李華金,許文婷,肖亞梅,彭亮躍*

(1.省部共建淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室,中國湖南長沙410081；2.湖南師范大學生命科學學院,中國湖南長沙410081)

原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)是胚胎發(fā)育早期與體細胞分離且最早出現(xiàn)的生殖細胞,隨著胚胎的發(fā)育最終遷移至生殖嵴。在性腺分化過程中,其發(fā)育成卵原細胞或者精原細胞,最終分化形成成熟的卵子或精子[1]。目前,PGCs的形成最少有兩種模式:先成論和后成論[2]。先成論模式是指生殖細胞在胚胎發(fā)育的很早時期就能被鑒定出來,其分化是由定位在“生殖質(zhì)”中特異的胞質(zhì)決定子決定的。果蠅[3]、線蟲類、無尾兩棲動物[4]、斑馬魚[5,6]以及文昌魚[7]PGCs的形成都屬于這種模式。后成論是指在胚胎發(fā)育的晚期才能鑒定出生殖細胞,該觀點認為生殖細胞是由體細胞周圍組織誘導分化而來。羊膜動物雞、小鼠[8,9]和兩棲綱有尾類動物墨西哥蠑螈[10,11]等PGCs的形成均為后成論模式。

早期對于魚類PGCs的起源,研究人員的意見各不相同,但主要觀點有兩種:一種認為起源于中胚層,另一種認為起源于內(nèi)胚層。直到1997年,Yoon等[6]從斑馬魚中分離出了vasa基因,魚類PGCs的起源才真正得到了揭示。在斑馬魚中,母源的vasa基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物集中在卵裂早期的卵裂溝中,在32細胞期時被分配到4個細胞當中,這4個細胞也就是原原始生殖細胞；在囊胚晚期,vasa陽性的細胞數(shù)增加至12～16個,對稱分布,呈4簇,這些細胞將分化成PGCs[6]。隨后,人們在冰鰕虎魚[12]、金魚[13]和泥鰍[14]中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了相似的PGCs形成模式,表明先成論很可能是硬骨魚類PGCs形成的一種普遍模式。然而青鳉PGCs的形成并不屬于這種模式。雖然人們在青鳉早期卵裂過程中也發(fā)現(xiàn)了生殖質(zhì)顆粒的成分,但其vasa RNA在早期胚胎中的分布與斑馬魚極不相同,青鳉vasa RNA廣泛地分布在卵裂期胚胎的許多細胞,直到原腸晚期vasa信號才定位于PGCs中[15]。目前研究的魚類中,大西洋鱈魚、鱘魚[16]、大西洋鮭、大菱鲆、鯉魚、金魚、泥鰍與斑馬魚的PGCs形成模式相似,而虹鱒魚、真鯛與青鳉的PGCs形成模式相似。

目前,已有多種魚類生殖細胞標記基因被研究人員利用原位雜交或免疫組化的方法成功地鑒定出來。Xu等[17]利用雙色熒光原位雜交的方法,同時用兩種生殖細胞特異基因來標記青鳉的PGCs。但是這種方法標記的PGCs不是活體的,不能進行分離、移植等活體操作,而轉(zhuǎn)基因技術(shù)則可以實現(xiàn)PGCs的活體示蹤,為魚類生殖細胞的研究提供了極大的便利。Yoshizaki等[18]利用綠色熒光蛋白(GFP)及其衍生物實現(xiàn)了多種細胞的體內(nèi)活體標記。另一種標記活體PGCs的技術(shù)稱為:RNA定點表達(localized RNA expression,LRE)技術(shù)。該技術(shù)是將GFP融合生殖系特異基因vasa、nanos1 等的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)并人工合成 mRNA,然后注射到早期受精卵中,使GFP在胚胎的PGCs中特異表達[19]。相比于轉(zhuǎn)基因技術(shù),LRE技術(shù)更為簡便,而且周期短、用途廣。該技術(shù)的發(fā)展大大地推進了魚類生殖細胞生物學及繁育技術(shù)的發(fā)展。此外,這種方法也可以用來研究不同物種間3′-UTR的保守性及組織特異性的調(diào)控。研究報道,將來自于斑馬魚的nanos1-3′-UTR(即nanos3-3′-UTR)與GFP融合生成的RNA注射入鰻鱺受精卵中,可以將鰻鱺PGCs標記出來,而且將標記的鰻鱺PGCs移植入斑馬魚胚胎后,鰻鱺PGCs能夠同斑馬魚PGCs一樣向生殖嵴的方向遷移[20]。

