鄭紫恒，周英發(fā)，任景麗，賈萌萌，黃麗娜，劉淑紅，農(nóng)文志

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450014　2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450014

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率分別位于惡性腫瘤的第2位和第4位[1-2]。散發(fā)性結(jié)直腸癌(sporadic colorectal carcinoma，SCC)約占結(jié)直腸癌總數(shù)的95%[3]，其發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多途徑的復(fù)雜過程，約85%的SCC是由于染色體的變異而導(dǎo)致的，但另有10%～15%的SCC則是由錯配修復(fù)蛋白(mismatch repair protein，MMR)表達缺失而引起的[4]。1993年Lothe等提出了一條新的SCC發(fā)病途徑——錯配修復(fù)途徑，其基本原理是：MMR基因保證了基因復(fù)制的高度保真，MMR基因突變將導(dǎo)致機體MMR蛋白功能的缺失，從而使某些突變的癌基因或抑癌基因在體內(nèi)得到快速聚集，腫瘤由此發(fā)生[5]。在此途徑中，hMLH1、hMSH2和hMSH6這3個MMR基因起主要作用[6-7]。近年來中青年SCC的發(fā)病率明顯升高，其早期發(fā)現(xiàn)與診治成為研究熱點。本研究擬探討hMLH1、hMSH2、hMSH6在中青年SCC患者中的表達情況及對預(yù)后的影響，以期為中青年SCC患者的診療提供依據(jù)。

1　對象與方法

1.1研究對象篩選2009年1月至2012年1月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科保存的SCC術(shù)后的石蠟標本，共96例患者納入本研究?；颊吣挲g25～59(46.8±10.7)歲。納入標準：①納入的患者均經(jīng)術(shù)前病理診斷為SCC，術(shù)后再次行病理檢查證實，病歷資料完整。②病理分期符合美國癌癥聯(lián)合委員會第7版分期標準[8]，均為Ⅰ、Ⅲ期患者。其中Ⅱ期結(jié)腸癌包括以下至少一項高危因素：組織學(xué)分化差(Ⅲ或Ⅳ級)、T4、脈管浸潤、術(shù)前腸梗阻/腸穿孔、標本檢出淋巴結(jié)少于12枚。③化療方案均應(yīng)用FOLFOX方案，化療均于術(shù)后8周內(nèi)開始。排除標準：①Ⅰ期、Ⅳ期SCC患者。②遺傳性結(jié)直腸癌。③術(shù)前進行過放化療。④相關(guān)資料不完整。⑤術(shù)后應(yīng)用其他化療方案治療。

1.2SCC組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達的免疫組化檢測將標本用40 g/L的甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。用PV-9000二步法進行免疫組化染色。一抗為hMLH1、hMSH2、hMSH6鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，用正常的結(jié)直腸黏膜上皮作陽性對照，以磷酸鹽緩沖液替代一抗作陰性對照。

1.3結(jié)果判定hMLH1、hMSH2、hMSH6均定位于細胞核[9]。免疫組化陽性判斷標準參考許良中等[10]制定的《免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標準》，以細胞核出現(xiàn)黃褐色或棕黃色顆粒為hMLH1、hMSH2、hMSH6陽性細胞。①按染色程度進行評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②按陽性細胞所占的比例進行評分：陰性為0分，陽性細胞≤10%為1分，11%～為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。其蛋白兩項評分的乘積>3分判定為該蛋白表達正常，否則判定為表達缺失。以正常的結(jié)直腸黏膜上皮染色結(jié)果作陽性對照。將hMLH1、hMSH2、hMSH6中至少一項蛋白表達缺失判定為MMR蛋白表達缺失(deficient mismatch repair，dMMR)，全部蛋白表達正常定為MMR蛋白表達正常(proficient mismatch repair，pMMR)。

1.4隨訪對術(shù)后的患者每3個月隨訪1次，隨訪方式包括門診及住院復(fù)查、電話隨訪等，對患者的化療方案、有無復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)時間、生存時間等內(nèi)容進行記錄。隨訪時間為17～60個月，隨訪截止日期為2017年2月。無病生存期指患者術(shù)后到腫瘤復(fù)發(fā)(影像學(xué)和相關(guān)檢查等的結(jié)果診斷腫瘤復(fù)發(fā))的時間?？偵嫫谥富颊咝g(shù)后至任何原因?qū)е滤劳龅臅r間。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進行分析，計數(shù)資料比較應(yīng)用χ2檢驗。用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并行Log-rank檢驗，應(yīng)用Cox比例風險模型進行多因素分析，檢驗水準α=0.05。

2　結(jié)果

2.1SCC組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表達情況見圖1。96例標本中，共有27例(28.1%)為dMMR，其中hMLH1表達缺失率20.8%(20/96)，hMSH2表達缺失率為8.3%(8/96)，hMSH6表達缺失率為7.3%(7/96)。僅hMLH1表達缺失16例，僅hMSH2表達缺失2例，僅hMSH6表達缺失2例；hMLH1、hMSH2同時表達缺失2例，hMSH2、hMSH6同時表達缺失3例，hMLH1、hMSH6同時表達缺失1例，hMLH1、hMSH2、hMSH6同時表達缺失1例。

A：hMLH1蛋白；B：hMSH2蛋白；C：hMSH6蛋白；1：表達缺失；2：表達正常圖1　SCC組織中MMR蛋白的表達(IHC，×100)

