劉麗麗 朱華 閆艷春 王曉雯 張蓉 朱建亞

（1. 北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所 漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081）

作為變溫動(dòng)物，魚(yú)類廣泛棲息于不同的溫度環(huán)境中。廣溫性魚(yú)類具有較強(qiáng)的溫度適應(yīng)能力，當(dāng)棲息在低溫時(shí)，能通過(guò)調(diào)節(jié)不同代謝途徑的酶濃度、轉(zhuǎn)換代謝途徑和改變其組織細(xì)胞的分子組成，使代謝和生理功能逐漸適應(yīng)低溫；狹溫性魚(yú)類只能適應(yīng)很窄的溫度范圍，溫度變化，特別是低溫會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類免疫力下降，容易生病甚至死亡，這是魚(yú)類長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境和進(jìn)化的結(jié)果。由于魚(yú)類重要的生態(tài)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，已將組學(xué)技術(shù)大量用于研究溫度等環(huán)境因素對(duì)魚(yú)類基因表達(dá)的作用，以解析魚(yú)類對(duì)溫度的適應(yīng)機(jī)制［1-3］。本文將回顧魚(yú)類適應(yīng)長(zhǎng)期低溫環(huán)境和響應(yīng)短期低溫脅迫的組學(xué)研究報(bào)道，總結(jié)魚(yú)類低溫耐受的遺傳進(jìn)化基礎(chǔ)和不同魚(yú)類在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異，根據(jù)功能對(duì)魚(yú)類低溫耐受相關(guān)基因進(jìn)行分類討論，并預(yù)測(cè)本領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，以期為后續(xù)研究提供思路。

1 魚(yú)類低溫耐受的分子機(jī)制

1.1 魚(yú)類低溫耐受的遺傳進(jìn)化基礎(chǔ)

魚(yú)類適應(yīng)寒冷環(huán)境的一種主要手段是在進(jìn)化過(guò)程中獲得功能基因。棲息于南極圈和北極圈的極地魚(yú)類能夠長(zhǎng)期在零下低溫環(huán)境中生存，也稱為抗凍魚(yú)，為研究魚(yú)類耐受低溫的遺傳進(jìn)化機(jī)制提供了絕佳的生物材料。研究發(fā)現(xiàn)，抗凍魚(yú)在進(jìn)化過(guò)程中，通過(guò)基因重組和突變獲得了一些關(guān)鍵功能基因，如特異性地獲得抗凍糖蛋白（Antifreeze glycoprotein，AFGP）。AFGP能夠結(jié)合并抑制冰晶生長(zhǎng)，保護(hù)細(xì)胞和血液在冰點(diǎn)下不結(jié)冰，支持低于冰點(diǎn)溫度的正常代謝［1］，保證抗凍魚(yú)在極地環(huán)境正常生存；不同抗凍魚(yú)AFGP蛋白在分子組成和結(jié)構(gòu)上很相似，但其編碼基因的來(lái)源完全不同，南極美露鱈（Dissostichus mawsoni）afgp基因起源于胰蛋白酶原基因，而北極鱈魚(yú)（Boreogadus saida）afgp基因起源于胰蛋白酶原基因以外的基因位點(diǎn)［2］。

抗凍魚(yú)在進(jìn)化過(guò)程中同時(shí)喪失了一些基因的功能，如喪失向線粒體輸送氧氣的血紅蛋白基因［3］。血紅蛋白基因在抗凍魚(yú)基因組中發(fā)生了普遍性的缺失：淵龍?chǎng)尶疲˙athydraconidae）等南極魚(yú)的血紅素蛋白基因表達(dá)水平非常低；鱷冰魚(yú)科（Channichthyidae）中至少16種冰魚(yú)完全缺失血紅素蛋白基因，冰魚(yú)β球蛋白基因在進(jìn)化史上兩次發(fā)生基因重組，這兩次突變都導(dǎo)致了該基因位點(diǎn)的失活［4］。