本實驗室前期以二倍體鯽魚和鯉魚為親本,通過遠緣雜交方法成功獲得了異源四倍體鯽鯉(allotetraploid carp,4nAT),并進一步以異源四倍體鯽鯉為父本、二倍體鯽魚為母本,通過雜交成功研制出三倍體湘云鯽(triploid crucian carp)。湘云鯽具有不育、生長速度快、抗病能力和抗逆性強等多種優(yōu)良性狀,在全國得到大規(guī)模推廣養(yǎng)殖,產(chǎn)生了良好的社會效應和經(jīng)濟效益[21～23]。更為重要的是,異源四倍體鯽鯉與其二倍體父/母本和三倍體雜交后代組成了一個倍性明確、親緣關(guān)系清晰的多倍體雜交魚研究體系,為開展魚類發(fā)育生物學及基因功能研究、探討自然界魚類種間雜交起源與進化提供了重要的研究平臺。本文利用實驗室特有的實驗魚品系,首次對多倍體魚原始生殖細胞進行標記,并觀察了其遷移途徑,旨在為多倍體魚原始生殖細胞的產(chǎn)生和遷移的研究提供一些基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本文取材的二倍體紅鯽、三倍體湘云鯽及異源四倍體鯽鯉,均來自湖南師范大學省部共建淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室養(yǎng)殖基地。實驗魚養(yǎng)殖條件均為池塘養(yǎng)殖、投喂人工飼料。

1.2 質(zhì)粒提取

本文所用EGFP-zfnanos1-3′-UTR質(zhì)粒由上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院李名友研究員惠贈。質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

質(zhì)粒提取按試劑盒AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)步驟操作:取3～5 mL菌液,室溫下10 000 r/min離心1 min,吸去上清后加250 μL solution I/RNase A重懸菌落,混勻。加入250 μL solutionⅡ,倒置輕混勻,孵育2 min。加入250 μL solutionⅢ,立即倒置混勻,直到生成白色絮狀沉淀。隨后,室溫下13 000 r/min離心10 min。將上清液小心轉(zhuǎn)入HiBind miniprep column(有套管),室溫下10 000 r/min離心1 min。棄廢液,加入500 μL buffer HB,室溫下10 000 r/min離心1 min。棄廢液,空管在室溫下13 000 r/min離心2 min。將柱子轉(zhuǎn)入新 EP 管,加入 30～50 μL elution buffer或3dH2O到膜上,室溫孵育1～2 min后在室溫下13 000 r/min離心1 min。最后,將得到的質(zhì)粒保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 體外轉(zhuǎn)錄

先將EGFP-zfnanos1-3′-UTR質(zhì)粒酶切進行線性化處理,然后用Sp6啟動子體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA)進行體外轉(zhuǎn)錄。反應體系如下:線性化質(zhì)粒DNA 1 μg,2×sp6 NTP cap 10 μL,enzyme 2 μL,RNA-free water加至 18 μL,10×reaction buffer 2 μL。按照以上體系加好樣品,渦旋混勻,37℃水浴反應4 h；加入30 μL RNA-free DEPC water混勻,再加入 30 μL LiCl混勻,-20℃下反應過夜；反應完成后將樣品13 000 g、4℃離心15 min,棄上清液,加75%乙醇洗滌,13 000 g、4℃離心15 min,棄上清；重復洗滌一次(注:75%乙醇需用RNA-free water配制),最后將裝有沉淀的EP管置于超凈工作臺上,室溫晾5 min；待乙醇揮發(fā)完全,加入30 μL RNA-free DEPC water溶解沉淀,取1 μL用分光光度計檢測濃度,剩余的置于-80℃下保存待用。

1.4 顯微注射

首先,將人工授精得到的受精卵均勻地鋪在加入清水的玻璃皿上(密度不宜太大)。待胚胎黏附在玻璃皿上,加入0.25%的胰蛋白酶液消化3 min,而后洗去胰酶,將胚胎置于含有Holtfreter工作液(每升含 3.5 g NaCl、0.05 g KCl、0.025 g NaHCO3)的1.5%瓊脂培養(yǎng)皿中。其次,將要注射的質(zhì)?；騧RNA用DEPC水稀釋到80 ng/μL,置于冰上備用。然后,吸取10 μL質(zhì)?；騧RNA加入顯微注射針(Kwik-Fil TW100-4),注意不要產(chǎn)生氣泡。在顯微鏡下用鑷子輕輕將針尖夾斷,使針尖大小適宜。最后,在顯微注射儀(OLYMPUS SZX12)下將其注入裸卵胚盤內(nèi),整個注射過程在受精卵第一次卵裂開始前完成。

