張瑞濤，史惠蓉，任　芳，王文文，姬鵬程，劉傳娜，陳　晨

鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)醫(yī)學部 鄭州 450052

惡性腫瘤的發(fā)生是一個多步驟的復雜過程，細胞周期調節(jié)異常和信號通路傳導異常與大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[1]。細胞周期G2/M檢驗點是細胞進入有絲分裂前修復DNA損傷的重要關卡，細胞周期依賴激酶1(cyclin dependent kinases 1， CDK1)是細胞周期G2/M期調控傳導網(wǎng)絡中的核心因子[2-3]。研究[4-10]表明，在喉癌、食管癌、肺癌、肝癌、結直腸癌、腎癌和卵巢癌等多種癌組織中均檢測到CDK1的高表達，其高表達與上述惡性腫瘤的預后有關，CDK1可能在上述惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本課題利用shRNA干擾技術研究檢查點激酶1(check-point kinase 1,CHK1)-CDK1信號通路介導的G2/M檢驗點在卵巢上皮性癌SK-OV-3、OVCAR-3細胞增殖和凋亡中的作用，現(xiàn)將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1主要材料人上皮性卵巢癌細胞株SK-OV-3、OVCAR-3購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學保藏中心)，RPMI 1640完全培養(yǎng)基購自美國HyClone公司。鼠抗人CDK1單克隆抗體、鼠抗人CyclinB1單克隆抗體、兔抗人磷酸化CDK1(Thr14/Tyr15)多克隆抗體、鼠抗人CHK1單克隆抗體、山羊抗人磷酸化CHK1(ser345)多克隆抗體、鼠抗人CDC25C單克隆抗體、山羊抗人磷酸化CDC25C(ser216)多克隆抗體、山羊抗人Ki-67多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。鼠抗人PCNA單克隆抗體、兔抗人Caspase8多克隆抗體、鼠抗人Cleaved-Caspase3單克隆抗體、WB及IP蛋白裂解液、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物公司，增強化學發(fā)光(ECL)試劑盒、兔抗人β-actin單克隆抗體、鼠抗兔單克隆IgG均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。陰性對照shRNA 質粒、shRNA Plasmid Transfection Reagent為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒為加拿大Fermentas公司產(chǎn)品。

1.2細胞培養(yǎng)和轉染SK-OV-3、OVCAR-3細胞用含有體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對數(shù)生長期收集細胞用于后續(xù)實驗。將特異性沉默CDK1基因(產(chǎn)品編號sc-29252-SH)、CHK1基因(產(chǎn)品編號sc-29269-SH)的shRNA質粒及其相應的陰性對照質粒(產(chǎn)品編號sc-108060)分別轉染SK-OV-3、OVCAR-3細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，擴增建株，實驗組細胞分別命名為空白對照組(B組)、陰性對照組(NC組)和沉默組(K組)。

1.3相關基因表達的RT-PCR檢測Trizol提取細胞總RNA，參照RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒說明書反轉錄合成cDNA模板。RT-PCR所用CDK1引物(產(chǎn)品編號sc-29252-PR)、CHK1引物(產(chǎn)品編號sc-29269-PR)購自美國Santa Cruz公司，內參β-actin引物由上海生物工程有限公司設計合成，β-actin上游引物5’-ACGCACCCCAACTA CAACTC-3’，下游引物5’-TCTCCTTAATGTCACG CACGA- 3’(372 bp)。PCR反應體系25 μL，含cDNA 模板 1 μL、2×Taq酶11 μL、上下游引物各1 μL、核糖核酸游離水11 μL。反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃終止。應用Image-Pro Plus 6.0分析目的條帶的灰度值，以目的基因條帶灰度值/β-actin條帶灰度值作為目的基因相對表達量。實驗重復3次。