魚(yú)類為了適應(yīng)寒冷環(huán)境還發(fā)生了大規(guī)模的基因擴(kuò)增。寒冷環(huán)境下LINE基因家族在多種南極魚(yú)中都發(fā)生了大規(guī)模擴(kuò)增［5］；冰魚(yú)中與線粒體生物合成和有氧呼吸相關(guān)的基因重復(fù)顯著增多，從而提高低溫下氧氣的運(yùn)輸和利用效率［6］。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，南極美露鱈（Dissostichus mawsoni）有177個(gè)非冗余蛋白家族的豐度高于熱帶魚(yú)對(duì)應(yīng)蛋白豐度，使機(jī)體適應(yīng)極端寒冷環(huán)境。這177個(gè)蛋白家族主要包括蛋白質(zhì)生物合成、蛋白折疊和降解、脂質(zhì)代謝、抗氧化、抗凋亡、先天免疫及絨毛膜形成等。比較基因組研究發(fā)現(xiàn)上述很多基因的高表達(dá)是通過(guò)大規(guī)模的基因擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)的，極穩(wěn)定的低溫環(huán)境所導(dǎo)致的低代謝并沒(méi)有使魚(yú)類基因組中基因的含量降低，相反是普遍擴(kuò)增，特別是逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)擴(kuò)增了近300倍。這些研究表明大規(guī)?；驍U(kuò)增可能是魚(yú)類適應(yīng)永恒低溫環(huán)境的一個(gè)重要和普遍的進(jìn)化機(jī)制［5］。

1.2 魚(yú)類低溫耐受的遺傳信息表達(dá)機(jī)制

1.2.1 低溫下轉(zhuǎn)錄表達(dá)的種間、種內(nèi)差異 2004年，Gracey等［7］以鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）為模型第一次在轉(zhuǎn)錄組水平上開(kāi)展魚(yú)類低溫脅迫研究，將鯉魚(yú)在30、23、17和10℃分別暴露22 d后發(fā)現(xiàn)，在260個(gè)上調(diào)表達(dá)基因中，有27個(gè)基因的直系同源基因在酵母低溫脅迫時(shí)也上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明從單細(xì)胞到多細(xì)胞生物的低溫耐受機(jī)制存在保守性。對(duì)革首南極魚(yú)（Notothenia corriceps）、頭帶冰魚(yú)（Chaenocephalus Aceratus）和側(cè)紋南極魚(yú)（Pleuragramma antarcticum）腦組織和肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，南極魚(yú)類可能普遍富含蛋白質(zhì)泛素降解途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本［8］。短頭壯綿鳚（Pachycara brachycephalum）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在不同溫度下的差異表達(dá)基因主要集中在信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)錄后修飾、細(xì)胞骨架重建、代謝轉(zhuǎn)換及轉(zhuǎn)錄和翻譯等細(xì)胞過(guò)程；低溫下抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄本水平也上調(diào)表達(dá)，以應(yīng)對(duì)低溫導(dǎo)致的氧化應(yīng)激［9］。與常溫（28℃）相比，低水溫（16℃）處理下斑馬魚(yú)（Danio rerio）幼魚(yú)轉(zhuǎn)錄組RNA 加工、細(xì)胞金屬離子穩(wěn)態(tài)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因也出現(xiàn)了顯著上調(diào)表達(dá)［10］。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，生活在不同溫度下的魚(yú)類應(yīng)對(duì)低溫脅迫的信號(hào)通路存在相似性。

然而不同魚(yú)類適應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制依然存在明顯的種間差異。生活在極地環(huán)境的南極美露鱈轉(zhuǎn)錄組表現(xiàn)出明顯的低溫適應(yīng)性，其編碼蛋白質(zhì)合成、折疊和降解的基因、與脂質(zhì)代謝、抗氧化、抗凋亡和免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平都顯著高于熱帶模式生物斑馬魚(yú)（Danio rerio）［5］。另一個(gè)例子是PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路，該通路在魚(yú)類低溫脅迫和適應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，其相關(guān)基因在草魚(yú)、斑馬魚(yú)和羅非魚(yú)低溫脅迫中都表現(xiàn)出差異表達(dá)，但是低溫下AKT和GSK-3β蛋白在3種魚(yú)間呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式和表達(dá)水平的變化［11］。即使同一種魚(yú)，不同品系之間也存在耐寒性能的差異，以紅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）為例［12］，關(guān)島品系的平均半數(shù)致死溫度（LT50）為7.46℃，佛羅里達(dá)品系LT50為6.77℃，珍珠白品系LT50最低，為6.68℃；3個(gè)不同品系紅羅非魚(yú)群體開(kāi)始出現(xiàn)死亡時(shí)最低死亡溫度由高到低依次是關(guān)島品系＞佛羅里達(dá)品系＞珍珠白品系，暗示不同品系之間紅羅非魚(yú)的低溫耐受機(jī)制存在差異。即使同一品種魚(yú)類，胚胎發(fā)育階段的環(huán)境溫度不同，長(zhǎng)大后適應(yīng)溫度的能力和范圍也不同，低溫脅迫時(shí)也表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄組差異［13］。

