王　悠，金學(xué)民

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科 鄭州 450052

Stargardt病(Stargardt disease, STGD)是最常見的青少年黃斑發(fā)育不全遺傳病，為常染色體隱性遺傳，罕見顯性遺傳[1]，多于青少年期起病，極少數(shù)患者于50歲后才有臨床表現(xiàn)[2]。該病特點(diǎn)是中心視力呈進(jìn)行性下降，雙眼視網(wǎng)膜色素上皮漸進(jìn)性萎縮，眼底檢查常表現(xiàn)為黃斑萎縮，常在后極部有典型的黃白色魚尾樣斑點(diǎn)蔓延，有時(shí)也可出現(xiàn)在視網(wǎng)膜赤道部[2]。典型的眼底造影表現(xiàn)為脈絡(luò)膜湮滅征，這是由于堆積在視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigment epithelium,RPE)的脂褐素遮蔽了脈絡(luò)膜熒光所致。疾病進(jìn)一步進(jìn)展則可表現(xiàn)出視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)異常。STGD人群發(fā)病率1/10 000，常見于近親結(jié)婚的后代，同胞中可有多人發(fā)病。95%以上的STGD與ABCA4基因 (OMIM:601691; GenBank:NG_009073.1)的異常有關(guān)[3-5]，但不同患者ABCA4基因的突變位點(diǎn)不同，故本研究對(duì)3個(gè)STGD家系的ABCA4基因進(jìn)行了篩查和突變定位。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象3例來自不同家系的STGD先證者由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、河南省立眼科醫(yī)院于2015至2017年門診收集，隨后又于其中2個(gè)家系中各發(fā)現(xiàn)1例STGD患者，均經(jīng)由眼底病專家評(píng)估后確診。臨床診斷依據(jù)包括：起病于青少年期；雙眼中心視力進(jìn)行性嚴(yán)重下降，配鏡矯正后無法提高或提高不明顯；黃斑萎縮或營養(yǎng)不良，裂隙燈下表現(xiàn)為擊銅樣眼底或大片萎縮斑；視網(wǎng)膜血管管徑正常；典型的脈絡(luò)膜湮滅造影結(jié)果并不作為必需的診斷依據(jù)，但具有重要的參考價(jià)值[6]。本研究獲患者及監(jiān)護(hù)人的知情、同意。

1.2一般檢查對(duì)所有患者進(jìn)行如下眼科檢查和評(píng)估：采集病史，雙眼驗(yàn)光診斷視力，眼底彩色照相，對(duì)適齡患兒行熒光素鈉眼底血管造影(FFA)，多焦視網(wǎng)膜電圖(mfERG)，光學(xué)相干斷層成像(OCT)。

1.3ABCA4基因篩查、突變定位及驗(yàn)證采集患者及家庭成員外周靜脈血5 mL，封存于EDTA抗凝管中并提取基因組 DNA，構(gòu)建基因組文庫，然后利用邁基諾公司(北京)基因捕獲技術(shù)捕獲與富集ABCA4基因的外顯子及相鄰內(nèi)含子區(qū)域(約50 bp)，質(zhì)量控制后利用高通量測序儀(Illumina Nextseq500)進(jìn)行測序。測序數(shù)據(jù)先去除低質(zhì)量reads、連續(xù)的低質(zhì)量片段和接頭序列，再運(yùn)用BWA軟件與UCSC數(shù)據(jù)庫提供的人類基因組hg19參考序列進(jìn)行比對(duì)，用GATK軟件找出SNP、INDEL突變位點(diǎn)，突變位點(diǎn)用千人基因組、ESP6500、ExAC、邁基諾公司本地正常人數(shù)據(jù)庫、邁基諾公司致病突變數(shù)據(jù)庫、HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行注釋。使用SIFT(http://sift.jcvi.org/)、PolyPhen 2.0(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、mutationmaster(http://www.mutationtaster.org/)預(yù)測突變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。使用Net-Gene2Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)預(yù)測內(nèi)含子與外顯子交界區(qū)堿基改變是否為剪接位點(diǎn)突變。依據(jù)嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)變異進(jìn)行篩選過濾。對(duì)明確或可能與臨床表型相關(guān)的基因變異，采用 Sanger 測序或其他檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行家系分析。

2　結(jié)果

2.1患者基本資料5例患者中，男4例，女1例，年齡9～18歲；1例疑似病例，年齡2歲；父母為非近親婚育，詳細(xì)家族關(guān)系見圖1。5例患者均于學(xué)齡期表現(xiàn)出STGD相關(guān)癥狀，mfERG均表現(xiàn)出異常，基本信息見表1。Ⅱ1，Ⅱ2眼底檢查表現(xiàn)出蔓延至赤道部的后極部斑點(diǎn)，F(xiàn)FA表現(xiàn)為無脈絡(luò)膜背景熒光即暗脈絡(luò)膜背景或脈絡(luò)膜湮沒征。Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ5表現(xiàn)為黃斑萎縮、牛眼樣改變、視網(wǎng)膜變薄及mfERG異常。Ⅱ6年齡尚小，暫未有明顯異常眼底表現(xiàn)。

