的新生豬胰島細胞團(neonatal porcine islet cell clusters,NICCs)[18]為細胞供體,以體積分?jǐn)?shù)為1%的O2模擬移植后肝竇內(nèi)缺氧環(huán)境,從細胞得率、死亡方式、線粒體呼吸鏈功能、糖刺激應(yīng)對能力等方面探討富含人臍帶間充質(zhì)干細胞旁分泌細胞因子的條件培養(yǎng)基(human umbilical cordderived MSC-conditioned medium,hu-MSC-CM)對缺氧胰島的保護作用。

1 材料與方法

1.1 NICCs的獲取

出生3～5 d的無特定病原體(specific pathogenfree,SPF)豬由湖南賽諾生物科技股份有限公司提供。按照本實驗室前期建立的方法[19]將供體胰腺進行消化、分離及純化得到NICCs。

1.2 hUC-MSCs的分離和鑒定

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),臍帶由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院健康產(chǎn)婦分娩后自愿捐贈。采用組織塊貼壁法[20]分離hUC-MSCs,待原代細胞融合面積達50%時棄上清與組織,傳代純化。取P3～5代hUC-MSCs的細胞懸液,加入鼠抗人單克隆抗體異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-CD73、FITC-CD105、FITC-CD90、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)/花菁染料(cyanine dye,Cy)5-CD45(白細胞共同抗原)、PE-HLA-DR(白細胞相關(guān)抗原),利用熒光激活細胞分類器(fluorescence activated cell sorter,FACS)檢測細胞表面標(biāo)志物。

1.3 人臍帶干細胞源條件培養(yǎng)基的收集

將P3～5代hUC-MSCs置于含10%(體積分?jǐn)?shù))豬血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司,美國),常氧培養(yǎng)至細胞融合達90%時,改為不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后收集細胞上清,超速離心逐步去除懸浮細胞、死亡細胞、細胞碎片及凋亡小體等。將上清用0.22 μm濾器過濾,獲得hu-MSC-CM。-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實驗細胞分組

實驗組:NICCs用含10%(體積分?jǐn)?shù))豬血清、30%hu-MSC-CM的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。對照組:NICCs用含10%豬血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將實驗組及對照組細胞分別置于常氧(20%O2、37 ℃、5%CO2)和缺氧(1%O2、37 ℃、5%CO2)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,隨后收集細胞,進行數(shù)量、活力及功能檢測。

1.5 胰島細胞數(shù)量的測定

收集常氧及缺氧培養(yǎng)的各組NICCs懸液50 μL,光鏡下檢測胰島細胞團數(shù)量并測量其直徑,同時將結(jié)果換算為胰島細胞當(dāng)量(islet equivalent,IEQ)。各組取50 mL胰島細胞懸液至冰上裂解、超聲波破碎后,采用 BCA法對各組裂解的蛋白質(zhì)樣品進行定量檢測,并將測量值設(shè)為總蛋白質(zhì)含量。

1.6 AO/EB染色檢測胰島細胞凋亡

每組取1 000 IEQ胰島細胞懸液離心后重懸至細胞終濃度為1×105/mL。取100 μL細胞懸液加入96孔板內(nèi),加入4 μL吖啶橙(acridine orange,AO；美國Amresco公司)和溴乙啶(ethidium bromide,EB；美國Sigma公司)等量混合染料后,置于熒光顯微鏡下觀察,從形態(tài)學(xué)方面檢測胰島細胞凋亡。

1.7 胰島β細胞的活性檢測

采用FACS檢測胰島β細胞的活性。取每組NICCs 500～2 000 IEQ并離心、消化為單個胰島細胞,加入1 mL培養(yǎng)基重懸。隨后加入4 mL Newport Green及1 mL 7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D,7-AAD)染色液避光孵育,染色完成后進行流式細胞檢測。數(shù)據(jù)用WinMDI 2.9軟件分析。

1.8 胰島β細胞的功能分析

采用Seahorse線粒體應(yīng)激實驗評價胰島β細胞的功能變化。將Seahorse XF細胞線粒體應(yīng)激測試試劑盒(Seahorse Bioscience公司,美國)的檢測板提前一天水合,各組胰島細胞重懸后按每孔200 IEQ種植在胰島捕獲板上,無CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后置于生物能量代謝監(jiān)測儀上。預(yù)設(shè)程序依次加入葡萄糖、寡霉素(ATP合酶抑制劑)、氰化物4-苯腙(線粒體呼吸鏈解偶聯(lián)劑)、抗霉素A/魚藤酮(線粒體呼吸鏈復(fù)合物抑制劑)。測試結(jié)束后收集細胞,測量其DNA含量。