1.2.2 低溫下轉(zhuǎn)錄表達(dá)的組織特異性 不同組織的低溫耐受具有轉(zhuǎn)錄組水平的差異性。骨骼肌組織中，肌節(jié)結(jié)構(gòu)和肌肉收縮相關(guān)基因存在共表達(dá)，表明肌肉組織在應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)可能存在結(jié)構(gòu)重建，而心肌組織則沒(méi)有這種現(xiàn)象；糖酵解基因在腦組織上調(diào)表達(dá)而骨骼肌組織中普遍下調(diào)［7］。大黃魚(yú)肝臟轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)與氨基酸代謝、脂類與固醇代謝、碳水化合物代謝、氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)等能量和代謝通路相關(guān)基因在低溫和高溫脅迫下顯著差異表達(dá)［14］。金頭鯛低溫（6.8℃）處理3周后，肝臟轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)基因富集到脂類代謝、能量代謝和蛋白質(zhì)變性等通路。此外，還發(fā)現(xiàn)未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)的發(fā)揮作用［15］。低溫下，虹鱒魚(yú)（Oncorhynchus mykiss，TCO品系）鰓組織發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)失活、冷誘導(dǎo)性細(xì)胞死亡和離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)［16］。而伯氏肩孔南極魚(yú)（Trematomus bernacchii）頭腎組織轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因主要集中于免疫應(yīng)答通路［17］。由于各組織結(jié)構(gòu)生理功能的差異，應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)的生理生化反應(yīng)各不相同，所以在耐受低溫時(shí)表現(xiàn)出組織特異性轉(zhuǎn)錄表達(dá)。最近，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始關(guān)注組織特異性轉(zhuǎn)錄組［18-20］。

1.2.3 低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò) Hung等［21］通過(guò)RNA-seq技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，斑馬魚(yú)幼魚(yú)（96 hpf）差異表達(dá)miRNA和差異表達(dá)mRNA富集到相同的信號(hào)通路，主要包括黑色素原生成、GnRH、生物鐘通路等。其中生物鐘通路相關(guān)基因per2有助于斑馬魚(yú)幼魚(yú)在冷刺激后恢復(fù)正常，而在低溫脅迫下dre-mir-29bmiRNA能夠調(diào)控per3的表達(dá)，說(shuō)明miRNA通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)模式使斑馬魚(yú)幼魚(yú)適應(yīng)低溫脅迫。低溫脅迫下，斑馬魚(yú)剪接體編碼基因也出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)［22］。

羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)的適宜生存溫度都是28℃，但是其低溫適應(yīng)調(diào)控機(jī)制具有顯著的差異。在同一低溫環(huán)境處理下，盡管兩種魚(yú)類中都發(fā)現(xiàn)Fox信號(hào)參與調(diào)控的代謝與凋亡通路，但是斑馬魚(yú)鰓細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的時(shí)間更晚、程度更溫和。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在兩種魚(yú)類中參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因不同，同源基因的表達(dá)模式不同，參與調(diào)控凋亡途徑的順式和反式調(diào)控因子也不同［23］。

順式作用元件AGMAACA能夠與Bcl2作用因子結(jié)合，SAGTTC是AP-1的結(jié)合位點(diǎn)，反式作用因子結(jié)合到基因上游的順式作用元件結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在熱帶魚(yú)類羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)基因組中分別鑒定到47和119個(gè)上游包含這兩個(gè)結(jié)合元件的基因；而大西洋鱈魚(yú)、鯉魚(yú)、河豚等亞北極圈和溫帶的魚(yú)類基因組中，含有這兩個(gè)結(jié)合元件的基因數(shù)量較少［24］。表明順式作用元件AGMAACA和SAGTTC可能參與熱帶魚(yú)類應(yīng)對(duì)低溫脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

長(zhǎng)期低溫脅迫使魚(yú)類在表觀遺傳水平上產(chǎn)生適應(yīng)性。經(jīng)過(guò)連續(xù)多代的低溫脅迫可導(dǎo)致尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）DNA甲基化水平發(fā)生改變，發(fā)生去甲基化反應(yīng)，基因組甲基化程度降低，說(shuō)明DNA甲基化與羅非魚(yú)抗寒性反應(yīng)密切相關(guān)［25］。當(dāng)前，魚(yú)類如何基于表觀遺傳學(xué)修飾適應(yīng)和對(duì)抗低溫環(huán)境，尚未展開(kāi)廣泛研究。