1.4相關蛋白表達的Westernblot檢測用蛋白裂解液提取細胞樣本總蛋白，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。分別取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，恒壓20 V半干轉至PVDF膜，含50 g/L脫脂奶粉、體積分數(shù)0.05% TBST室溫封閉2 h，按說明書分別用一抗、二抗4 ℃孵育過夜，IgG(按12 000稀釋)室溫孵育2 h。ECL試劑盒顯色后曝光，Image-Pro Plus 6.0分析特異性目的條帶的灰度值，將β-actin設為內參，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.5細胞增殖情況的MTT法檢測將各組細胞按1×104個/孔接種于96孔板，每組細胞設3個復孔，另設3個空白對照孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h，此后每24 h向孔內加入5 g/L MTT 20 μL，連續(xù)5 d，加入MTT作用4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置于搖床上低速振蕩10 min，酶標儀測量492 nm波長處各孔的吸光度(A)值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，A值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡情況每組收集1×105個細胞，棄上清，加入195 μL的Annexin V-FITC結合液重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻后，再加入10 μL PI混勻，室溫、避光孵育15 min，冰浴后立即采用FACScan流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)檢測細胞凋亡情況，采用Cell Quest軟件進行分析。實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學處理。同一時間點沉默CDK1、CHK1基因后各組細胞A值的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗；不同組間相關基因或蛋白相對表達量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1CDK1基因沉默對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響RT-PCR結果顯示，SK-OV-3和OVCAR-3細胞K組中CDK1的表達均低于B組和NC組，而B組和NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖1、表1)。MTT和流式細胞術檢測結果顯示，SK-OV-3和OVCAR-3細胞K組的增殖受到抑制、凋亡率增加，而B組和NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖2，表2～4)。Western blot結果顯示，CDK1基因沉默后SK-OV-3和OVCAR-3細胞K組中CDK1、p-CDK1蛋白的表達均低于B組和NC組，而CHK1、p-CHK1、CDC25C、p-CDC25C、CyclinB1蛋白的表達無變化；此外，在SK-OV-3和OVCAR-3細胞K組中檢測到PCNA、Ki-67蛋白表達減少，Caspase8、Cleaved-Caspase3蛋白表達增加；B組和NC組上述蛋白表達的比較差異均無統(tǒng)計學意義(圖3、表1)。

1：SK-OV-3細胞B組；2：SK-OV-3細胞NC組；3：SK-OV-3細胞K組；4：OVCAR-3細胞B組；5：OVCAR-3細胞NC組；6：OVCAR-3細胞K組圖1　各組卵巢癌細胞中CDK1和CHK1的表達

表1　CDK1基因沉默后各組細胞中相關mRNA和蛋白表達水平的比較(n=3)

*：與B組相比，P<0.05；#：與NC組相比，P<0.05

A：沉默CDK1基因對SK-OV-3細胞增殖的影響；B：沉默CDK1基因對OVCAR-3細胞增殖的影響；C：沉默CHK1基因對SK-OV-3細胞增殖的影響；D：沉默CHK1基因對OVCAR-3細胞增殖的影響圖2　各組卵巢癌細胞的生長曲線

表2　沉默CDK1基因對各組細胞A值的影響(n=3)

*：與B組、NC組相比，P<0.05

表3　分別沉默CDK1和CHK1基因對各組SK-OV-3細胞凋亡率的影響(n=3)　%

*：與B組相比，P<0.05；#：與NC組相比，P<0.05

表4　分別沉默CDK1和CHK1基因對各組OVCAR-3細胞凋亡率的影響(n=3)　%

*：與B組相比，P<0.05；#：與NC組相比，P<0.05

A：CHK1-CDK1信號通路相關蛋白的表達情況；B:增殖和凋亡相關蛋白的表達情況；1～3：SK-OV-3細胞B、NC和K組；4～6：OVCAR-3細胞B、NC和K組圖3　CDK1基因沉默后各組卵巢癌細胞相關蛋白的表達

2.2CHK1基因沉默對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響RT-PCR結果顯示，SK-OV-3和OVCAR-3細胞K組中CHK1的表達水平均低于B組和NC組，而B組和NC組比較差異均無統(tǒng)計學意義(圖1、表5)。MTT和流式細胞術檢測結果顯示，SK-OV-3和OVCAR-3細胞K組的增殖受到抑制、凋亡率增加，而B組和NC組比較差異均無統(tǒng)計學意義(圖2，表3、4、6)。Western blot結果顯示，CHK1基因沉默后SK-OV-3和OVCAR-3細胞K組中CHK1、p-CHK1和p-CDC25C蛋白表達減少，p-CDK1蛋白表達升高，而CDC25C、CDK1、CyclinB1蛋白的表達無變化；此外，在SK-OV-3和OVCAR-3細胞K組中檢測到PCNA、Ki-67蛋白表達減少，Caspase8、Cleaved-Caspase3蛋白表達增加；B組和NC組上述蛋白表達的比較差異均無統(tǒng)計學意義(圖4、表5)。

