劉秀峰 袁文婭 孫振宇 梁丹 時(shí)曉偉

（1. 天津市農(nóng)作物研究所，天津 300381；2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070）

植物與病原菌共同進(jìn)化過程中發(fā)展出不同層次的免疫防衛(wèi)體系。首先，植物細(xì)胞的模式識(shí)別受體（Pattern-recognition receptors，PRRs）識(shí)別病原菌相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。PAMPs是病原微生物表面共有的一些高度保守的分子，這些分子不是病原菌特有的，而是廣泛存在于微生物中，對(duì)維持微生物的基本生物學(xué)特征十分重要。真菌PAMPs包括麥角甾醇、多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶、木聚糖酶以及細(xì)胞壁衍生物葡聚糖和幾丁質(zhì)等。PRRs可以識(shí)別一種或多種PAMPs并誘導(dǎo)植物產(chǎn)生PAMPs觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI），如產(chǎn)生活性氧、分泌蛋白酶抑制劑、幾丁質(zhì)酶及葡聚糖酶等。病原菌為抑制寄主植物的PTI防衛(wèi)反應(yīng)，分泌多種效應(yīng)子（Effectors）調(diào)節(jié)和操縱寄主的各種細(xì)胞功能，逃避寄主的識(shí)別以實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主植物的侵染。寄主植物進(jìn)化出免疫受體可以特異性識(shí)別這些效應(yīng)子，并引發(fā)寄主植物產(chǎn)生效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（Effectortriggered immunity，ETI），使寄主植物表現(xiàn)出抗性。在這種情況下，寄主植物的免疫受體被稱為抗性（R）蛋白，被識(shí)別的效應(yīng)子充當(dāng)了誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)反應(yīng)的信號(hào)，這樣的效應(yīng)子蛋白曾被稱為無毒基因（Avr）蛋白。病原菌則通過拋棄被識(shí)別的效應(yīng)子或者突變出新的效應(yīng)子來避免寄主植物的ETI識(shí)別，相應(yīng)的，寄主植物將共進(jìn)化出新的R蛋白再次觸發(fā)免疫反應(yīng)。如此反復(fù)，植物-病原菌間形成的競(jìng)爭(zhēng)循環(huán)曾被形容為“Z字形模式”［1-2］，這種競(jìng)爭(zhēng)性進(jìn)化也驅(qū)使植物-病原菌互作的基因序列頻繁發(fā)生例如單核苷酸多態(tài)性（Single-nucleotide polymorphisms，SNPs）、插入、缺失等變化，使這些基因呈現(xiàn)高度的多態(tài)性［3-4］。從植物病原菌角度觀察，有利于提高病原菌適合度、定殖能力及傳播能力的效應(yīng)子可能是基因組中進(jìn)化最快的［5］。因此，效應(yīng)子可以作為植物病害防治的重要靶標(biāo)。

分析多種植物病原真菌不同侵染階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，病原真菌分泌效應(yīng)子類型與其寄生方式密切相關(guān)，腐生病原真菌以分泌細(xì)胞外溶解酶類為主，活體寄生病原真菌分泌的溶解酶類表達(dá)量較低，而調(diào)節(jié)寄主細(xì)胞各種代謝的預(yù)測(cè)效應(yīng)子表達(dá)量很高。條形柄銹菌小麥?；停≒uccinia striiformisf.sp.tritici，Pst）真菌作為活體寄生菌，由其引起的小麥條銹病爆發(fā)性強(qiáng)、發(fā)生范圍廣，在中國(guó)曾發(fā)生多次大流行，危害嚴(yán)重［6］。目前中國(guó)90%以上的小麥生產(chǎn)品種因Pst小種變異失去抗銹性，2009年分離到的V26新菌系對(duì)貴農(nóng)22、含Yr10/24/26/抗銹基因的品種以及數(shù)十個(gè)小麥新品種均具有致病性，已引起相關(guān)部門重視［7］。小麥條銹病也是世界性的禾谷類作物重要病害之一，Pst致病性變異頻繁，新致病性小種的出現(xiàn)和發(fā)展是導(dǎo)致小麥品種抗銹性“喪失”，造成小麥條銹病在各洲和洲際間傳播的重要原因［8-9］。小麥品種在不斷更替，能克服其抗性的條銹菌新小種也在不斷的產(chǎn)生和發(fā)展，Derevnina等［10］稱小麥條銹菌為“never sleep”。根據(jù)研究結(jié)果推斷Pst毒性變異迅速與其含有豐富的效應(yīng)子有關(guān)［11］，分析Pst基因組序列也發(fā)現(xiàn)了大量的預(yù)測(cè)效應(yīng)子。例如，美國(guó)小麥條銹菌分離物PST130含有1 088個(gè)預(yù)測(cè)效應(yīng)子［12］，重測(cè)序4個(gè)Pst小種后將預(yù)測(cè)效應(yīng)子數(shù)量提高到2 999個(gè)［13］，中國(guó)小麥條銹菌小種CY32含有2 092個(gè)預(yù)測(cè)效應(yīng)子［14］。Pst含有預(yù)測(cè)效應(yīng)子的數(shù)量即使與小麥稈銹菌P. graminisf. sp.tritici（1 106 個(gè)）［15］和小麥葉銹菌P. triticina（1 358 個(gè)）［16］比較，數(shù)量也是極高的。顯然，深入研究Pst效應(yīng)子在寄主細(xì)胞中的作用靶標(biāo)及其功能具有重要意義。