2 魚(yú)類低溫耐受相關(guān)功能基因

2.1 魚(yú)類抗凍（糖）蛋白基因

在極地魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白（Antifreeze protein，AFP）和AFGP是研究最早、最深入的兩個(gè)抗凍蛋白。最早發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白包括來(lái)自美洲擬鰈（Pseudopleuronectes americanus）的Ⅰ型AFP、來(lái)自美洲大綿鳚（Macrozoarces americanus）的Ⅲ型AFP和來(lái)自大西洋鱈魚(yú)的AFGP等［26］。AF（G）P對(duì)冰晶具有較高的親和力，能夠附著到冰晶表面，阻止冰晶長(zhǎng)大［27］，因此表達(dá)AF（G）P的魚(yú)類能夠在低于血漿冰點(diǎn)的溫度下生存，而血漿不凝固，達(dá)到抗凍效果。

鑒于AF（G）P蛋白良好的抗凍能力，研究人員通過(guò)各種手段將AF（G）P蛋白或基因轉(zhuǎn)到魚(yú)類及其他物種中，希望提高受體的耐寒性能。早在1999年，Hobbs［28］將AF（G）P蛋白注射到金魚(yú)（Carassius auratus L.）中，發(fā)現(xiàn)注射后金魚(yú)對(duì)低溫的耐受時(shí)間和耐受的溫度閾值沒(méi)有明顯變化。大西洋鮭魚(yú)（Salmo salar）的最佳生存溫度是17℃，F(xiàn)letcher等［29］將afp基因轉(zhuǎn)到大西洋鮭魚(yú)中，并穩(wěn)定遺傳5代，在后代基因組DNA和血液中均能檢測(cè)到afp，但是其表達(dá)水平十分低。將afp基因整合到大西洋鮭魚(yú)基因組上，盡管在不同組織中都檢測(cè)到afp轉(zhuǎn)錄本或者前體蛋白的表達(dá)，但是轉(zhuǎn)基因大西洋鮭的耐低溫性能沒(méi)有明顯改善［30-32］。而B(niǎo)egis等［33］將afp基因整合到小鼠基因組，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的睪丸和卵巢組織在4℃的抗凍能力明顯高于普通小鼠。這些研究說(shuō)明，由于AF（G）P的冰晶吸附特性，其抗凍能力在接近冰點(diǎn)溫度下發(fā)揮作用，當(dāng)溫度遠(yuǎn)高于冰點(diǎn)溫度（如17℃）時(shí)，AF（G）P沒(méi)有顯著的耐寒性能。

2.2 魚(yú)類分子伴侶基因

許多研究認(rèn)為熱激蛋白HSP蛋白家族在魚(yú)類的耐低溫機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HSP70是典型的誘導(dǎo)型表達(dá)蛋白，然而Place等［34］發(fā)現(xiàn)在伯氏肩孔南極魚(yú)、博氏南冰鰧（Pagothenia borchgrevinki）、南極綿鳚（Lycodichthys dearborni）等南極魚(yú)中，HSP70基因普遍表現(xiàn)為高水平的組成型表達(dá)，表明HSP70在魚(yú)類應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期低溫環(huán)境中發(fā)揮重要作用。三刺魚(yú)（Gasterosteus aculeatus）在8℃處理9周后，其肝臟和胸肌中HSP70轉(zhuǎn)錄本水平和蛋白質(zhì)豐度比20℃對(duì)照組顯著上調(diào)［35］；達(dá)氏鱘（Huso dauricus）的適宜生存溫度為16℃，將溫度分別調(diào)節(jié)至25、10和4℃，發(fā)現(xiàn)4℃時(shí)HSP70轉(zhuǎn)錄本水平最高，而在25℃時(shí)很少表達(dá)，表明HSP70和HSP90對(duì)冷應(yīng)激更敏感［36］；將南亞野鯪（Labeo rohita）HSP70開(kāi)放閱讀框的cDNA插入表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)HSP70能夠增強(qiáng)大腸桿菌、小鼠骨髓瘤細(xì)胞和魚(yú)肝癌細(xì)胞應(yīng)對(duì)低溫脅迫的能力［37］，表明魚(yú)類HSP70具有耐低溫的潛能。

