朱春暉，王文杏，陳　強，陳慶法，吳春雪，劉曉艷，賴華毅，余曉君

1)江西省兒童醫(yī)院感染科 南昌 330006　2)江西省兒童醫(yī)院內科 南昌 330006　3)江西省兒童醫(yī)院檢驗科 南昌 330006

沙門菌是一組寄生于人類和動物腸道內生化反應和抗原構造相似的革蘭陰性桿菌，除可以引起傷寒、副傷寒外，也是人類細菌性食物中毒、腹瀉、菌血癥和敗血癥的主要病原體。菌血癥和敗血癥嚴重威脅著人類健康，在免疫功能未發(fā)育完善的兒童中病死率極高。據(jù)不完全統(tǒng)計，沙門菌每年造成全球約750萬兒童感染病例，在非洲地區(qū)沙門菌感染在兒童中的死亡率甚至高達24%[1]。本課題組前期研究[2]結果表明，江西地區(qū)腹瀉兒童大便中沙門菌分離率高，其中鼠傷寒沙門菌為主要血清型，耐藥現(xiàn)象嚴重。2013世界經(jīng)濟論壇全球風險報告將抗生素耐藥細菌列為人類健康最大危害之一。因此，沙門菌耐藥機制的研究顯得尤為重要。據(jù)此，本課題組構建穩(wěn)定的沙門菌表達載體，并在前期使用同源重組法制備鼠傷寒沙門菌質粒毒力基因(Salmonellaplasmid virulence genes，spv)基因缺陷株[3-5]基礎上構建鼠傷寒沙門菌spv回補株，分析菌株間耐藥表型的差異，并探討其可能機制，為逆轉鼠傷寒沙門菌耐藥提供新的分子靶標。

1　材料與方法

1.1質粒、菌株、酶類和主要試劑野生型鼠傷寒沙門菌株STM.211為前期從臨床腹瀉患者糞便中分離并由江西省兒童醫(yī)院微生物室保存的臨床分離株(藥敏試驗提示對阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢唑啉、慶大霉素、環(huán)丙沙星耐藥)；spvB基因缺陷株STM.211-△-spvB、spvC基因缺陷株STM.211-△-spvC和spvB及spvC基因共同缺陷株STM.211-△-spvBC(課題組前期研究構建，并保存)；大腸埃希菌Top10購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T克隆載體購自大連TaKaRa公司；pACYC184克隆載體購自南通麥杰生物科技有限公司；pAZ44-H質粒由華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室郭愛珍教授惠贈。限制性內切酶SalⅠ、SphⅠ、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、EcoRⅤ、DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Hyclone公司，質粒提取試劑盒、DNA 膠 回收試劑盒、RT-PCR試劑盒購自Promega 公司，細菌基因組 DNA 提取試劑盒(離心柱)購自天根生化科技(北京)有限公司，DNA 聚合酶試劑盒購自Qiagen 公司，脂質體Lipofectamine及總RNA提取試劑購自Invitrogen公司，PCR引物由TaKaRa合成，DNA 分子質量標準Marker 購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2eGFP基因的合成及克隆根據(jù)GenBank中的增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluroscent protein，eGFP)基因序列，在上游增加Trc Promoter啟動子序列，下游增加rrnB ribosomal終止子序列，位點上游增加XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點，下游增加NheⅠ酶切位點。設計引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成合成。以設計合成的引物E1至E26各10 μL混合物為模板，進行PCR預擴增。取PCR產物為模板，用E1和E26進行PCR擴增，獲得含啟動子和終止子的eGFP基因，割膠純化產物，用XhoⅠ、NheⅠ和SalⅠ、XbaⅠ對PCR產物和pACYC184載體進行雙酶切，電泳分離目的基因，對目的條帶割膠純化后用T4連接酶進行定向連接以構建pACYC184-eGFP，轉至Top10感受態(tài)細菌，氯霉素篩選陽性克隆，PCR檢測并測序鑒定。