圖1　3個(gè)STGD家系圖

表1　5例患者及1例疑似患者的基本信息

視力為最佳矯正視力

2.2DNA測序結(jié)果測序結(jié)果(表2)顯示，3個(gè)家系中均檢測到ABCA4基因異常，共檢測到5個(gè)突變，均為復(fù)合雜合突變。測序圖見圖2～4。

表2　3個(gè)家系A(chǔ)BCA4基因的突變形式

A被報(bào)道與STGD相關(guān)，D、E被報(bào)道與視錐-視桿營養(yǎng)不良(Cone-rod dystrophy，CoRD)相關(guān)

圖2　家系F1測序圖

圖3　家系F2測序圖

圖4　家系F3測序圖

家系F1中,Ⅱ1和Ⅱ2存在c.2894A>G和c.101_106del，其父Ⅰ1為c.2894A>G攜帶者，其母Ⅰ2為c.101_106del攜帶者。家系F2中，Ⅱ3和Ⅱ4存在c.5899-2A>G和c.1222C>T，其父Ⅰ3為c.5899-2A>G攜帶者，其母Ⅰ4為c.1222C>T攜帶者。家系F3中，Ⅱ5和Ⅱ6存在c.1982T>G和c.101_106del，其父Ⅰ5為c.1982T>G攜帶者，其母Ⅰ6為c.101_106del攜帶者。

3　討論

ABCA4基因位于1p22，全長約8 kb，含50個(gè)外顯子，cDNA長度為6 705 bp，編碼2 235個(gè)氨基酸，存在于視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞外段的視盤膜中。它編碼由視桿細(xì)胞外節(jié)段表達(dá)的ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCR)。ABCR在視循環(huán)中負(fù)責(zé)將維生素A的中間產(chǎn)物N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺從錐體細(xì)胞外節(jié)盤膜轉(zhuǎn)運(yùn)到外節(jié)胞質(zhì)中，其功能障礙將導(dǎo)致全反式視黃醛在RPE積累，全反式視黃醛會(huì)轉(zhuǎn)化為A2-E，后者是脂褐素的主要組成部分，而脂褐素的毒性會(huì)損害RPE并遮蓋光感受器[10-12]。迄今在ABCA4基因中已發(fā)現(xiàn)近900種突變，在國內(nèi)早前的大樣本研究中，錯(cuò)義突變最多(55.1%)，其次為剪切突變(17.6%)、缺失或插入突變(15.4%)、無義突變(11.8%)[13]。

本研究中5例確診患者均發(fā)現(xiàn)了ABCA4基因突變，其中錯(cuò)義突變2個(gè)，分別為第19外顯子上c.2894A>G(p.N965S)，第14外顯子上c.1982T>G(p.L661R)；剪切突變1個(gè)，為第43外顯子上c.5899-2A>G；缺失突變1個(gè)，為第2外顯子上c.101_106del(p.34_36del)；無義突變1個(gè)，為第9外顯子上c.1222C>T(p.R408X)。以上變異均不屬于多態(tài)性位點(diǎn)，在人群中發(fā)生頻率極低，并導(dǎo)致了ABCR蛋白功能上的改變。p.N965S是已被報(bào)道的與STGD相關(guān)的突變；余4個(gè)為新發(fā)突變，其中p.R408X和p.L661R曾被報(bào)道與CoRD相關(guān)。CoRD亦是一類嚴(yán)重的視網(wǎng)膜變性類遺傳性疾病。ABCA4的變異也被認(rèn)為與其他幾種具有類似臨床表現(xiàn)的黃斑疾病如視網(wǎng)膜色素變性和年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)有關(guān)，這應(yīng)與其較長的基因序列和種族差異有關(guān)[6]。本研究中Ⅱ5之弟Ⅱ6由于年齡小尚未發(fā)現(xiàn)異常，但基因?qū)W分析得知其與Ⅱ5有相同的突變類型，有可能于青少年期表現(xiàn)出STGD癥狀。

已有的有關(guān)的STGD大樣本研究結(jié)果顯示，ABCA4突變的等位基因分散在整個(gè)編碼序列，可能并無熱點(diǎn)突變存在[14-17]。不過一些地區(qū)研究中，部分突變呈現(xiàn)出較高的突變頻率，如南非人群中錯(cuò)義突變p.R602W(8.3%)[18]、歐洲人群中錯(cuò)義突變p.G1961E(20%)[14]、墨西哥人群中錯(cuò)義突變p.A1773V (17%)[19]、非裔美國人中錯(cuò)義突變p.R2107H(19.3%)[20]。在我國，p.Y808X、p.F2188S及p.N965S為檢出率較高的幾個(gè)突變[13]。本研究沒有發(fā)現(xiàn)熱點(diǎn)突變，檢測出4個(gè)新突變位點(diǎn)，擴(kuò)增了ABCA4基因的突變譜，為STGD的分子生物學(xué)研究、遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等提供了參考依據(jù)。

STGD雖然尚無有效的治療方案，但有動(dòng)物研究[21]表明，ABCA4-/-小鼠在黑暗環(huán)境中生長時(shí)幾乎不發(fā)生脂褐素的堆積，提示避免過多光照對(duì)ABCA4基因相關(guān)的STGD患者可能有益。目前以病毒載體為代表的轉(zhuǎn)基因治療在ABCA4-/-小鼠模型上取得了一定成果[22]，治療STGD所用的EIAV慢病毒載體對(duì)人體的安全性和療效尚在觀察中。

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