HSP60蛋白家族中有一類伴侶蛋白CCT（Chaperonins containing TCPl），真核生物CCT蛋白是雙層環(huán)構(gòu)成的柱狀復(fù)合體，每層環(huán)包含8個(gè)序列相關(guān)的TCP1亞基，分別由8個(gè)基因編碼。CCT包含數(shù)個(gè)ATP結(jié)合基序，能夠結(jié)合并水解ATP產(chǎn)生能量，幫助蛋白組裝、折疊和異位［38］，在機(jī)體應(yīng)對(duì)逆境時(shí)參與細(xì)胞微穩(wěn)態(tài)，在保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對(duì)損傷和其他脅迫中發(fā)揮作用［39］。研究已經(jīng)證實(shí)，TCP1與機(jī)體低溫耐受能力相關(guān)。當(dāng)溫度從22℃逐漸下降到12℃，尼羅羅非魚(yú)的tcp1-beata和tcp1- eta基因表達(dá)水平分別上調(diào)為對(duì)照組的12.2和10.7倍［40］，馬來(lái)西亞紅羅非魚(yú)tcp1-beata和tcp1- eta基因在低溫下表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)［41］。

冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（Cold-inducible RNA-bingding protein，CIRP）是亞低溫環(huán)境中最早的應(yīng)激產(chǎn)物之一［42］，參與機(jī)體抵御外界低溫的過(guò)程，提高mRNA的穩(wěn)定性，介導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程［43］，保護(hù)機(jī)體免受低溫脅迫。目前已克隆了大西洋鮭、斑馬魚(yú)、虹鱒及牙鲆（Paralichthys olivaceus）等魚(yú)類cirp基因的編碼序列［44-45］，序列比對(duì)分析顯示與哺乳類、兩棲類的cirp基因有較高的保守性，可能參與低溫、滲透壓等脅迫下的應(yīng)激調(diào)節(jié)［46］。

2.3 魚(yú)類能量/物質(zhì)代謝酶基因

低溫下細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，導(dǎo)致細(xì)胞功能損傷，因此造成各種應(yīng)激性生理反應(yīng)。硬脂酰輔酶脫氫 酶 1（Stearoyl-Co enzyme A desaturase 1，SCD1）能夠在低溫下參與脂肪酸代謝，調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性［47］，大量研究發(fā)現(xiàn)SCD1在魚(yú)類應(yīng)對(duì)低溫脅迫中具有關(guān)鍵作用：草魚(yú)（Grass carp）肝臟中scd1表達(dá)水平在15℃處理21 d后開(kāi)始上升［48］；尼羅羅非魚(yú)冷誘導(dǎo)7 d后scd1 mRNA水平上升了16倍［49］；鯉魚(yú)從30℃逐漸降到10℃后，SCD1水平上升了8-10倍［50］；大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）最適生長(zhǎng)溫度為15℃，當(dāng)溫度下降至7℃時(shí)，肝臟和大腦中SCD1含量顯著上升［51］。SCD1對(duì)脂肪酸（16∶0和18∶0）有強(qiáng)烈的去飽和作用［52］，低溫下活性SCD1表達(dá)水平上升，不飽和脂肪酸比例增加，細(xì)胞膜保持一定的流動(dòng)性，從而使魚(yú)類低溫耐受能力增強(qiáng)。

魚(yú)類體內(nèi)其他一些能量和物質(zhì)的代謝酶也參與應(yīng)對(duì)低溫脅迫。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，南極美露鱈液泡型ATP酶C亞基編碼基因（atp6v0c）過(guò)表達(dá)能夠顯著降低低溫脅迫條件下HeLa細(xì)胞死亡率［53］，說(shuō)明鱗頭犬牙南極魚(yú)atp6v0c可能具有耐低溫的潛能。谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶M（Glutathione S-transferases M，GSTM）能夠清除脂類自由基，抑制過(guò)氧化反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明低溫下斑馬魚(yú)gstm轉(zhuǎn)錄本水平上調(diào)［54］，分析斑馬魚(yú)gstm的單核苷酸多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)gstm第1個(gè)內(nèi)含子的基因型與斑馬魚(yú)低溫耐受性顯著相關(guān)［55］，說(shuō)明gstm可能是魚(yú)類低溫耐受相關(guān)功能基因。