1.3hok/sok-parDE(HOK)基因的調取及克隆以pAZ44-H質粒為模板，用HOK正反義引物進行PCR擴增獲取aphA-hok-parDE基因，割膠純化產物后用NheⅠ和XbaⅠ對產物和pACYC184-eGFP載體進行酶切，電泳分離目的基因后，割膠純化，用T4連接酶進行定向連接構建pACYC184-eGFP-HOK載體，轉化至E.coli Top10感受態(tài)細菌，氯霉素、卡那霉素雙抗篩選陽性克隆，PCR檢測并測序鑒定證實載體構建的正確性。

1.4spvB及spvC基因的調取及克隆根據(jù)GenBank中公布的鼠傷寒沙門菌spvB、spvC基因的上、下游核苷酸序列，以沙門菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲取spvB、spvC基因，割膠純化產物，分別克隆至pMD19-T獲得pMD-spvB和 pMD-spvC質粒，轉至Top10感受態(tài)細菌，篩選陽性克隆后用BglⅡ、NotⅠ和SalⅠ、NotⅠ進行雙酶切驗證并測序鑒定。

使用限制性內切酶對質粒pMD-spvB、pMD-spvC及pACYC184-eGFP-HOK進行酶切，電泳分離目的基因后進行割膠純化，用T4連接酶進行定向連接，構建pACYC184-spvB-eGFP-HOK和pACYC184-spvC-eGFP-HOK載體，轉至Top10感受態(tài)細菌，氯霉素、卡那霉素雙抗篩選陽性克隆，PCR檢測并測序鑒定。

1.5spvB及spvC回補株STM.211-c-spvBC的構建及鑒定將pACYC184-eGFP、pACYC184-spvB-eGFP-HOK、pACYC184-spvC-eGFP-HOK質粒DNA與電感受態(tài)STM.211-△-spvBC輕吸混勻制備混合物，加入預冷的電擊杯中，排除氣泡，使用2 100 V電擊混合物，然后迅速加入無抗LB培養(yǎng)液中，吹吸混勻并轉移到1.5 mL離心管中，取重懸菌液均勻涂布于含50 mg/L卡那霉素和氯霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，倒置平板，37 ℃ 20 h。重組菌經(jīng)PCR測序鑒定后命名為STM.211-c-spvBC、STM.211-c-spvBC-HOK。

1.6質粒穩(wěn)定性評價分別挑取STM.211-c-spvBC、STM.211-c-spvBC-HOK單菌落接種于含有100 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/ min振搖培養(yǎng)，使菌液的A600 nm達到0.1～0 .3，取10 μL菌液轉接到10 mL無抗性LB的液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。每12 h傳代1次，連續(xù)培養(yǎng)6 d，轉接的同時將菌液進行倍比稀釋。取適當稀釋度的菌液分別涂布在LB固體平板和卡那霉素/氯霉素雙抗瓊脂平板后統(tǒng)計菌落數(shù)，每個平板涂10 μL菌液，每個稀釋度重復3次，計數(shù)LB平板菌落數(shù)，計數(shù)雙抗平板帶質粒的菌落數(shù)，二者比值為抗性菌落百分數(shù)，用以評價質粒穩(wěn)定性。實驗重復3 次。采用標準堿裂解法抽提質粒確定質粒存在。

1.7藥物敏感性實驗根據(jù)美國臨床實驗室標準委員會(NCCLS)標準應用瓊脂平板稀釋法檢測菌株(STM.211、STM.211-△-spvB、STM.211-△-spvC、STM.211-△-spvBC、STM.211-c-spvBC)對臨床常用抗生素的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration，MIC)，參照NCCLS2004年標準判斷結果。質控菌為大腸埃希菌ATCC25922。