目前對(duì)細(xì)菌性植物病原菌和卵菌的效應(yīng)子功能研究較為深入［17-19］，活體寄生菌中玉米瘤黑粉菌Ustilago maydis部分預(yù)測(cè)效應(yīng)子功能通過基因缺失和功能互補(bǔ)等方法得到確認(rèn)［20］。小麥條銹菌由于缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，效應(yīng)子研究尚處于起始階段［21］，預(yù)測(cè)的兩千多個(gè)效應(yīng)子僅有少量經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí)其生理功能，這些效應(yīng)子可以靶定在寄主各種亞細(xì)胞成分，有的被證實(shí)與Pst致病性直接相關(guān)。本文綜述了效應(yīng)子的特征、分類、靶標(biāo)及Pst效應(yīng)子研究的現(xiàn)狀，并對(duì)Pst效應(yīng)子研究中值得關(guān)注的問題及未來的研究方向進(jìn)行了探討。

1 效應(yīng)子及其定義

效應(yīng)子最初是借鑒醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)術(shù)語用于研究細(xì)菌性植物病原菌，隨后被用于植物病原真菌的研究［22］。大約在2000年前后，寄主植物-病原微生物互作研究中開始廣泛使用“效應(yīng)子”一詞［23］。相對(duì)于帶有傾向性的“無毒基因”、“激發(fā)子”等術(shù)語，效應(yīng)子這一中性術(shù)語不容易產(chǎn)生歧義。某病原菌分泌的分子抑制了寄主的防衛(wèi)反應(yīng)并使寄主植物感病，則該分子被稱為“毒性基因”。當(dāng)寄主植物進(jìn)化出受體可以特異性識(shí)別該病原菌的同一分子從而產(chǎn)生抗病反應(yīng)，則該分子被視為“無毒基因”。這種病原菌致病性的變化是非常普遍的現(xiàn)象，病原菌的某個(gè)分子可能既是某一寄主的“毒性基因”又是另一寄主的“無毒基因”，甚至在同一寄主的不同品種間表現(xiàn)出不同致病型?？梢?，病原菌的某一分子是“無毒基因”或“毒性基因”主要與寄主植物對(duì)病原菌表現(xiàn)為抗病或感病有關(guān)，受寄主基因型影響，因此“無毒基因”等術(shù)語有其局限性［5］。

效應(yīng)子的范疇隨著對(duì)致病性的分子機(jī)制逐漸深入理解而持續(xù)拓展。起初植物細(xì)菌學(xué)家把效應(yīng)子等同于原核細(xì)菌性病原通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）直接注入到植物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。隨后發(fā)現(xiàn)病原菌可通過不同機(jī)制將多種特定分子轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主細(xì)胞，效應(yīng)子涵蓋范圍再一次被拓寬。目前，效應(yīng)子廣義上包括諸如蛋白質(zhì)、糖類、次級(jí)代謝產(chǎn)物等可能參與侵染過程的所有分子［24］。植物病理學(xué)家傾向于把效應(yīng)子定義為“與植物相關(guān)的微生物分泌的可以改變寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的分子”［23］。這一定義在效應(yīng)子功能僅有少量信息可知時(shí)尤其符合實(shí)際。例如，已知病原菌某分子可以激發(fā)寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)，則該分子可以被稱作“效應(yīng)子”，一旦了解更多該分子的功能，往往用描述其專化活性的術(shù)語（例如，蛋白酶抑制劑）替代“效應(yīng)子”［5］。

2 植物病原真菌效應(yīng)子的特征及分類

植物病原真菌效應(yīng)子與病原細(xì)菌和卵菌的效應(yīng)子不同，其效應(yīng)子沒有類似RXLR的保守基序，難以在全基因組序列中直接分辨效應(yīng)子基因。因此人們利用已知效應(yīng)子特征制定出一些指標(biāo)對(duì)可能含效應(yīng)子的基因進(jìn)行分類。研究發(fā)現(xiàn)植物病原真菌分泌效應(yīng)子后，需要將效應(yīng)子轉(zhuǎn)運(yùn)到準(zhǔn)確的寄主亞細(xì)胞組分才能發(fā)揮其功能，一個(gè)主要特征是效應(yīng)子N末端含有約15-30個(gè)疏水性氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，可以將效應(yīng)子引導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)到目的靶標(biāo)。因此人們將是否具有信號(hào)肽作為預(yù)測(cè)效應(yīng)子的一個(gè)指標(biāo)［25］。Saunders等［26］綜合已知效應(yīng)子特征后提煉出一些指標(biāo)并據(jù)此預(yù)測(cè)效應(yīng)子，這些指標(biāo)包括：具有信號(hào)肽、由可以原位誘導(dǎo)表達(dá)的基因編碼、與吸器蛋白具有相似性、不高于300個(gè)氨基酸、富含半胱氨酸、無跨膜區(qū)域、具有已知的效應(yīng)子基序或細(xì)胞核定位信號(hào)、由較長(zhǎng)的基因間區(qū)域編碼、具有內(nèi)部重復(fù)序列、與已知蛋白功能無同源性等。Saunders等和Nemri等［27］利用該方法均取得良好效果。另外，在一些如吸器等專化的侵染結(jié)構(gòu)中高表達(dá)的基因也被作為候選效應(yīng)子之列［15］。利用這些特征可以在基因組中尋找預(yù)測(cè)效應(yīng)子，減少需要進(jìn)行功能驗(yàn)證的預(yù)測(cè)效應(yīng)子數(shù)量，但以上指標(biāo)應(yīng)用于效應(yīng)子分析時(shí)仍需要注意其相對(duì)有效性。例如，亞麻銹菌（Melampsora lini）的AvrM效應(yīng)子分子量遠(yuǎn)超過300個(gè)氨基酸殘基［28］，油菜莖基潰瘍病菌（Leptosphaeria maculans）的AvrLm1僅含有一個(gè)半胱氨酸［29］，說明并非所有的效應(yīng)子蛋白都是小分子量和富含半胱氨酸的蛋白，僅僅按照這兩個(gè)指標(biāo)可能會(huì)漏掉真正的效應(yīng)子。同理，小分子量的富含半胱氨酸的蛋白也不一定全部具有效應(yīng)子的功能［4］。

