秦　潔，馬　丹，李　珠，孫石磊，楊　靖，史長(zhǎng)河，宋　波，許予明

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

腦卒中嚴(yán)重威脅人類健康, 是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡的第二大因素[1-2]。腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是腦卒中患者發(fā)病和死亡的主要原因之一，病死率為30%～50%，并且近75%的幸存者1 a后不能獨(dú)立生活[3]。針對(duì)ICH，現(xiàn)有的臨床治療手段主要是對(duì)癥支持治療(如降低血壓、顱內(nèi)壓力或外科手術(shù)治療等)，治療效果有限[4]。同時(shí)，ICH的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜,目前仍不非常明確[5]。越來(lái)越多的證據(jù)[6-7]表明ICH急性期免疫炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性腦損傷中起重要作用，但臨床上尚缺乏針對(duì)ICH繼發(fā)性腦損傷的免疫調(diào)節(jié)干預(yù)方法。研究[8-9]表明誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells derived neural stem cells, iPSC-NSCs)具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，能全面改善ICH預(yù)后。已有研究[10]證實(shí)IL-6可促進(jìn)炎癥反應(yīng)和加重腦水腫，而TGF-β1則具有強(qiáng)大的免疫抑制作用。目前關(guān)于IL-6和TGF-β1在ICH后血腫組織周圍表達(dá)水平的研究很少。本研究旨在探討腦立體定向注射iPSC-NSCs對(duì)早期ICH模型大鼠神經(jīng)功能及腦血腫周圍組織中IL-6和TGF-β1表達(dá)的影響，為ICH的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物和細(xì)胞動(dòng)物：選取清潔級(jí)雄性SD大鼠84只(250～300 g)，均購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(批號(hào):41003100004315)，大鼠的飼養(yǎng)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)過(guò)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；細(xì)胞：大鼠iPSC由上海生命科學(xué)研究院肖磊研究員建立并提供，經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)分化為iPSC-NSCs。

1.2主要試劑和儀器DMEM、DMEM/F12、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液(HyClone公司)，氯胺酮、基質(zhì)膠、Ⅶ型膠原酶(Sigma公司)，大鼠腦立體定位儀(Narishige SN-3公司)，倒置顯微鏡(LEICA公司)，IL-6、TGF-β1 ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司)，酶標(biāo)檢測(cè)儀(BioTeK公司)，電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.3動(dòng)物分組及模型制作選取84只SD雄性大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組28只(采用立體定位儀僅定位穿刺，不注射Ⅶ型膠原酶和PBS溶液)、對(duì)照組28只(采用立體定位儀定位穿刺并注射Ⅶ型膠原酶，ICH后4～6 h在鑒定造模成功后注射PBS溶液)、實(shí)驗(yàn)組28只(采用立體定位儀定位穿刺注射Ⅶ型膠原酶，ICH后4～6 h在鑒定造模成功后，經(jīng)腦立體定位注射含iPSC-NSCs的PBS溶液)。模型制作方法[7]：腹腔注射30 mg/kg氯胺酮麻醉SD大鼠，麻醉滿意后將大鼠俯臥位固定在大鼠腦立體定位儀上，取大鼠左側(cè)紋狀體為定位點(diǎn)，選取前囟后0.5 mm，左側(cè)旁開(kāi)3.5 mm，垂直進(jìn)針5.5 mm。以10 μL微量進(jìn)樣器緩慢注入0.5 U Ⅶ型膠原酶溶液，留針10 min，之后緩慢退針。針退出后，清潔創(chuàng)面，縫合頭皮。模型成功的判定：術(shù)后大鼠完全蘇醒后，采用mNSS評(píng)分對(duì)ICH模型大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)估，mNSS評(píng)分>6分，且灌注區(qū)腦組織可見(jiàn)血腫形成，即為造模成功，選取mNSS 8～12分的ICH模型大鼠。神經(jīng)功能缺損癥狀過(guò)輕無(wú)明顯癥狀或過(guò)重出現(xiàn)意識(shí)障礙、移動(dòng)困難或死亡的棄去，重新造模補(bǔ)入。

1.4iPSC-NSCs的培養(yǎng)在預(yù)鋪C57/BL6小鼠胚胎成纖維細(xì)胞條件下傳代培養(yǎng)iPSC，經(jīng)差速貼壁法去除滋養(yǎng)層細(xì)胞，用擬胚體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)iPSC形成擬胚體，經(jīng)全反式維甲酸誘導(dǎo)分化為iPSC-NSCs, 用NSC培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)iPSC-NSCs, 經(jīng)3～5 d連續(xù)傳代培養(yǎng)2次后得到第3代iPSC-NSCs。將生長(zhǎng)良好的第3代iPSC-NSCs 培養(yǎng)直至達(dá)到所需移植細(xì)胞數(shù)(105μL-1)，在ICH后4～6 h將iPSC-NSCs立體定向注入ICH模型大鼠腦內(nèi)。