1.8外排泵相關蛋白AcrA和AcrB的Westernblot檢測待毒力基因spv缺陷株、毒力基因spv回補株及野生菌株的菌液生長至A600 nm=0.6～0.8，離心收集細胞，沉淀用離解液[20 nmol/L Tri-鹽酸(pH=8.0)，100 mmol/L氯化鈉，30%甘油，AEBSF, 1 mmol/L依地酸(EDTA，pH=8.0)]懸浮，超聲破細胞。用Bradford法測定總蛋白濃度，小牛血清白蛋白定標，行SDS-PAGE，將蛋白在25 V 電壓下電轉移30 min(檢測AcrB時，采用電壓20 V，20 min)，然后移至硝酸纖維素膜上，再先后與抗AcrA抗體或抗AcrB抗體(1200)及HRP標記的抗兔 IgG 二抗雜交，化學發(fā)光試劑顯色。

2　結果

2.1eGFP基因的合成、克隆及鑒定含啟動子及終止子的eGFP基因PCR結果見圖1。XhoⅠ及NheⅠ對eGFP基因片段進行雙酶切，SalⅠ及XbaⅠ對pACYC184載體進行雙酶切。切膠純化回收后T4連接酶鏈接eGFP片段和pACYC184線性載體合成重組質粒pACYC184-eGFP，轉化入Top10感受態(tài)大腸埃希菌。挑斑于含有35 mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)，設計測序引物，PCR擴增產物測序鑒定，結果正確。

2.2hok/sok-parDE(HOK)基因的調取及克隆以pAZ44-H質粒為模板，PCR擴增獲得HOK基因片段(圖2)，重組入pACYC184-eGFP質粒并轉化入感受態(tài)大腸埃希菌。挑取陽性克隆進行抗性培養(yǎng)并PCR擴增，產物送測序，結果正確。

M：Marker；1：多重PCR得到的eGFP基因片段圖1　eGFP基因(含啟動子終止子)PCR擴增結果

M：Marker；1：HOK基因片段圖2　HOK基因PCR擴增結果

2.3spvB及spvC基因的調取及克隆以沙門菌基因組DNA為模板，PCR擴增獲得spvB和spvC基因片段(圖3)。切膠純化回收PCR產物。T4連接酶鏈接spvB、spvC與pMD19-T載體得到pMD-spvB及pMD-spvC，分別轉化入感受態(tài)大腸埃希菌，挑斑于含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。挑取陽性克隆提取重組質粒，NotⅠ單酶切產生一條環(huán)狀條帶，一條略大些的線性DNA，NotⅠ/BglⅡ雙酶切pMD-spvB產生大約1.8 kb的條帶，SalⅠ/NotⅠ雙酶切pMD-spvC產生大約0.72 kb的條帶(見圖4)。切膠純化回收spvB、spvC基因片段及質粒進行測序鑒定，鑒定正確后，將回收的spvB、spvC基因片段分別和pACYC-eGFP-HOK線性載體重新連接，合成重組質粒后轉化入感受態(tài)細菌。挑取陽性克隆于含氯霉素抗性的LB培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)，設計測序引物，PCR擴增產物測序鑒定。

2.4平板計數(shù)法測量質粒穩(wěn)定性結果見圖5、6。攜帶質粒的細菌STM.211-c-spvBC培養(yǎng)第2到3代質粒開始丟失，第9到10代完全丟失。而攜帶質粒STM.211-c-spvBC-eGFP-HOK的細菌均無明顯的質粒丟失。實驗結果提示，重組質粒pACYC184-spvBC-eGFP-HOK因攜帶hok/sok-parD/E質粒從而可穩(wěn)定保留，穩(wěn)定性高于重組質粒pACYC184-spvBC-eGFP。

M：Marker；1：spvC基因片段；2：spvB基因片段圖3　spvB、spvC基因PCR擴增結果

M：Marker；1：單酶切pMD-spvB產物；2：單酶切pMD-spvC產物；3：雙酶切pMD-spvB產物；4： 雙酶切pMD-spvC產物圖4　重組質粒pMD-spvB及pMD-spvC的酶切結果