1.5 熒光觀察

將顯微注射后的胚胎置于清水中培養(yǎng)(25±1℃),受精后每隔2 h在熒光顯微鏡下觀察并拍照。所用熒光顯微鏡型號為MZ16F(Leica Microsystems,Inc.,USA)。

1.6 雜交魚的人工繁殖與胚胎培育

分別向雌雄親魚注射催產(chǎn)素。當親魚開始追尾產(chǎn)卵后,分別擠出精子和卵子,混勻后用羽毛輕鋪在盛水的培養(yǎng)皿上,待受精卵黏附在培養(yǎng)皿上后換曝氣水。胚胎每天換水,且需要挑去已死的胚胎。36 h左右胚胎孵化出苗,將魚苗吸出單獨飼養(yǎng),2～3 d仔魚卵黃囊消失,可以游動攝食,此時可投喂草履蟲,三周齡幼魚可投喂豐年蟲。

2 結(jié)果

2.1 二倍體紅鯽原始生殖細胞的標記和遷移

圖1 EGFP-zfnanos1-3′-UTR質(zhì)粒圖譜Fig.1 The plasmid map of EGFP-zfnanos1-3′-UTR

為了研究二倍體紅鯽胚胎中PGCs遷移的正常途徑,我們將 GFP-zfnanos1-3′-UTR mRNA(100 ng/μL)注射到1～2個細胞階段的卵中,實驗重復3次?？偣灿?82個卵子注射了mRNA,受精后24 h進行檢測,結(jié)果顯示:306個胚胎正常發(fā)育,其中158個(51.6%)含有顯示出強GFP表達的細胞(表1)。圖2顯示,紅鯽胚胎發(fā)育到囊胚早期就可以觀察到整個動物極細胞都強烈表達綠色熒光(圖2A,F),但是在動物極和卵裂腔處沒有觀察到PGCs細胞。隨著胚胎發(fā)育,進入原腸晚期后,可以觀察到胚胎一側(cè)細胞中的GFP表達被上調(diào),而其他體細胞的發(fā)育過程中背景GFP表達顯著降低(圖2B,G)。在體節(jié)階段,可明顯觀察到高表達GFP的細胞,這些胚胎中GFP陽性細胞的平均數(shù)量為6～8個,但我們也觀察到存在9～12個的情況(圖2N～Q)。幾乎所有這些細胞都位于從頭部到卵黃塞附近的背軸的側(cè)面,有時在頭部、軀干或腹部區(qū)域也可觀察到少量PGCs(圖2C,H,K)。在心跳期間,PGCs繼續(xù)遷移,定位在軀干側(cè)面的相似區(qū)域周圍,在此期間,一些PGCs聚集成簇(圖2D,I,L)。之后,這些細胞繼續(xù)向生殖嵴遷移。在出膜期,PGCs定位于新形成的消化道的腹側(cè)(圖 2E,J,M)。

2.2 三倍體湘云鯽原始生殖細胞的標記和遷移

圖2 二倍體紅鯽原始生殖細胞的標記和遷移A:囊胚期；B:原腸期；C:體節(jié)期；D:心跳期；E:出膜期；F-J:分別對應A～E的熒光圖；K～M:分別對應H～J中白框的放大圖；N:體節(jié)期；O:圖N中白框放大圖；P:體節(jié)期；Q:圖P中白框放大圖。Fig.2 Localization and migration of PGCs in embryos of red crucian carp during embryonic developmentA:Blastula stage；B:Gastrul stage；C:Somite stage；D:Heartbeat stage；E:High-pec stage；F～J:Fluorescent views of A～E,respectively；K～M:Higher magnification of the areas indicated by the boxes in H～J,respectively；N:Somite stage；O:Higher magnification of the area indicated by the box in N；P:Somite stage；Q:Higher magnification of the area indicated by the box in P.