根據(jù)效應(yīng)子靶定的寄主亞細(xì)胞組分和發(fā)揮作用的位置可以將其分為非原質(zhì)體效應(yīng)子（Apoplastic effectors）和原質(zhì)體效應(yīng)子（Cytoplasmic effectors）［30］。非原質(zhì)體效應(yīng)子作用于寄主植物細(xì)胞外空間，主要干擾寄主植物的蛋白酶、過氧化物酶及細(xì)胞溶解酶類［31］，它們?cè)诒Ｗo(hù)病原菌細(xì)胞壁、鰲合或者中和寄主植物分泌的抗菌化合物等方面具有重要作用。原質(zhì)體效應(yīng)子可以經(jīng)病原菌分泌后穿過寄主原生質(zhì)到達(dá)亞細(xì)胞組分靶標(biāo)，可以從上游關(guān)閉寄主的免疫反應(yīng)或者重新編輯寄主的轉(zhuǎn)錄過程從而有利于病原菌侵染［32］。

目前人們對(duì)小麥條銹菌效應(yīng)子的特征知之甚少，僅知道和病原真菌其它效應(yīng)子一樣沒有RXLR保守基序。最近Godfrey等［33］在包括小麥稈銹菌在內(nèi)的禾谷類專性寄生菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了［YFW］xC基序，其生理功能還有待于進(jìn)一步研究。將來研究Pst效應(yīng)子應(yīng)該統(tǒng)一規(guī)范效應(yīng)子的發(fā)掘程序和預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，注重Pst基因組的準(zhǔn)確注釋，在軟件分析基礎(chǔ)上注重專家的手工篩選，為研究分析Pst效應(yīng)子奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 植物病原真菌效應(yīng)子的靶標(biāo)及功能

植物病原真菌分泌合適的效應(yīng)子只是成功侵染的第一步，將效應(yīng)子轉(zhuǎn)運(yùn)到準(zhǔn)確的靶標(biāo)才能發(fā)揮其功能。植物病原真菌效應(yīng)子靶定的寄主亞細(xì)胞組分和方式非常多樣，可以多個(gè)效應(yīng)子靶定同一個(gè)細(xì)胞器，也可能一個(gè)效應(yīng)子靶定多個(gè)亞細(xì)胞組分。植物病原真菌效應(yīng)子的功能極其復(fù)雜，至今人們對(duì)其功能了解仍不全面。它們對(duì)病原真菌產(chǎn)生有利或負(fù)面的影響取決于寄主植物的基因型。通常效應(yīng)子有利于病原菌發(fā)育，另一方面，許多已知效應(yīng)子可以被寄主R基因識(shí)別導(dǎo)致過敏性反應(yīng)（Hypersensitive response，HR）從而抑制病原菌發(fā)育。總結(jié)植物病原真菌效應(yīng)子與寄主互作中的功能可以歸納為以下幾個(gè)方面［34］：（1）抑制寄主的細(xì)胞溶解酶類活性。寄主植物分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等細(xì)胞溶解酶類進(jìn)入非原質(zhì)體以抵御病原菌侵染。目前雖然未發(fā)現(xiàn)直接作用于幾丁質(zhì)酶的效應(yīng)子，但已在多種病原真菌中鑒定出抑制非原質(zhì)體蛋白酶的效應(yīng)子。如玉蜀黍黑粉菌（Uromyces maydis）的Pit2抑制半胱氨酸蛋白酶活性并與致病性相關(guān)［35］。蠶豆銹菌U. fabae分泌的RTP1與13種銹菌的半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有同源性［36］；（2）作用于寄主免疫反應(yīng)路徑。如玉蜀黍黑粉菌分泌的See1干擾玉米的SGT1活性，調(diào)節(jié)寄主的免疫反應(yīng)［37］；（3）抑制寄主的過氧化物酶類活性。如玉蜀黍黑粉菌的Pep1抑制寄主的過氧化物酶活性，清除活性氧積累，從而保護(hù)菌絲。Pep1突變體強(qiáng)烈誘導(dǎo)H2O2在侵染點(diǎn)的細(xì)胞壁處積累，引起寄主細(xì)胞死亡，從而限制菌絲擴(kuò)展［38-39］；（4）干擾寄主代謝。玉蜀黍黑粉菌分泌的Cmu1催化寄主的莽草酸途徑中分支酸變換為預(yù)苯酸，從而干擾水楊酸的合成［40］。此外，還有結(jié)合幾丁質(zhì)的效應(yīng)子，這在稻瘟菌等半活體寄生菌中研究較為深入。在小麥稈銹菌、蠶豆銹菌等專性寄生菌的細(xì)胞壁表面是幾丁質(zhì)聚糖，而不是幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)在脫乙酰酶作用下轉(zhuǎn)化成幾丁質(zhì)聚糖，幾丁質(zhì)聚糖顯然不是幾丁質(zhì)酶的最佳底物。植物病原菌通過這種轉(zhuǎn)換阻止菌體細(xì)胞壁釋放幾丁質(zhì)低聚物以逃避寄主受體的識(shí)別，從而干擾寄主的防衛(wèi)反應(yīng)［41］。

4 小麥條銹菌效應(yīng)子功能研究進(jìn)展

基因組和比較基因組方法使效應(yīng)子篩選更加方便，目前研究重點(diǎn)已由效應(yīng)子篩選向效應(yīng)子功能驗(yàn)證轉(zhuǎn)變。由于銹菌目中的病原菌缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，其效應(yīng)子功能的研究進(jìn)展緩慢。例如，已經(jīng)篩選出亞麻銹菌的AvrM、AvrL567、AvrP4和AvrP123［42］、蠶豆銹菌的 RTP1［43］、小麥稈銹菌的PGTAUSPE10-1［44］等預(yù)測(cè)效應(yīng)子，限于方法這些效應(yīng)子在寄主細(xì)胞中的功能均未被驗(yàn)證。