2.2MMR蛋白的表達與中青年SCC患者臨床病理特征的關(guān)系見表1。與pMMR組相比，dMMR組患者在性別、分化程度、組織學(xué)類型方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在pTNM分期、腫瘤部位、腫瘤大小、大體類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1　dMMR組和pMMR組臨床病理特征比較

續(xù)表1

2.3不同MMR表達狀態(tài)中青年SCC患者預(yù)后的比較96例中青年SCC患者中，dMMR組5 a無病生存率為77.8%(21/27)，高于pMMR組的46.4%(32/69)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.955，P=0.003)。dMMR組的5 a總生存率為85.2%(23/27)，高于pMMR組的49.3%(34/69)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.009，P<0.001)。

2.4影響患者預(yù)后的單因素和多因素分析單因素分析結(jié)果詳見表2。Cox回歸變量賦值見表3。多因素分析顯示：患者MMR狀態(tài)、腫瘤直徑為影響患者無病生存時間的危險因素，MMR狀態(tài)、腫瘤直徑、組織學(xué)類型為影響患者總生存時間的危險因素(P<0.05)，結(jié)果見表4、5。

表2　影響患者預(yù)后的單因素分析

表3　變量賦值表

表4　無病生存時間Cox回歸分析結(jié)果

表5　總生存時間Cox回歸分析結(jié)果

3　討論

MMR基因的功能在于校正基因復(fù)制時出錯的堿基，從而保持基因復(fù)制的準確性，避免基因發(fā)生突變；當細胞發(fā)生變異時，又可以介導(dǎo)其凋亡，避免腫瘤的發(fā)生[11]。當MMR基因發(fā)生突變或者修飾后，堿基錯配得不到糾正，最終影響細胞的正常功能，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[12]。有研究[13-16]顯示，MMR蛋白的表達缺失與微衛(wèi)星不穩(wěn)定( microsatellite instability，MSI)呈明顯正相關(guān)，而MSI的存在則預(yù)示著更好的預(yù)后。近些年，結(jié)直腸癌的發(fā)病趨于年輕化，分析MMR在中青年SCC患者中的作用顯得尤為重要。

本研究結(jié)果顯示，MMR的表達缺失率達28.1%，明顯高于其在SCC中總的表達缺失率(10%～20%)[17]，提示MMR或許是影響結(jié)直腸癌年輕化的一項重要因素。

此前，多項研究[18-20]表明，MMR的表達缺失與腫瘤部位、pTNM分期、分化程度、病理類型相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在中青年SCC患者中，同樣存在類似現(xiàn)象，如MMR在右半結(jié)腸、Ⅱ期、腫瘤直徑≥5 cm、潰瘍型和浸潤型的患者中表達缺失率更高。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，dMMR組的患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例要比pMMR組低，這與韓國國立癌癥中心的Park[21]教授團隊的研究結(jié)果一致，這或許可以解釋dMMR組患者預(yù)后反而更好。

Sinicrope 等[22]回顧性分析了2 580例Ⅲ期SCC患者，應(yīng)用術(shù)后輔助化療的dMMR組患者預(yù)后更好。此外，Sinicrope等[22-23]還認為，以5-FU為基礎(chǔ)的化療可以延長患者的生存期，提高患者5 a生存率。也有一些不同的觀點[24-25]認為，dMMR 患者無法從以5-FU為基礎(chǔ)的化療方案中獲益，對Ⅱ期dMMR 患者甚至有害。關(guān)于MMR影響SCC患者預(yù)后的機制，眾多學(xué)者對其有不同的看法。Scarpa等[26]認為，MLH1、MSH2和MSH6的缺失增強了SCC患者的免疫監(jiān)視功能。Wendum等[27]則認為，這可能與血管內(nèi)皮生長因子水平和微血管密度有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，dMMR同樣是中青年SCC患者預(yù)后的生物學(xué)指標。dMMR組的5 a無病生存率及總生存率均高于pMMR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這與Tournigand等[28]的研究結(jié)論一致。因此，對于中青年具有高危因素的Ⅱ期及Ⅲ期SCC患者，建議應(yīng)進行術(shù)后輔助化療。單因素和多因素回歸分析顯示，MMR狀態(tài)為影響患者預(yù)后的危險因素?？紤]到pTNM分期和組織學(xué)類型可能會影響到患者的預(yù)后，因此將他們同樣納入多因素分析，結(jié)果顯示：pTNM分期與患者的預(yù)后無關(guān)；組織學(xué)類型不會影響患者的無病生存時間，而會影響患者的總生存時間。

本項研究的優(yōu)點主要有：①化療方案的選擇，既往研究多以5-FU單藥或聯(lián)合亞葉酸鈣治療，或化療方案不固定，而本研究納入的患者則均應(yīng)用FOLFOX方案，故作者認為加入奧沙利鉑可能有助于消除5-FU對患者的消極影響。②納入標準嚴格，納入的患者均為中青年Ⅱ和Ⅲ期SCC患者，且Ⅱ期患者具有至少一項高危因素。本研究的不足之處在于樣本量仍然較少，亞組分析時病例數(shù)更少，有待大樣本驗證上述結(jié)論。

綜上所述，中青年SCC患者MMR蛋白的表達狀態(tài)與其臨床病理特征及預(yù)后有明顯的相關(guān)性，MMR表達缺失更多見于Ⅱ期、右半結(jié)腸、腫瘤直徑≥5 cm、潰瘍型和浸潤型、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者；MMR狀態(tài)為影響患者預(yù)后的危險因素。

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