圖5　STM.211-c-spvB培養(yǎng)6 d抗性菌落百分比

圖6 　STM.211-c-spvBC-eGFP-HOK培養(yǎng)6 d抗性菌落百分比

2.5藥物敏感性檢測結果見表1。STM.211-△-spvBC對阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢唑啉、慶大霉素及環(huán)丙沙星敏感性優(yōu)于STM.211。所有菌株均對亞胺培南敏感。

2.6外排泵相關蛋白AcrA、AcrB的表達見圖7和表2。STM.211-△-spvBC的AcrA蛋白水平低于STM.211及STM.211-c-spvBC(P<0.05)；STM.211-△-spvB、STM.211-△-spvC與STM.211-△-spvBC間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。STM.211、STM.211-△-spvB、STM.211-△-spvC、STM.211-△-spvBC、STM.211-c-spvBC間AcrB的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1　不同抗生素對菌株的MIC值

1：STM.211；2：STM.211-△-spvB；3：STM.211-△-spvC；4：STM.211-△-spvBC；5：STM.211-c-spvBC圖7　菌株外排泵相關蛋白AcrA、AcrB的表達

表2　菌株外排泵相關蛋白AcrA、AcrB表達量的比較(n=6)

*:與STM.211、STM.211-c-spvBC相比，P<0.05

3　討論

沙門菌作為一種革蘭陰性桿菌，感染人類和動物后常常引起菌血癥、傷寒熱和腸炎等臨床表現(xiàn)，據(jù)報道，歐洲每年至少約350 000例感染患者[6]，而在美國每年約200 000例，而實際上，感染的真正人群則高出這個數(shù)字3倍[7]。沙門菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴峻，增加了臨床治療的難度。既往研究集中在研究細菌耐藥機制上，近年來，在人類微生物群日益受到關注的大背景下，科學家們重拾用噬菌體來治療細菌感染的興趣，但通過改變細菌毒力來逆轉細菌耐藥表型目前尚未見報道。課題組前期以從腹瀉兒童糞便中分離的耐藥鼠傷寒沙門菌為研究對象，利用自殺質粒構建沙門菌spvBC缺陷菌株并測序鑒定，體內外實驗表明spvBC缺陷后鼠傷寒沙門菌毒力下降。本研究中作者使用電轉化技術構建spvBC回補株并比較菌株間耐藥性差異及耐藥相關蛋白表達的異同。

在重組細菌中，高拷貝質粒因為同源重組后復制擴增導致“二聚體災難”形成質粒二聚體，代謝符合增加導致穩(wěn)定性下降[8]。低拷貝質粒能穩(wěn)定表達目的基因組，但拷貝數(shù)低，分離過程不能穩(wěn)定持有。啟動子轉錄翻譯過程中啟動子功能可能受到抑制[9]，在轉錄下游增加轉錄終止子可以增加mRNA的穩(wěn)定性，因此，本課題組采用Trp及Lac啟動子雜合拼接成的Trc啟動子和高效表達目的基因所必需的rrnB ribosomal 終止子人工合成eGFP以獲得更高轉錄效率。構建重組質粒過程中，往往因編碼基因增加宿主細胞的代謝負荷導致質粒易于丟失穩(wěn)定性差，目前可使用以下3種途徑來增加質粒穩(wěn)定性：以抗生素作為選擇壓力的質粒載體系統(tǒng)(人、動物體內無法實現(xiàn)且有導致抗藥菌擴散的風險)；染色體-質粒平衡致死系統(tǒng)(對培養(yǎng)基、細菌種屬、基因型有所要求而限制其使用)；質粒解離后致死系統(tǒng)(post segregational killing system，PSK )。本實驗使用的hok/sok-parDE質粒穩(wěn)定系統(tǒng)即是PSK中的經(jīng)典之作，hok/sok和parD/E分屬兩個獨立的平衡致死系統(tǒng)，hok基因和parE基因分別編碼兩種毒力蛋白，sok和parD能拮抗他們的毒性作用。在含質粒的細胞中，sok RNA通過與hok mRNA結合抑制hok mRNA的表達，parD能抑制parE的轉錄、翻譯及其毒力效應，細胞維持了穩(wěn)態(tài)。當細胞質粒丟失，sok RNA及parD逐漸降解，Hok和ParE在細胞中聚集，產生毒力蛋白使細胞裂解死亡。hok/sok和parDE組合系統(tǒng)比hok/sok或parDE單一系統(tǒng)具有更強的質粒穩(wěn)定作用[10]。本研究使用hok/sok-parDE質粒穩(wěn)定系統(tǒng)將融合基因插入編碼eGFP蛋白的質粒中得到重組質粒pACYC184-eGFP-HOK，然后向預留的酶切位點中插入目的基因spvBC,重組質粒pACYC184-spvB-eGFP-HOK 和pACYC184-spvC-eGFP-HOK成功構建后將其電轉化入感受態(tài)細菌構建回補株，對重組質粒穩(wěn)定性研究表明，含hok/sok-parDE質粒的菌株所攜帶的質粒穩(wěn)定持有，質粒無明顯丟失，而不含該系統(tǒng)的質粒在傳2至3代后出現(xiàn)質粒丟失的現(xiàn)象。經(jīng)基因測序證實鼠傷寒沙門菌熒光表達載體pACYC184-eGFP-HOK、pACYC184-spvB-eGFP-HOK、pACYC184-spvC-eGFP-HOK及spvBC缺陷株的回補株均成功構建。