1.5ICH模型大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分各組選10只ICH模型大鼠分別在術(shù)后第1、3、7、14和28天進(jìn)行mNSS評(píng)分。

1.6腦血腫周圍組織中IL-6、TGF-β1水平的測(cè)定

造模后分別在第1、3、7天，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6只大鼠，麻醉滿意后斷頭取腦組織標(biāo)本，全部標(biāo)本均以冰箱凍存。用ELISA法檢測(cè)各組大鼠腦血腫周圍組織中IL-6及TGF-β1。首先準(zhǔn)確稱取腦組織，加入生理鹽水，在冰水浴條件下機(jī)械勻漿，制備成勻漿液，2 500～3 000 r/min離心10 min，取上清液，然后采用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，各孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品100 μL，封板膜封板，37 ℃孵育90 min，甩去孔內(nèi)液體。每孔加入生物素化抗體工作液100 μL，封板膜封板，37 ℃孵育60 min，甩板并洗板3次；每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，封板膜封板，37 ℃孵育30 min，甩板并洗板3次；每孔加底物溶液(TMB)90 μL，封板膜封板，37 ℃避光孵育15 min左右。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。最后以標(biāo)準(zhǔn)品孔OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3組間IL-6和TGF-β1表達(dá)量的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1iPSC-NSCs腦立體定向注射對(duì)ICH模型大鼠神經(jīng)功能的影響假手術(shù)組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀；對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠在造模4～6 h蘇醒后即出現(xiàn)對(duì)側(cè)肢體癱瘓等神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，其癥狀、體征于術(shù)后第1天達(dá)到高峰，持續(xù)至第3天左右，而后隨時(shí)間推移神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)。與對(duì)照組大鼠相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠在造模術(shù)后第14天起評(píng)分較低，這一效果持續(xù)至第28天(圖1)。

圖1　3組大鼠mNSS評(píng)分比較

2.2iPSC-NSCs腦立體定向注射對(duì)ICH模型大鼠腦血腫周圍組織中IL-6表達(dá)水平的影響見(jiàn)表1。

表1　3組大鼠腦血腫周圍組織中IL-6的表達(dá)　ng/L

F組間=133.290，F(xiàn)時(shí)間=524.720，F(xiàn)交互=82.142，P均<0.001

2.3iPSC-NSCs腦立體定向注射對(duì)ICH模型大鼠腦血腫周圍組織中TGF-β1表達(dá)水平的影響見(jiàn)表2。

表2　3組大鼠腦血腫周圍組織中TGF-β1的表達(dá)　ng/L

F組間=43.121，P<0.001；F時(shí)間=8.532，P=0.001；F交互=57.957，P<0.001

3　討論

ICH是嚴(yán)重的腦卒中亞型，具有發(fā)病率、病死率、復(fù)發(fā)率和致殘率“四高”的特點(diǎn)[3,5]。研究[11]表明急性ICH可激活免疫系統(tǒng)釋放大量的炎癥介質(zhì)，引起腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，在ICH后的繼發(fā)性腦損傷中起著重要的作用。急性腦血管病患者病情嚴(yán)重程度與其免疫功能存在一定聯(lián)系，隨著病情加重，機(jī)體免疫功能處于低下或抑制狀態(tài)[12]。研究[13]顯示，干細(xì)胞移植可減輕炎癥反應(yīng)、減少神經(jīng)元的死亡、減輕瘢痕形成和促進(jìn)腦白質(zhì)的功能再塑，成為ICH模型治療中有應(yīng)用前景的選擇之一。本研究中實(shí)驗(yàn)組腦立體定向注射iPSC-NSCs后第14和28天神經(jīng)功能評(píng)分均優(yōu)于對(duì)照組，從行為學(xué)上表明iPSC-NSCs移植在ICH大鼠中可產(chǎn)生腦保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，但其作用機(jī)制尚不明確。

ICH急性期血腫周圍組織迅速發(fā)生炎癥反應(yīng)并表達(dá)多種細(xì)胞因子，其中比較重要的炎癥介質(zhì)有IL-6和TGF-β1。有學(xué)者[14]已證實(shí)這些炎性因子的濃度與ICH的嚴(yán)重程度及預(yù)后有密切關(guān)系。