表5　CHK1基因沉默后對各組細胞中相關mRNA和蛋白表達水平的比較(n=3)

*：與B組相比，P<0.05；#：與NC組相比，P<0.05

表6　沉默CHK1基因對各組細胞A值的影響(n=3)

*：與B組、NC組相比，P<0.05

A：CHK1-CDK1信號通路相關蛋白的表達情況；B:增殖和凋亡相關蛋白的表達情況；1～3：SK-OV-3細胞B、NC和K組；4～6：OVCAR-3細胞B、NC和K組圖4　CHK1基因沉默后各組卵巢癌細胞相關蛋白的表達

3　討論

目前，卵巢癌發(fā)病的分子機制仍不很清楚。G2/M檢驗點是細胞周期中重要的細胞檢測機制，是決定細胞一分為二的控制點，是細胞進入有絲分裂前修復DNA損傷的最后時機[2]。細胞DNA損傷后可通過G2/M期DNA損傷檢驗點P53-P21WAF1通路和CHK1-CDC25通路，抑制CyclinB1/CDK1復合物的活性和進入細胞核，引起細胞周期 G2期阻滯，啟動DNA損傷修復[11-12]。如果修復失敗或者損傷因素積累就有可能導致無法控制的細胞增殖，最終導致癌變。CDK1含有Thr161激活位點和Thr14/Tyr15抑制位點，CDK1的Thr161磷酸化和Thr14/Tyr15去磷酸化使CDK1激活，CDK1激活后進而調節(jié)CyclinB1/CDK1復合物的活性，而Thr14/Tyr15位點的磷酸化和去磷酸化是調節(jié)CDK1活性的關鍵[13-14]。

本課題組的前期研究[15-16]表明，上皮性卵巢癌組織中存在P53、P21WAF1和CDK1異常表達，推測三者可能協(xié)同參與了上皮性卵巢癌的發(fā)病。本研究結果顯示，卵巢癌細胞SK-OV-3、OVCAR-3中存在CDK1高表達和p-CDK1(Thr14/Tyr15)低表達，沉默CDK1基因的表達后細胞增殖明顯受到抑制、凋亡率明顯增加，提示CDK1的異常表達與上皮性卵巢癌細胞的增殖和凋亡關系密切。

進一步的研究結果顯示，抑制CDK1基因表達對SK-OV-3、OVCAR-3細胞中CHK1、p-CHK1、CDC25C、p-CDC25C、CyclinB1蛋白的表達無明顯影響；而抑制CHK1基因表達后，SK-OV-3、OVCAR-3細胞中p-CHK1和p-CDC25C蛋白表達減少、p-CDK1蛋白表達升高。此外，分別抑制CDK1和CHK1基因均可引起SK-OV-3和OVCAR-3細胞中PCNA和Ki-67蛋白表達減少，Caspase8和Cleaved-Caspase3蛋白表達增加。上述結果表明，抑制CHK1基因可引起CDK1的Thr14/Tyr15位點磷酸化增加，最終通過CHK1-CDC25C信號通路使CyclinB1/CDK1復合物活性受到抑制，導致被阻滯在G2/M期的卵巢癌細胞數(shù)目增加，細胞增殖受到抑制、凋亡增加。由此推測，CDK1可能因上游CHK1-CDC25C信號通路的異常調節(jié)而激活，進而使CyclinB1/CDK1復合物活性異常增加，推動細胞跨越G2/M檢驗點進入有絲分裂期，并抑制細胞凋亡程序的激活，最終導致卵巢癌細胞的異常增殖和凋亡。

總之，本研究結果提示CDK1基因的異常表達與上皮性卵巢癌細胞的增殖和凋亡相關，CDK1可能通過CHK1-CDK1信號通路介導的G2/M檢驗點參與調節(jié)卵巢癌上皮性細胞的增殖和凋亡。但是，CHK1-CDK1信號通路僅僅是G2/M檢驗點分子調控機制的一部分，需要在本研究基礎上進一步探討卵巢癌細胞中CDK1表達異常與其他信號通路調控異常的關系。

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