解決重組細菌的技術難題后，構建菌株及野生菌株的藥敏試驗顯示，鼠傷寒沙門菌spvBC缺陷后菌株對β-內酰胺類、氟喹諾酮類、氨基糖甙類的代表藥物敏感性均明顯增強。既往研究[11]發(fā)現(xiàn)宿主抗性因子Nramp1能上調致病島-2毒力基因的表達，而AcrD的滅活導致與基礎代謝、毒力和應激應答在內的基本過程相關的403種基因表達的改變[12]：細菌的耐藥與毒力間并非“各行其道”而是相互影響，細菌的耐藥機制中主要的外排泵除能將抗生素泵出外也能將機體遭受細菌感染后分泌的膽汁、激素及宿主防御因子泵出以利于細菌對宿主細胞的侵襲[13]，故宿主抗性因子及外排泵的存在有助于細菌在宿主體內的存活、侵襲、運動等生物特性。本研究結果顯示：spv的缺陷能改變鼠傷寒沙門菌的耐藥表型，非傷寒沙門菌中普遍存在質粒spv，大小約50～90 kb，與細菌黏附、運動、血清抗性及定居有關[14]。黃瑞等[15]研究表明，分離自傷寒沙門菌的耐藥質粒pRsT98上的spvR和spvB與鼠傷寒沙門菌的spv有大于99%的同源性。spv作為細菌某些耐藥機制的上游發(fā)揮作用抑或spv與耐藥相關因子有相同的作用位點目前尚未明了。本研究隨后對導致細菌耐藥外排泵中研究得最多的AcrA/B蛋白進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)spvBC基因缺陷菌株的AcrA蛋白水平低于野生菌株及spvBC缺陷回補株，這表明spvBC的缺陷能下調AcrA蛋白的表達，而spvBC的回補能解除對AcrA蛋白的表達的抑制。

眾所周知，作為一種典型的外流泵系統(tǒng)，AcrA/B-TolC外排泵系統(tǒng)能將代謝產物或抗生素等有毒物質泵出細胞外并抑制孔蛋白表達，使抗生素無法進入細菌內發(fā)揮作用以應對環(huán)境壓力適者生存[16]。spv作為一種毒力基因是通過何種途徑來影響AcrA蛋白的表達？與此同時，spv表達的改變在影響AcrA蛋白的表達的同時AcrB蛋白的表達卻未受到影響等均有待進一步的研究。下一步課題組將檢測AcrAB的外流通道外膜蛋白TolC及調控基因acrR、ramA、marA等的表達情況，以進一步探討毒力基因spv改變耐藥表型的機制，為將spv作為逆轉鼠傷寒沙門菌耐藥的分子靶標打下實驗基礎。

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