采用本氏煙（Nicotiana benthamiana）異種表達(dá)候選效應(yīng)子雖然不能揭示效應(yīng)子轉(zhuǎn)運(yùn)的全過程，但可為研究銹菌-寄主互作提供有價(jià)值的信息。Ramachandran等［45］應(yīng)用此法對(duì)20個(gè)取自小麥銹菌（9個(gè)來自小麥條銹菌，11個(gè)來自小麥稈銹菌）的預(yù)測(cè)效應(yīng)子功能進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)預(yù)測(cè)效應(yīng)子（shr1-shr9）可以抑制本氏煙的HR反應(yīng)，并且對(duì)不同挑戰(zhàn)接種菌引發(fā)HR的抑制作用不同，即一部分效應(yīng)子可以抑制部分挑戰(zhàn)菌引發(fā)的HR，但不能抑制另外挑戰(zhàn)菌引發(fā)的HR，推測(cè)這些效應(yīng)子用不同的機(jī)制干擾本氏煙的細(xì)胞死亡。另外還發(fā)現(xiàn)，一些效應(yīng)子可以抑制相同的挑戰(zhàn)菌引發(fā)的HR，這種相似性可能與銹菌效應(yīng)子功能冗余有關(guān)［45］。在本氏煙中異種表達(dá)研究候選效應(yīng)子與葉細(xì)胞中靶蛋白之間的互作，其優(yōu)點(diǎn)是得到的靶蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與餌蛋白天然結(jié)合的，相互作用的蛋白質(zhì)都是處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用也是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，避免了人為的影響，試驗(yàn)得到的效應(yīng)子可能是真實(shí)的定位于細(xì)胞質(zhì)的效應(yīng)子，可信度高。使用本氏煙異種表達(dá)研究Pst效應(yīng)子的缺點(diǎn)一方面是可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，另一方面是Pst在自然條件下不侵染茄屬植物，這樣可能會(huì)漏篩對(duì)小麥組分具有?；缘男?yīng)子，造成假陰性。

將Pst候選效應(yīng)子與GFP等熒光蛋白融合在本氏煙中短暫熒光表達(dá)可以提高被測(cè)效應(yīng)子在葉肉細(xì)胞中定位的靈敏性，這種方法受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。Petre等［46］在Pst吸器的轉(zhuǎn)錄本中選擇了16個(gè)與其他蛋白沒有相似性的預(yù)測(cè)蛋白，將它們與GFP的融合蛋白在本氏煙葉肉細(xì)胞內(nèi)短暫熒光表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16個(gè)中的7個(gè)候選效應(yīng)子定位在?；闹参飦喖?xì)胞組分：小胞內(nèi)體（Cytosolic bodies）、內(nèi)膜間隔（Endomembrane compartment）、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、葉綠體、細(xì)胞核等，有的候選效應(yīng)子（PST18220）可以同時(shí)靶定在葉綠體和細(xì)胞核2個(gè)細(xì)胞器。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)效應(yīng)子PST02549可以與P小體（Processing Body）發(fā)生互作。P小體是存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的蛋白質(zhì)/RNA復(fù)合體，可以調(diào)節(jié)mRNA分子的脫帽、降解和貯藏，在基因表達(dá)過程中起到了至關(guān)重要的調(diào)控作用。他們進(jìn)一步利用抗GFP免疫共沉淀/氣質(zhì)聯(lián)用（coIP/MS）技術(shù)確認(rèn)PST02549可以?；陌卸ㄔ赑小體的EDC4（Enhancer of mRNA Decapping Protein 4）［46］。