2.4 魚(yú)類膜通道蛋白基因

低溫脅迫下，細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，膜通道蛋白運(yùn)輸能力減弱，細(xì)胞內(nèi)外能量和物質(zhì)運(yùn)輸受阻［56］。水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是一類疏水性膜通道蛋白，介導(dǎo)自由水分子的被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，參與小分子氣體交換和運(yùn)輸［57］，對(duì)保持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡起著重要的作用［58］。朱華平等［59］以尼羅羅非魚(yú)耐寒品系為材料，克隆分析水通道蛋白基因（aqp1）的cDNA序列發(fā)現(xiàn)，aqp1表達(dá)水平能被低溫脅迫顯著抑制，而且表達(dá)量在耐寒品系肌肉組織和對(duì)照組中差異顯著，表明aqp1 基因在羅非魚(yú)低溫適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

當(dāng)前，盡管在魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)了一些與低溫耐受相關(guān)的基因，但是這些基因在不同物種/組織間的特異性魚(yú)低溫脅迫下的特征表達(dá)譜尚不完善，其在低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制中的作用尚不明確，挖掘魚(yú)類低溫耐受相關(guān)功能基因及其應(yīng)用，還需要更多研究。

3 未來(lái)研究熱點(diǎn)

低溫耐受分子機(jī)制與功能基因挖掘。受益于高通量測(cè)序技術(shù)，魚(yú)類低溫耐受的分子機(jī)制研究發(fā)展勢(shì)頭良好，然而由于魚(yú)類種群龐大、生存地域廣泛、溫度適應(yīng)性差異巨大，不同品種耐受低溫的能力和信號(hào)通路各不相同［23］，全面揭示魚(yú)類低溫耐受的分子機(jī)制，還需要大量基礎(chǔ)性研究工作。與此同時(shí)，低溫耐受功能蛋白在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品加工和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景不可估量，然而目前僅AF（G）P研究較為深入；魚(yú)類低溫耐受功能基因挖掘和應(yīng)用研究將成為未來(lái)研究熱點(diǎn)之一。

基因編輯分子育種。將低溫耐受相關(guān)基因引入受體生物基因組，可以改善轉(zhuǎn)基因生物的耐寒抗凍能力，然而轉(zhuǎn)外源基因的魚(yú)類在公眾認(rèn)可度和環(huán)境釋放保護(hù)等方面還有很長(zhǎng)的路要走［60］。依賴于最新的基因編輯技術(shù)，對(duì)魚(yú)類基因組內(nèi)源性基因堿基序列進(jìn)行編輯，不引入可遺傳外源基因的技術(shù)手段，可能為魚(yú)類耐低溫品系的分子育種提供新的思路。

低溫耐受功能蛋白的人工合成和結(jié)構(gòu)模擬。由于獨(dú)特的結(jié)合冰晶的能力，AF（G）P在食品冷凍、水產(chǎn)品的低溫存儲(chǔ)［61］和器官、細(xì)胞的醫(yī)用冷存［33］等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。目前AFP可通過(guò)重組蛋白產(chǎn)生，而AFGP尚只能通過(guò)人工合成獲得少量純蛋白，蛋白結(jié)構(gòu)模擬與人工合成研究將成為AF（G）P大規(guī)模應(yīng)用的限速步驟［62］。

相關(guān)功能蛋白作為食品/飼料添加劑。將AFP蛋白作為飼料添加劑喂食羅非魚(yú)（Oreochromis mossambicus Peters） 和 虱 目 魚(yú)（Chanos chanos Forsskal）幼魚(yú)，能夠在一定程度上提高幼魚(yú)在低溫下的存活率［63］；而以添加南極美露鱈鈣調(diào)蛋白（Dm-CaM）的商品飼料喂食點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）6周后，急性低溫脅迫發(fā)現(xiàn)其免疫能力沒(méi)有明顯的改善［64］。低溫耐受相關(guān)功能蛋白作為添加劑的應(yīng)用具有不穩(wěn)定性，可能是由于功能蛋白必須定位在細(xì)胞膜等靶標(biāo)位點(diǎn)才具有活性作用，而蛋白添加劑在體內(nèi)被消化降解或者排出體外，不能以活性形式達(dá)到靶標(biāo)位點(diǎn)。因此，小分子功能肽和人工修飾的靶向蛋白將促進(jìn)低溫耐受功能蛋白作為飼料添加劑的應(yīng)用。