1.9 Western-blot檢測胰島細胞在缺氧環(huán)境下蛋白質(zhì)水平的表達情況

將實驗組及對照組細胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h、48 h后,取50 mL各組胰島細胞懸液離心,加入RIPA細胞裂解液,并進行冰上裂解及超聲波破碎。離心后采用BCA法對各組裂解的蛋白質(zhì)樣品進行定量檢測并調(diào)至等濃度。將蛋白質(zhì)樣品與loading buffer煮沸變性以后,通過SDS-PAGE電泳將等體積等質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品中不同相對分子質(zhì)量的目標(biāo)蛋白進行分離,并以200 mA電流將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。以含5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h后,加入已按相關(guān)抗體說明書成比例稀釋的HIF-1α(美國Novus Biologicals公司)、受體相互作用蛋白3(RIP3,美國Santa Cruz公司)、cleaved-caspase 3(美國 Cell Signaling Technology公司)、p-腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK,美國 Cell Signaling Technology 公司)、LC3(美國Sigma公司)的一抗,孵育過夜,再進行辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育,隨后以超敏增強化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒顯色。樣本結(jié)果用β-actin條帶作為內(nèi)對照校正。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用Graphpad prism 7.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組比較采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)分析取P＜0.05為顯著性檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs鑒定

純化后P3～5代hUC-MSCs呈旋渦狀生長,細胞表面高表達基質(zhì)細胞抗原CD73、CD105、CD90(≥95%),基本不表達CD45和HLA-DR(≤1%)。檢測結(jié)果見圖1。

2.2 hu-MSC-CM能減少缺氧環(huán)境下NICCs的得率損失

常氧及缺氧環(huán)境下hu-MSC-CM組胰島細胞數(shù)差異和總蛋白質(zhì)減少量都明顯小于對照組(RPMI1640),且均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05,表1),說明hu-MSC-CM對缺氧造成的NICCs得率損失具有保護作用。

2.3 hu-MSC-CM能保護缺氧環(huán)境下NICCs的活性

對缺氧環(huán)境下培養(yǎng)3 d的兩組胰島細胞進行AO/EB染色,結(jié)果顯示:缺氧條件下,兩組NICCs的體積均變小,周圍見較多細胞碎片,胰島細胞橘紅色熒光明顯較常氧組胰島細胞強,其中對照組更顯著(圖2A)。以上信息說明對照組胰島細胞對缺氧反應(yīng)更為敏感,細胞活性減退明顯。

流式結(jié)果顯示,缺氧條件下實驗組、對照組中活的β細胞(Newport Green染色陽性、7-AAD染色陰性)比例分別為65.2%±7.0%、45.7%±5.1%,且實驗組細胞在常氧、缺氧條件下產(chǎn)生的活β細胞比例差異較對照組明顯縮小(P＜0.001,圖2B)。這說明hu-MSC-CM培養(yǎng)的NICCs對抗缺氧能力更強,hu-MSC-CM對缺氧環(huán)境下的NICCs具有一定的保護效果。

2.4 hu-MSC-CM能保護缺氧環(huán)境下NICCs的功能

缺氧培養(yǎng)3 d后進行細胞外通量分析,結(jié)果顯示缺氧環(huán)境下兩組細胞中線粒體應(yīng)激指標(biāo):應(yīng)對糖刺激反應(yīng)(圖 3A)、ATP 產(chǎn)量(圖 3B)、基礎(chǔ)耗氧量(圖3C)、最大的呼吸儲備能力(圖3D)較常氧狀態(tài)均明顯減低,且對照組降低更為顯著,特別是在基礎(chǔ)耗氧量這一指標(biāo)上,hu-MSC-CM組顯著高于對照組[62.43±19.64 pmol/(min·μg DNA）vs.32.61±18 pmol/(min·μg DNA),P＜0.001]。上述結(jié)果說明在缺氧狀態(tài)下,hu-MSC-CM能顯著改善胰島細胞的線粒體呼吸功能。