大麥條斑花葉病毒（Barley stripe mosaic virus，BSMV）介導(dǎo)的基因沉默（Virus mediated hostinduced gene silencing，VIGS）技術(shù)可以成功用于誘導(dǎo)小麥基因沉默，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用VIGS技術(shù)已經(jīng)在Pst候選效應(yīng)子功能研究中取得進(jìn)展。Liu等［47］將Pst候 選 效 應(yīng) 子 PEC6（Pucciniaeffector candidate 6）與GFP融合表達(dá)，熒光分析顯示PEC6可以定位在寄主的細(xì)胞核和胞液。酵母雙雜試驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）顯示PEC6可以與擬南芥和小麥中的腺苷激酶（Adenosine kinases，ADKs）互作。PEC6的N端含有22個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽，成熟蛋白含66個(gè)氨基酸，在24個(gè)不同地理來源的Pst分離物中具有保守性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEC6可以抑制熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens誘導(dǎo)的本氏煙活性氧積累和胼胝質(zhì)沉積，表達(dá)PEC6的擬南芥更容易被缺失AvrPto和AvrPtoB的丁香假單胞菌突變株P(guān)seudomonas syringaepv. tomato（Pto）DC3000 ΔAvrPto/ΔAvrPtoB侵染。PEC6還可以抑制熒光假單胞菌激發(fā)的小麥PTI反應(yīng)。應(yīng)用VIGS技術(shù)沉默PEC6，接種小麥后12 d，沉默PEC6基因的Pst產(chǎn)生的孢子量比對(duì)照株系減少約50%，這些結(jié)果顯示PEC6與小麥條銹菌的致病性相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)沉默小麥ADKs后小麥第4片葉片變短變窄，小麥條銹菌接種后10 d觀察到小麥抗銹性明顯下降，作者推測(cè)小麥ADKs與葉片生長(zhǎng)和抗條銹性相關(guān)，PEC6可能通過靶定ADKs后影響ADKs的調(diào)節(jié)代謝和甲基化轉(zhuǎn)運(yùn)等作用促進(jìn)小麥條銹菌生長(zhǎng)。Yin等［48］在小麥條銹菌吸器cDNA文庫中篩選出6個(gè)候選效應(yīng)子，Cheng等［49］進(jìn)一步對(duì)其中命名為PSTha5a23的候選效應(yīng)子進(jìn)行了功能研究。PSTha5a23的N端包含18個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)肽，并根據(jù)酵母細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)與否的遺傳方法確認(rèn)了其具有功能性的分泌信號(hào)肽，成熟蛋白含108個(gè)氨基酸，與具有酶活性的其他蛋白比較缺乏已知的保守基序。在已發(fā)表基因組序列中未發(fā)現(xiàn)PSTha5a23的同源性基因，在小麥條銹菌基因組中也未發(fā)現(xiàn)其旁系同源基因。比對(duì)6個(gè)不同來源的Pst（中國(guó)的CY32、美國(guó)的PST-21、PST-43和PST-130以及英國(guó)的PST-08/21和PST-87/7）的PSTha5a23序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們間僅有一個(gè)堿基替換造成氨基酸變化，PSTha5a23可能是種內(nèi)多態(tài)性很低的Pst?；男?yīng)子。PSTha5a23-GFP融合蛋白在小麥原生質(zhì)體內(nèi)短暫熒光表達(dá)顯示，PSTha5a23定位于小麥的細(xì)胞質(zhì)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)PSTha5a23在本氏煙中過表達(dá)可以抑制Bax和inF1激發(fā)的細(xì)胞程序化死亡。在小麥中過表達(dá)PSTha5a23可以抑制小麥細(xì)胞中胼胝質(zhì)的沉積。利用VIGS技術(shù)沉默PSTha5e23，接種后14 d，產(chǎn)生的孢子量與對(duì)照無變化。沉默PSTha5a23不改變小麥條銹菌的毒性表現(xiàn)型，這可能與效應(yīng)子功能冗余有關(guān)，但過表達(dá)PSTha5a23明顯提高小麥條銹菌對(duì)小麥的毒性。

酵母雙雜交可以在體外大規(guī)模研究預(yù)測(cè)效應(yīng)子蛋白-寄主植物蛋白間的互作，與其它技術(shù)結(jié)合不但可以研究候選效應(yīng)子的功能，還能篩選出與候選效應(yīng)子互作的植物蛋白。Wang等［50］據(jù)此最先報(bào)道了具有功能的Pst候選效應(yīng)子PNPi（PucciniaNPR1 interactor），并篩選出與PNPi互作的靶標(biāo)——NPR1（Nonexpresser of PR Genes 1）。PNPi是在小麥條銹菌吸器中發(fā)現(xiàn)的，其N端含有22個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的分泌信號(hào)肽，預(yù)測(cè)成熟蛋白含333個(gè)氨基酸。信號(hào)肽末端緊鄰一個(gè)由24個(gè)氨基酸組成的RSLL-DEEP基序，該基序與卵菌效應(yīng)子的保守基序RxLR-dEER相似但并不完全相同，該基序或許與PNPi從吸器外基質(zhì)轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞內(nèi)有關(guān)。PNPi不含有跨膜區(qū)域。通常，一個(gè)效應(yīng)子被植物識(shí)別后，病原菌將修飾或者剔除這個(gè)效應(yīng)子以逃避植物的識(shí)別，這種進(jìn)化力量驅(qū)使寄主抗性基因和病原菌效應(yīng)子的進(jìn)化都非常快速。不同尋常的是，PNPi表現(xiàn)出較高的保守性。6個(gè)小麥條銹菌小種（PST-78、PST-21、PST-43、PST-87/7、PST-08/21和PST-130）和2個(gè)小麥條銹菌小檗分離物［PSH-54（GenBank accession KT764126），PSH-72（GenBank accession KT764127）］的 PNPi蛋白序列100%一致，8個(gè)PNPi編碼區(qū)的核苷酸堿基序列也100%一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，小麥條銹菌PNPi的蛋白序列與小麥稈銹菌（Pgt，XP_003325658）和小麥葉銹菌（Pt，PTTG_03809）的相似性分別達(dá)到67.2%和66.8%。甚至小麥條銹菌PNPi的C端區(qū)域與青楊葉銹菌（Melampsora larici）、玉米黑粉菌、立枯絲核菌等分類距離較遠(yuǎn)的病原菌相應(yīng)區(qū)域也具有較高的相似性。作者推測(cè)PNPi的高度保守性或許與小麥條銹菌在進(jìn)化競(jìng)爭(zhēng)中取得優(yōu)勢(shì)有關(guān)，改變PNPi蛋白結(jié)構(gòu)或許影響小麥條銹菌的寄生適合度。酵母雙雜交顯示PNPi通過它C端的DPBB-1區(qū)域直接與小麥NPR1（wNPR1）的NPR1/NIM1類區(qū)域互作，BiFC技術(shù)共表達(dá)YFPN-PNPi（23-333）和YFPC-wNPR1確認(rèn)了這種直接互作發(fā)生在本氏煙原生質(zhì)體的核中。效應(yīng)子激發(fā)寄主產(chǎn)生的抗性反應(yīng)除了局部性的HR反應(yīng)，還可以使寄主植物產(chǎn)生系統(tǒng)性獲得抗性（SAR），從而對(duì)再次侵染的病原菌產(chǎn)生廣譜的系統(tǒng)抗性。通常寄主植物的SAR反應(yīng)包括產(chǎn)生信號(hào)分子、水楊酸積累、PR基因轉(zhuǎn)錄等。植物中NPR1蛋白是植物免疫系統(tǒng)中的古老組分，其序列不論在單子葉還是雙子葉植物中都是保守的，NPR1在SAR的信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要作用，病原菌侵染后，NPR1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)并與核內(nèi)的TGA2轉(zhuǎn)錄因子互作從而激活多種PR基因表達(dá)。酵母三雜交證實(shí)PNPi干擾wNPR1與小麥的TGA2轉(zhuǎn)錄因子（wTGA2.2）結(jié)合，從而阻止激活小麥的PR基因表達(dá)。進(jìn)一步將過表達(dá)PNPi的轉(zhuǎn)基因大麥接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在接種鄰近的區(qū)域多種PR基因表達(dá)受到抑制。作者推測(cè)PNPi通過干擾小麥wNPR1與wTGA2.2結(jié)合而影響寄主防衛(wèi)反應(yīng)，也可能通過與wNPR4互作影響 wNPR1 的穩(wěn)定性［50］。