表1 顯微注射GFP-zfnanos1-3′-UTR mRNA 24 h后原始生殖細胞被標記上綠色熒光的胚胎數(shù)Table 1 Number of embryos with GFP-labeled PGCs at 24 hours post fertilization after GFP-zfnanos1-3′-UTR mRNA injection

為了研究三倍體湘云鯽胚胎中PGCs遷移的正常途徑,我們將GFP-zfnanos1-3′-UTR mRNA(100 ng/μL)注射到1～2個細胞階段的卵中,實驗重復兩次?？偣灿?92個卵子注射了mRNA,受精后24 h進行檢測,結(jié)果顯示:147個胚胎正常發(fā)育,其中67個(45.6%)含有顯示出強GFP表達的細胞(表1)。與二倍體紅鯽胚胎PGCs細胞類似,我們在囊胚早期就可以觀察到整個動物極細胞都強烈表達綠色熒光(圖3A,F),然后GFP表達強度會偏向一側(cè)(圖3B,G)。隨著胚胎發(fā)育,三倍體湘云鯽胚胎中PGCs細胞的遷移也與二倍體紅鯽中的遷移情況類似。在體節(jié)階段,可明顯觀察到高表達GFP的細胞,這些胚胎中GFP陽性細胞的平均數(shù)量為6～8個,但我們觀察到GFP陽性細胞僅位于體內(nèi)的一側(cè),表明這些胚胎中mRNA的分布不均勻(圖3H,K)。在心跳期間,PGCs繼續(xù)遷移,在此期間,一些PGCs也會聚集成簇(圖3I,L)。之后,這些細胞繼續(xù)向生殖嵴遷移。在出膜期,PGCs定位于新形成的消化道的腹側(cè)(圖3E,J,M)。

2.3 四倍體鯽鯉原始生殖細胞的標記和遷移

為了研究四倍體鯽鯉胚胎中PGCs遷移的正常途徑,我們將GFP-zfnanos1-3′-UTR mRNA(100 ng/μL)注射到1～2個細胞階段的卵中,實驗重復兩次?？偣灿?32個卵子注射了mRNA,受精后24 h進行檢測,結(jié)果顯示:150個胚胎正常發(fā)育,其中66個(44%)含有顯示出強GFP表達的細胞(表1)。同樣與二倍體紅鯽胚胎PGCs細胞類似,我們在囊胚早期就可以觀察到整個動物極細胞都強烈表達綠色熒光(圖4A,F),然后GFP表達強度也會偏向一側(cè)(圖4B,G)。隨著胚胎發(fā)育,四倍體鯽鯉胚胎中PGCs細胞的遷移也與二倍體紅鯽中的遷移情況類似。在體節(jié)階段,可明顯觀察到高表達GFP的細胞,這些胚胎中GFP陽性細胞的平均數(shù)量為6～8個(圖4H,K)。在心跳期間,PGCs繼續(xù)遷移,在此期間,一些PGCs也會聚集成簇,但是與二倍體紅鯽胚胎相比,可明顯觀察到PGCs細胞數(shù)量較少(圖4I,L)。之后,這些細胞繼續(xù)向生殖嵴遷移。在出膜期,PGCs定位于新形成的消化道的腹側(cè)(圖4E,J,M)。

圖4 異源四倍體鯽鯉原始生殖細胞的標記和遷移A:囊胚期；B:原腸期；C:體節(jié)期；D:心跳期；E:出膜期；F～J:分別對應A～E的熒光圖；K～M:分別對應H～J中白框的放大圖。Fig.4 Localization and migration of PGCs in embryos of allotetraploid carp hybrids during embryonic developmentA:Blastula stage；B:Gastrul stage；C:Somite stage；D:Heartbeat stage；E:High-pec stage；F～J:Fluorescent views of A～E,respectively；K～M:Higher magnification of the areas indicated by the boxes in H～J,respectively.