圖1 hUC-MSCs表面標(biāo)記物的流式細胞檢測結(jié)果Fig.1 Detection of the hUC-MSCs surface protein expression by FACS

表1 常氧、缺氧環(huán)境下不同培養(yǎng)基組NICCs數(shù)量變化情況Table 1 Changes of the number of islet cells cultured with different media under normoxic and hypoxic conditions

圖2 正?；蛉毖醐h(huán)境下不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的胰島細胞活性檢測結(jié)果(比例尺:1 000 μm)(A)AO/EB染色?；罴毎巳旧|(zhì)著綠色,死亡細胞核染色質(zhì)著橘色,早期凋亡細胞核染色質(zhì)著綠色并呈固縮狀,繼發(fā)性壞死細胞核染色質(zhì)著橘色并呈固縮狀；(B)Newport Green/7-AAD流式細胞檢測結(jié)果。Fig.2 Viability of islets cultured with different media under normoxic or hypoxic conditions(scale bar:1 000 μm)(A)AO/EB staining.Living cells:Nuclear chromatins are green；Dead cells:Nuclear chromatins are orange；Early apoptosis cells:Nuclear chromatins are green and condensation；Secondary necrosis cells:Nuclear chromatins are orange and condensation.(B)FACS for Newport Green/7-AAD.

圖3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的NICCs在常氧及缺氧環(huán)境下的細胞外通量分析A:葡萄糖；B:寡霉素；C:氰化物 4-苯腙；D:抗霉素 A/魚藤酮。Fig.3 Extracellular flux analysis of NICCs cultured in different media under normoxic or hypoxic conditionsA:Glucose；B:Oligomycin；C:FCCP；D:Antimycin A and rotenone.

2.5 hu-MSC-CM對缺氧條件下凋亡、自噬及缺氧耐受相關(guān)蛋白質(zhì)表達的調(diào)節(jié)作用

缺氧24 h時,實驗組中HIF-1α的表達量與對照組相比,差異不大；缺氧48 h后,HIF-1α在實驗組中的表達水平較對照組明顯增加,且48 h的表達量較24 h升高。但是,與實驗組相比,對照組的NICCs中細胞凋亡上游調(diào)控因子RIP3和cleaved-caspase 3的表達在24 h內(nèi)增強,說明實驗組與對照組相比,凋亡降低。同時,與對照組相比,實驗組磷酸化AMPK和LC3 I/II比值降低,說明實驗組自噬發(fā)生較少,這也提示實驗組NICCs的周圍微環(huán)境比較好(圖4)。

3 討論

胰腺β細胞是人體內(nèi)代謝活性最強的細胞之一,它高度依賴ATP合成的氧化代謝,而細胞內(nèi)抗氧化酶表達水平卻較低,這使得β細胞對缺氧損傷高度敏感[21～23]。β細胞獨特的糖酵解通量與線粒體氧化活性直接相關(guān)[21,24]。在本研究中,我們也從低氧環(huán)境中胰島細胞的糖刺激反應(yīng)能力、ATP釋放量、線粒體基礎(chǔ)耗氧量及呼吸儲備能力方面,證明了缺氧能通過破壞線粒體呼吸鏈,損傷胰島細胞功能(圖3)。經(jīng)分離純化處理后的胰島細胞一般成團存在,且不再具有正常生理狀態(tài)下的動靜脈系統(tǒng),僅能通過彌散作用從培養(yǎng)基中獲氧,而這種氧彌散作用會隨細胞團直徑的增加遞減,使得細胞團中心的β細胞更易發(fā)生缺氧損傷甚至壞死。同時為了提高新生豬胰島細胞的成熟度,延長胰島細胞體外培養(yǎng)時間至一個星期以上甚至一個月是必不可少的[25],這又將給氧含量偏低的胰島細胞團帶來更為嚴(yán)峻的缺氧挑戰(zhàn)。實驗中我們也發(fā)現(xiàn),胰腺分離培養(yǎng)6 d后剩余胰島細胞團的直徑大多集中在50～150 nm,即使常氧條件下隔天換液,AO/EB染色仍可以看出較大胰島細胞團不可避免地出現(xiàn)了死亡,且以中心區(qū)域最為明顯(圖2A)。

圖4 缺氧環(huán)境下不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的胰島細胞中生存信號蛋白質(zhì)的Western-blot分析Fig.4 Western-blot analysis of survival signal proteins in NICCs cultured with different media under hypoxic conditions*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