5 問題及展望

小麥條銹菌既要盡可能小的傷害侵入點(diǎn)小麥細(xì)胞，又要逃避寄主識(shí)別引發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)才能侵染成功，為此Pst進(jìn)化出復(fù)雜、精巧的系列效應(yīng)子。目前在效應(yīng)子預(yù)測(cè)、定位及功能研究方面已經(jīng)發(fā)展出多種技術(shù)，但Pst效應(yīng)子研究還比較緩慢，仍有一些受限制因素。首先，預(yù)測(cè)Pst效應(yīng)子的指標(biāo)和基因組注釋錯(cuò)誤一定程度上阻礙Pst效應(yīng)子發(fā)掘進(jìn)程。Pst預(yù)測(cè)效應(yīng)子數(shù)量高于實(shí)際數(shù)量，目前采取的預(yù)測(cè)指標(biāo)雖然能極大程度降低待驗(yàn)證的效應(yīng)子數(shù)量，但研究Pst效應(yīng)子時(shí)仍需要不斷對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行完善。將來一方面加強(qiáng)已知效應(yīng)子特征研究、提高Pst基因組注釋程度以完善現(xiàn)有指標(biāo)，另一方面發(fā)展新技術(shù)也非常重要，如效應(yīng)子三維結(jié)構(gòu)相似性對(duì)效應(yīng)子辨別可能有極大幫助［51］。其次，Pst效應(yīng)子-GFP融合蛋白在本氏煙細(xì)胞中短暫表達(dá)可實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞定位研究，為研究Pst-小麥互作提供有價(jià)值的信息，但仍需要注意該體系的不足，同時(shí)發(fā)展遺傳的、生化的和細(xì)胞生物學(xué)的方法用于在Pst侵染過程中標(biāo)記、檢測(cè)和觀察效應(yīng)子。未來研究效應(yīng)子定位的理想狀態(tài)是可視化，可以研究效應(yīng)子在侵入的植物細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)定位，以及植物細(xì)胞組分相應(yīng)的結(jié)構(gòu)變化。

小麥條銹菌若要侵染成功，除了分泌合適的效應(yīng)子外，還要在合適的時(shí)間將效應(yīng)子轉(zhuǎn)運(yùn)到準(zhǔn)確的小麥亞細(xì)胞組分。Pst在不同的侵染階段需要按照時(shí)間順序分泌不同的效應(yīng)子，分泌的效應(yīng)子還需要穿過吸器外基質(zhì)以及多種界面后才能到達(dá)亞細(xì)胞組分。目前人們不僅對(duì)Pst如何實(shí)現(xiàn)這一時(shí)間過程一無所知，而且對(duì)Pst效應(yīng)子從吸器外基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主亞細(xì)胞組分的途徑知之甚少。因此Pst效應(yīng)子如何轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入寄主亞細(xì)胞組分是將來研究的一個(gè)重點(diǎn)問題。另一個(gè)同樣重要的問題是Pst效應(yīng)子在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中如何逃避寄主的免疫識(shí)別。研究發(fā)現(xiàn)，病原真菌和寄主共同進(jìn)化過程中，病原真菌效應(yīng)子被寄主免疫受體識(shí)別后，病原真菌通過多種方式產(chǎn)生變異以逃避、抑制或改變這種識(shí)別。這種逃避機(jī)制主要包括兩類，一類是被識(shí)別效應(yīng)子的基因序列發(fā)生轉(zhuǎn)座插入、突變甚至該效應(yīng)子基因被完全丟棄。已有結(jié)果證實(shí)為便于這類逃避寄主識(shí)別機(jī)制發(fā)揮作用，病原真菌基因組在進(jìn)化過程中把效應(yīng)子經(jīng)常安排在序列重復(fù)區(qū)域［52］、富含轉(zhuǎn)座子區(qū)域［53］或非必需區(qū)域［54］。另一類則不丟棄或不改變被識(shí)別效應(yīng)子基因序列，而是使該效應(yīng)子的調(diào)控區(qū)域發(fā)生突變或調(diào)節(jié)病原菌基因組中影響該效應(yīng)子轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，這樣被識(shí)別效應(yīng)子編碼區(qū)域DNA序列不變，但效應(yīng)子的表達(dá)發(fā)生了改變［55］。這類逃避機(jī)制的特點(diǎn)是可以在基因組中保留被識(shí)別效應(yīng)子基因本身，該效應(yīng)子基因可被重復(fù)使用。目前在大雄疫霉大豆?；蚉hytophthora sojae中發(fā)現(xiàn)這類逃避機(jī)制［56］，但在小麥條銹菌中尚未有類似報(bào)道。因?yàn)樾←湕l銹菌是雙核病原菌，存在兩個(gè)或多個(gè)有功能的效應(yīng)子拷貝，如效應(yīng)子調(diào)控區(qū)某雙顯性等位基因位點(diǎn)中一個(gè)等位基因發(fā)生突變，該位點(diǎn)雖然變?yōu)殡s合位點(diǎn)但并未影響表型，只有兩個(gè)等位基因全部突變才會(huì)改變表型。顯然，這些效應(yīng)子全部發(fā)生毒性變化比只有單拷貝的病原菌將更加困難。