3 討論

魚類配子的發(fā)生是從原原始生殖細胞(pPGCs)開始的,進而分化形成原始生殖細胞(PGCs),隨后PGCs遷移穿過各種胚胎組織到達正在形成中的原始生殖腺,繼續(xù)發(fā)育形成生殖干細胞(卵原細胞或精原細胞)。本文利用RNA定點表達技術(shù),建立了多倍體鯽鯉PGCs快速標記方法,通過在受精卵胚胎發(fā)育早期顯微注射斑馬魚GFP-nanos1-3′-UTR mRNA,實現(xiàn)了多倍體鯽鯉PGCs的活體標記和追蹤。

原始生殖細胞具有明顯的組織學特征,與體細胞相比一般個體較大,細胞核大而圓,細胞質(zhì)較少,同時細胞質(zhì)內(nèi)還含有生殖質(zhì)顆粒[24,25]。在胚胎發(fā)育早期,生殖質(zhì)被不對稱分配到一些細胞中,這些細胞最終會發(fā)育形成原始生殖細胞。生殖質(zhì)顆粒成分的聚合需要肌動蛋白和微管蛋白網(wǎng)絡來共同完成[26]。在硬骨魚中,人們可以通過原位雜交或免疫組化的方法檢測到PGCs,但這些方法觀察的對象是固定后的死材料。RNA定點表達技術(shù)的應用,使研究者能在活體中觀察PGCs的動態(tài)情況。目前,已有多個報道通過注射斑馬魚GFP-nanos1-3′-UTR成功標記了胚胎中的PGCs,說明這種機制在硬骨魚類中可能是高度保守的[16,20,27～29]。本文結(jié)果顯示,與其他魚類相比,多倍體魚中PGCs的標記效率相對較低,其中四倍體鯽鯉的熒光標記胚胎比例為44%,三倍體湘云鯽的熒光標記胚胎比例為45.6%。此外,我們觀察到大量只標記到一側(cè)PGCs的現(xiàn)象(圖3H,圖4H),這種現(xiàn)象在青鳉中也有發(fā)現(xiàn),推測可能是因為顯微注射時胚胎發(fā)育已經(jīng)到了二細胞時期,但是具體的原因還需更進一步的研究。

PGCs形成于生殖嵴外,需要經(jīng)過一系列的遷移才能到達生殖嵴。目前,科研人員通過vasa基因原位雜交揭示了數(shù)種魚PGCs的遷移模式,其中最為典型的是模式生物斑馬魚和青鳉。斑馬魚胚胎最初的4個PGCs會依次經(jīng)過6個步驟的遷移,最終到達性腺組織[30]。青鳉PGCs的遷移主要有3個階段[31]。不同魚類PGCs遷移的途徑和機制具有保守性[20]。但也有一些不同之處,主要集中有以下區(qū)別:體節(jié)形成前PGCs的位置；體節(jié)形成早期PGCs的位置；體節(jié)形成中期PGCs遷移的方向；PGCs最終在胚體上的位置。與斑馬魚相比,裸身鰕虎魚的PGCs也會增殖分化為8個細胞,但在隨后的遷移過程中并不形成PGCs簇,而是在體節(jié)發(fā)生早期分散排列在胚體兩側(cè),到體節(jié)晚期時,PGCs漸漸聚合到體軸下部[32]。大菱鲆PGCs的遷移模式與斑馬魚相似,50%外包期,PGCs分布在胚環(huán)中,到體節(jié)時期分兩列排在軀干下方,最終在生殖嵴部位聚集成兩簇[33]。在原腸時期,池沼公魚的PGCs隨著體細胞遷移至胚體的兩側(cè),隨著細胞分裂,PGCs分布到了背部腸系膜處,并且通過背部腸系膜細胞在性腺區(qū)域聚集[34]。本文實驗結(jié)果顯示,多倍體魚PGCs的起源和遷移與斑馬魚類似。囊胚早期就可以觀察到整個動物極細胞都強烈表達綠色熒光,可是在胚環(huán)中沒有觀察到明顯的PGCs。在體節(jié)期可明顯觀察到高表達GFP的細胞,這些胚胎中GFP陽性細胞的平均數(shù)量為6～8個。在隨后的遷移中,一些PGCs會聚集成簇。之后,這些細胞繼續(xù)向生殖嵴遷移,在出膜期,PGCs定位于新形成的消化道的腹側(cè)。

本文實驗結(jié)果表明,與二倍體紅鯽相比,三倍體湘云鯽和四倍體鯽鯉的PGCs細胞數(shù)量明顯偏少。我們在生產(chǎn)實際中觀察到,四倍體鯽鯉的繁殖能力比二倍體紅鯽的繁殖能力有所下降,而三倍體湘云鯽是不育的,這是否與其原始生殖細胞的數(shù)量或遷移出現(xiàn)異常相關(guān)？多倍體鯽鯉育性與PGCs的相關(guān)性是一個值得研究的方向。