為緩解體外培養(yǎng)及移植早期氧化應(yīng)激對高代謝活性的β細胞存活及功能的雙重打擊,部分研究提出干細胞與胰島細胞共培養(yǎng)或體內(nèi)聯(lián)合移植。但將具有增殖性的細胞群移植至活體內(nèi)會產(chǎn)生免疫相容性、致瘤性、栓子形成及感染傳播等風(fēng)險；并且與MSCs共同培養(yǎng)也存在細胞需求量大、培養(yǎng)周期不同步、移植時增大門脈栓塞風(fēng)險等諸多弊端；此外,間接接觸培養(yǎng)在培養(yǎng)體系、換液污染等方面更是提出了很多新問題。所有這些使得共培養(yǎng)或聯(lián)合移植模式僅停留在實驗階段,不能大規(guī)模應(yīng)用于臨床。越來越多的實驗證明,MSCs改善受損細胞增殖和活力、免疫調(diào)節(jié)及抗炎活性的主要作用機制是通過旁分泌實現(xiàn)的[26,27]。目前,關(guān)于MSCs旁分泌直接協(xié)助胰島抗缺氧的作用機制仍不明確。缺氧條件下,我們通過加入30%hu-MSC-CM條件培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)可有效減少胰島細胞死亡、提高細胞活性和功能(圖2、圖3),這可能是干細胞分泌物抗炎、促細胞修復(fù)、促再血管化和抗凋亡的共同作用。同時與直接使用干細胞移植相比,干細胞條件培養(yǎng)基規(guī)避了增殖性活體細胞群的免疫、致瘤風(fēng)險,且無需使用具有潛在毒性的冷凍劑。后期我們還可以通過受控實驗室條件下量身定制的細胞系進行大規(guī)模生產(chǎn),用類似于常規(guī)藥劑的方式評估源于MSCs的分泌物 (如細胞因子、趨化因子等)的安全性、劑量和效力,并為現(xiàn)成的分泌物用于急性病癥的治療提供可能,使其在臨床應(yīng)用中更經(jīng)濟實用。

另外,實驗中對照組RIP3(凋亡終產(chǎn)物)、cleaved-caspase 3(凋亡、壞死通路的共同上游因子)在缺氧24 h內(nèi)同步升高,但在48 h時間點內(nèi)RIP3繼續(xù)升高,而cleaved-caspase 3升高趨勢減緩(圖4),提示24 h后缺氧細胞的主要死亡方式是壞死,這與文獻報道[28]一致。缺氧48 h時,對照組胰島細胞中LC3Ⅰ/Ⅱ (自噬蛋白)表達升高,而其上游因子p-AMPK的表達水平反而下降,同時實驗組p-AMPK和LC3Ⅰ/Ⅱ比值降低(圖4),這說明缺氧可能還激發(fā)了其他自噬通路的上游因子,而hu-MSC-CM能通過分泌的生物活性物質(zhì)改善缺氧胰島自噬。此外,我們前期實驗發(fā)現(xiàn),缺氧24 h后細胞器結(jié)構(gòu)腫脹、細胞變圓、胞膜破裂、內(nèi)容物外溢,介導(dǎo)程序性壞死的RIP3升高。我們猜測缺氧引發(fā)的胰島細胞死亡可能也是程序性壞死。這與其他研究提出的長期缺氧會降低胰島線粒體氧化磷酸化水平,并導(dǎo)致胰腺β細胞壞死[29]的結(jié)果一致。

近年來關(guān)于MSCs的旁分泌效應(yīng)在修復(fù)組織器官損傷(如皮膚創(chuàng)傷[30]、心血管損傷[31,32]、腦損傷[33]等)、器官移植[34]、腫瘤治療[35]等方面展現(xiàn)出了較大的臨床治療潛力。但我們也注意到MSCs的外泌體在腫瘤耐藥性、免疫逃逸、轉(zhuǎn)移等方面也起著一定的作用[36]。而且,不同來源及不同周圍微環(huán)境的MSCs蛋白質(zhì)分泌組及治療潛力有所差異[37,38]。所以,我們下一步可針對干細胞詳細分泌譜展開研究,為單獨應(yīng)用MSC-CM中的營養(yǎng)因子或組合進行無細胞治療、疾病定向治療提供更多可能性。