IL-6 是一種多功能細(xì)胞因子，具有多種生物效應(yīng)。目前關(guān)于IL-6與缺血性腦損傷的研究較多，但有關(guān)IL-6與ICH的研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICH后大鼠腦血腫周圍組織中IL-6的表達(dá)大量增加，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在腦立體定向注射iPSC-NSCs后，IL-6的表達(dá)下降，同時(shí)大鼠神經(jīng)功能也得到改善，表明IL-6 參與ICH的炎癥反應(yīng)過(guò)程，腦組織中IL-6 濃度升高可能與ICH預(yù)后不良有關(guān)。

TGF-β1可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型，延緩神經(jīng)元死亡，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞通過(guò)SMAD2和SMAD3信號(hào)通路促進(jìn)傷口愈合，維持免疫耐受，是最有可能的免疫“調(diào)解員”[11]。研究[15]表明，在小鼠腦缺血模型中，TGF-β1能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可顯著增強(qiáng)腦梗死后小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，但TGF-β1在ICH中的作用尚不明確。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組大鼠相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠在iPSC-NSCs腦立體定向注射后腦組織中TGF-β1的表達(dá)顯著上升，且大鼠神經(jīng)功能得到改善，表明TGF-β1可以抑制ICH后的炎癥反應(yīng)進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元。研究[11]表明急性ICH患者血清中 TGF-β1水平明顯降低，但未明確原因。本研究結(jié)果表明有大量的TGF-β1在腦血腫周圍組織中富集, 可能是血清中水平降低的原因之一。

綜上所述，腦立體定向注射iPSC-NSCs可明顯改善ICH模型大鼠的神經(jīng)功能，其機(jī)制可能為iPSC-NSCs可調(diào)節(jié)大鼠腦內(nèi)主要促炎因子IL-6及抑炎因子TGF-β1的表達(dá)，繼而下調(diào)炎癥反應(yīng)誘發(fā)的急性ICH后繼發(fā)性腦損傷。

[1] KIM JY,BAE HJ.Spontaneous intracerebral hemorrhage: management[J].J Stroke,2017,19(1):28

[2] 孟凡祥.某醫(yī)院腦卒中患者發(fā)病影響因素調(diào)查[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2016,34(2):272

[3] KLEBE D,MCBRIDE D,FLORES JJ,et al.Modulating the immune response towards a neuroregenerative peri-injury milieu after cerebral hemorrhage[J].J Neuroimmune Pharmacol,2015,10(4):576

[4] GUAN J,HAWRYLUK GW.Targeting secondary hematoma expansion in spontaneous intracerebral hemorrhage:state of the art[J].Front Neurol,2016,7:187

[5] CORDEIRO MF,HORN AP.Stem cell therapy in intracerebral hemorrhage rat model[J].World J Stem Cells,2015,7(3):618

[6] ZHOU Y,WANG Y,WANG J,et al.Inflammation in intracerebral hemorrhage: from mechanisms to clinical translation[J].Prog Neurobiol,2014,115:25

[7] QIN J,MA X,QI HY,et al.Transplantation of induced pluripotent stem cells alleviates cerebral inflammation and neural damage in hemorrhagic stroke[J].PLoS One,2015,10(6):e129881

[8] MA X,QIN J,SONG B,et al.Stem cell-based therapies for intracerebral hemorrhage in animal model: a meta-analysis[J].Neurol Sci,2015,36(8):1311

[9] GAO L,LU Q,HUANG LJ,et al.Transplanted neural stem cells modulate regulatory T, gamma delta T cells and corresponding cytokines after intracerebral hemorrhage in rats[J].Int J Mol Sci,2014,15(3):4431

[10]MARTINEZ FO,GORDON S.The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment[J].F1000Prime Rep,2014,6:13

[11]TAYLOR RA,CHANG CF,GOODS BA,et al.TGF-β1 modulates microglial phenotype and promotes recovery after intracerebral hemorrhage[J].J Clin Invest,2017,127(1):280

[12]WANG H,YAN FL,CUNNINGHAM M,et al.Potential specific immunological indicators for stroke associated infection are partly modulated by sympathetic pathway activation[J].Oncotarget,2016,7(32):52404

[13]OTTOBONI L,MERLINI A,MARTINO G.Neural stem cell plasticity:advantages in therapy for the injured central nervous system[J].Front Cell Dev Biol,2017,5:52

[14]張弢.血清炎性因子水平在急性腦出血惡化的預(yù)測(cè)價(jià)值[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2014,18(7):1077

[15]CEKANAVICIUTE E,FATHALI N,DOYLE KP,et al.Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice[J].Glia,2014,62(8):1227