小麥條銹菌效應(yīng)子研究仍處于起步階段，Pst基因組含有兩千多個(gè)預(yù)測(cè)效應(yīng)子基因，但絕大多數(shù)功能是未知的。目前的研究技術(shù)仍有不足，還不能滿足規(guī)?；⑾到y(tǒng)化的研究需要。因此，創(chuàng)建新的研究方法和技術(shù)，建立高通量研究體系，規(guī)模化鑒定Pst效應(yīng)子功能，對(duì)其分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)研究將有助于了解Pst致病機(jī)制，也有助于制定新的抗病策略。

［1］Jones JD, Dang JL. The plant immune system［J］. Nature, 2006,444：323-329.

［2］Sonah H, Deshmukh RK, Bélanger RR. Computational prediction of effector proteins in fungi：opportunities and challenges［J］. Front Plant Sci, 2016, 7：126-132.

［3］Guttman DS, McHardy AC, Schulze-Lefert P. Microbial genomeenabled insights into plant-micro organism interactions［J］. Nat Rev, 2014, 15：797-813.

［4］Selin C, Kievit TR, Belmonte MF, et al. Elucidating the role of effectors in plant-fungal interactions：progress and challenges［J］.Front Microbiol, 2016, 7：600-610.

［5］Win J, Chaparro-Garcia A, Belhaj K, et al. Effector biology of plant associated organisms：concepts and perspectives［J］. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2012, 77：235-247.

［6］李振岐, 曾士邁. 中國(guó)小麥銹病［M］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002.

［7］康振生, 王曉杰, 趙杰, 等. 小麥條銹菌致病性及其變異研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 17：3439-3453.

［8］Thach T, Ali S, de Vallavieille-Pope C, et al. Worldwide population structure of the wheat rust fungus Puccinia striiformis in the past［J］. Fungal Genet Biol, 2016, 87 ：1-8.

［9］Schwessinger B. Fundamental wheat stripe rust research in the 21stcentury［J］. New Phytol, 2017, 213 ：1625-1631.

［10］Derevnina L, Richard WM. Wheat rusts never sleep but neither do sequencers：will pathogenomics transform the way plant diseases are managed？［J］. Genome Biol, 2015, 16：44.

［11］Hesham AYG, Bart PHJT, Michael FS. The age of effectors：genome-based discovery and applications［J］. Phytopathology,2016, 106：1206-1212.

［12］Cantu D, Govindarajulu M, Kozik A, et al. Next generation sequencing provides rapid access to the genome of Puccinia striiformis f. sp. tritici, the causal agent of wheat stripe rust［J］.PLoS One, 2011, 6：e24230.

［13］Cantu D, Segovia V, MacLean D. Genome analyses of the wheat yellow（stripe）rust pathogen Puccinia striiformis f. sp. tritici reveal polymorphic and haustorial expressed secreted proteins as candidate effectors［J］. BMC Genomics, 2013, 14：270.

［14］Zheng W, Huang L, Huang J, et al. High genome heterozygosity and endemic genetic recombination in the wheat stripe rust fungus［J］. Nat Commun, 2013, 4 ：2673.

［15］Duplessis S, Cuomo CA, Lin YC, et al. Obligate biotrophy features unraveled by the genomic analysis of rust fungi［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108：9166-9171.

［16］Christina AC, Guus B, Hala BK, et al. Comparative analysis highlights variable genome content of wheat rusts and divergence of the mating loci［J］. G3（Bethesda）, 2017, 7 ：361-376.

［17］Sun F, Kale SD, Azurmendi HF, et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2013, 26：330-344.

［18］Ye W, Wang Y, Wang Y. Bioinformatics analysis reveals abundant short alpha-helices as a common structural feature of oomycete RxLR effector proteins［J］. PLoS One, 2015, 10 ：e0135240.

［19］Sonah H, Deshmukh RK, Bélanger RR. Computational prediction of effector proteins in fungi：opportunities and challenges［J］.Front Plant Sci, 2016, 7：126-132.

［20］Tanaka S, Djamei A, Presti LL, et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize patho system［J］. Eur J Cell Biol, 2015, 94：349-358.

［21］Petre B, Joly DL, Duplessis S. Effector proteins of rust fungi［J］.Front Plant Sci, 2014, 5：416.

［22］De Wit PJ, Testa AC, Oliver RP. Fungal plant pathogenesis mediated by effectors［J］. Microbiol Spectrum, 2016, 4（6）：18-26.

［23］Hogenhout SA, van der Hoorn RA, Terauchi R, et al. Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms［J］.Mol Plant Microbe Interact, 2009, 22：115-122.

［24］Kamoun S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes［J］. Annu Rev Phytopathol, 2006, 44 ：41-60.

［25］Spanu PD, Abbott JC, Amselem J, et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism［J］. Science, 2010, 330：1543-1546.

［26］Saunders DG, Win J, Cano LM, et al. Using hierarchical clustering of secreted protein families to classify and rank candidate effectors of rust fungi［J］. PLoS One, 2012, 7 ：e29847.

［27］Nemri A, Saunders DG, Anderson C, et al. The genome sequence and effector complement of the flax rust pathogen Melamp soralini［J］. Front Plant Sci, 2014, 5 ：98.

［28］Petre B, Kamoun S. How do filamentous pathogens deliver effector proteins into Plant Cells？［J］. PLoS Biol, 2014, 12：e1001801.

［29］Gout L, Fudal I, Kuhn ML, et al. Lost in the middle of nowhere：the AvrLm1 avirulence gene of the Dothideomycete Leptosphaeria maculans［J］. Mol Microbiol, 2006, 60 ：67-80.

［30］Prateek C, Bulbul, David LJ, et al. Effector biology during biotrophic invasion of Plant Cells［J］. Virulence, 2014, 5 ：703-709.

［31］Giraldo MC, Valent B. Filamentous plant pathogen effectors in action［J］. Nat Rev Microbiol, 2013, 11：800-814.

［32］Caillaud MC, Piquerez SJ, Fabro G, et al. Subcellular localization of the Hpa RxLR effector repertoire identifies a tonoplast-associated protein HaRxL17 that confers enhanced plant susceptibility［J］.Plant J, 2012, 69：252-265.

［33］Godfrey D, B?hlenius H, Pedersen C, et al. Powdery mildew fungal effector candidates share N-terminal Y/F/WxC-motif［J］. BMC Genomics, 2010, 11：317-322.

［34］Oliveira-Garcia E, Valent B. How eukaryotic filamentous pathogens evade plant recognition［J］. Curr Opin Microbiol, 2015, 26：92-101

［35］Mueller AN, Ziemann S, Treitschke S, et al. Compatibility in the Ustilago maydis maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2［J］. PLoS Pathog,2013, 9：e1003177.

［36］Garnica DP, Nemri A, Upadhyaya NM, et al. The ins and outs of rust haustoria［J］. PLoS Pathog, 2014, 10：e1004329.

［37］Redkar A, Hoser R, Schilling L, et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors［J］. Plant Cell, 2015, 27：1332-1351.

［38］Hemetsberger C, Mueller AN, Matei A, et al. The fungal core effector Pep1 is conserved across smuts of dicots and monocots［J］. New Phytol, 2015, 206 ：1116-1126.

［39］Doehlemann G, van der Linde K, Assmann D, et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis, is required for successful invasion of Plant Cells［J］. PLoS Pathog, 2009, 5 ：e1000290.

［40］Djamei A, Schipper K, Rabe F, et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector［J］. Nature, 2011, 478 ：395-398.

［41］Gueddari NE, Rauchhaus U, Moerschbacher BM, et al.Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi［J］. New Phytol,2002, 156：103-112.

［42］Ellis JG, Dodds PN, Lawrence GJ. Flax rust resistance gene specificity is based on direct resistance-avirulence protein interactions［J］. Annu Rev Phytopathol, 2007, 45：289-306.

［43］Kemen E, Kemen AC, Rafiqi M, et al. Identification of a protein from rust fungi transferred from haustoria into infected Plant Cells［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2005, 18 ：1130-1139.

［44］Upadhyaya NM, Mago R, Staskawicz BJ, et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2014, 27 ：255-264.

［45］Ramachandran S, Yin C, Kud J, et al. Effectors from wheat rust fungi suppress multiple plant defense responses［J］.Phytopathology, 2017, 107：75-83.

［46］Petre B, Saunders DGO, Sklenar J, et al. Heterologous expression Screens in Nicotiana benthamiana identify a candidate effector of the wheat yellow rust pathogen that associates with processing bodies［J］. PLoS One, 2016, 11：e0149035.

［47］Liu CH, Pedersen C, Schultz-Larsen T, et al. The stripe rust fungal effector PEC6 suppresses pattern-triggered immunity in a host species-independent manner and interacts with adenosine kinases［J］. New Phytol, 2016, DOI：10. 1111/nph. 14034.

［48］Yin C, Chen X, Wang X, et al. Generation and analysis of expression sequence tags from haustoria of the wheat stripe rust fungus Puccinia striiformis f. sp. tritici［J］. BMC Genomics,2009, 10：626-633.

［49］Cheng YL, Wu K, Yao JN, et al. PSTha5a23, a candidate effector from the obligate biotrophic pathogen Puccinia striiformis f.sp. tritici, is involved in plant defense suppression and rust pathogenicity［J］. Environ Microbiol, 2017, 19 ：1717-1729.

［50］Wang XD, Yang BJ, Li K, et al. A conserved Puccinia striiformis protein interacts with wheat NPR1 and reduces induction of pathogenesis-related genes in response to pathogens［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2016, 29：977-989.

［51］Wirthmueller L, Maqbool A, Banfield MJ. On the front line：structural insights into plant-pathogen interactions［J］. Nat Rev Microbiol, 2013, 11：761-776.

［52］Qutob D, Tedman-Jones J, Dong S, et al. Copy number variation and transcriptional polymorphisms of Phytophthora sojae RXLR effector genes Avr1a and Avr3a［J］. PLoS One, 2009, 4：e5066.

［53］Ali S, Laurie JD, Linning R, et al. An immunity-triggering effector from the Barley smut fungus Ustilago hordei resides in an Ustilaginaceae-specific cluster bearing signs of transposable element-assisted evolution［J］. PLoS Pathog, 2014, 10 ：e1004223.

［54］Rep M, van der Does HC, Meijer M, et al. A small, cysteinerich protein secreted by Fusarium oxysporum during colonization of xylem vessels is required for I-3-mediated resistance in tomato［J］. Mol Microbiol, 2004, 53 ：1373-1383.

［55］Na R, Gijzen M. Escaping host immunity：new tricks for plant pathogens［J］. PLoS Pathog, 2016, 12 ：e1005631.

［56］Shan WX, Cao M, Dan LU, et al. The Avr1b locus of Phytophthora sojae encodes an elicitor and a regulator required for avirulence on soybean plants carrying resistance gene Rps1b［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2004, 17：394-403.