GST pull-down方法尋找組蛋白去乙?；傅幕プ鞯鞍籽芯?/h1>
2018-04-02 06:56宮艷超張薈趙偉偉
天津化工 2018年1期
宮艷超，張薈，趙偉偉
（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與環(huán)境工程系，天津300402）
蛋白質(zhì)的翻譯后修飾與基因轉(zhuǎn)錄有著密切的關(guān)系，其中，蛋白質(zhì)的乙?；c去乙酰化修飾是由組蛋白去乙?；福℉DACs）和組蛋白乙酰化酶（HAT）協(xié)同調(diào)控的。它們通過(guò)調(diào)節(jié)賴氨酸殘基末端的電荷狀態(tài)，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[1]。
目前，組蛋白去乙酰化酶根據(jù)其與酵母同源物被分為四種類型[2,3]。I型HDACs成員包括HDAC 1，HDAC 2，HDAC 3，HDAC 8，與酵母 Rpd3 同源，長(zhǎng)度是350～500個(gè)氨基酸，主要位于細(xì)胞核中；II型HDACs成員包括：IIa類，HDAC 4，HDAC 5，HDAC 7和 HDAC 9；IIb 類，HDAC 6 和 HDAC 10，與酵母Hda1同源；IV型成員主要包括HDAC11，主要是酶活中心與I型、II型不同，也是Zn2+依賴型的水解酶[4]。HDAC與多種人類重大疑難疾病密切相關(guān)，包括癌癥、心臟疾病、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病等[5]。
本研究選擇I類HDAC成員HDAC8作為研究對(duì)象，采用GST pull-down的方法尋找組蛋白去乙酰化酶的互作蛋白[6]。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)中所用的HDAC8質(zhì)粒pGEX-6p-1-hHDAC8由實(shí)驗(yàn)室保存，用于質(zhì)粒擴(kuò)增的菌株E.coli trans 5α（DH 5α）感受態(tài)細(xì)胞和用于表達(dá)蛋白的菌株BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)買于全式金生物技術(shù)有限公司，所用細(xì)胞株Hela細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室凍存。
1.2 儀器與試劑
Millipore型純水儀（蘇州賽恩斯儀器有限公司）、BS124S天平（德國(guó) Sartorius）、YC-2層析實(shí)驗(yàn)冷柜（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、AKTA蛋白純化儀（通用醫(yī)療生命科學(xué)上海有限公司）、Hitrap Q離子交換柱（通用醫(yī)療生命科學(xué)上海有限公司）、Superdex 200分子篩柱（通用醫(yī)療生命科學(xué)上海有限公司）、還原型谷胱甘肽（上海生工生物工程有限公司）、氯化鈉（上海生工生物工程有限公司）、胰蛋白胨（上海生工生物工程有限公司）、酵母粉（上海生工生物工程有限公司）
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 pGEX-6p-1-hHDAC8的表達(dá)純化
取20μL HDAC8蛋白甘油菌于5 mL含氨芐(100 mg/L LB)液體培養(yǎng)基中，37℃220 rpm振蕩培養(yǎng)12 h。次日將過(guò)夜培養(yǎng)菌加入1 L LB液體培養(yǎng)基（含氨芐 100 mg/L）中，于 37℃振蕩培養(yǎng)，4～6 h后加入0.4 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)16℃培養(yǎng)18 h后收取菌體。取6 L收集好的溶解在平衡液中的菌體，待其解凍，在冰浴中超聲破碎40%功率，超4 s，停6 s，30 min，每隔10 min將菌液攪拌均勻，最后將超聲好的菌液放到高速離心管里，18000 rpm 4℃離心40 min，保留上清，棄去沉淀。
使用GST-HDAC8平衡緩沖液平衡GST柱三次，每次一到兩個(gè)柱體積，放于4℃。將高速所得的菌液上清流經(jīng)GST柱三遍，用高低鹽洗雜緩沖液進(jìn)行交替洗雜，取20 μL的洗雜液和80 μL的G250混合，直至G250不變藍(lán)，洗雜結(jié)束，然后用2×GSH洗脫目的蛋白。取20 μL的洗脫液和80 μL的G250混合，直至G250不變藍(lán)，洗脫結(jié)束，用10 KD的濃縮管將GST-HDAC8蛋白濃縮到小體積，備用。
離子交換層析（Hitrap Q柱），按系統(tǒng)操作執(zhí)行進(jìn)行洗泵，結(jié)束后將泵頭A、B分別放入到抽濾過(guò)的His-HDAC8離子交換低鹽緩沖液和GST-HDAC8離子交換高鹽緩沖液中。設(shè)置流速，接離子柱，高低鹽各處理離子柱三次，最后用緩沖液平衡離子柱。上樣，待樣品進(jìn)入系統(tǒng)內(nèi)后，將模式由Inject改為L(zhǎng)oad。用0%～50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的GST-HDAC8離子交換高鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，1 mL/tube進(jìn)行適當(dāng)收集。SDS-PAGE跑膠鑒定。
凝膠過(guò)濾層析（Superdex 200），按系統(tǒng)操作執(zhí)行進(jìn)行洗泵，結(jié)束后將泵頭A、B放入到抽濾過(guò)的GST-HDAC8分子篩緩沖液中。設(shè)置流速，接柱，用GST-HDAC8分子篩緩沖液平衡Superdex 200。上樣，收集0.5 mL/tube。SDS-PAGE跑膠鑒定。
1.3.2 GST pull-down的方法尋找互作蛋白
Hela細(xì)胞的收集與裂解，刮下細(xì)胞，離心，冰PBS清洗三次，置于冰上。用RIPA裂解液，取適量加入細(xì)胞中冰上裂解30 min，離心，取上清備用。GST-HDAC8和GST標(biāo)簽蛋白的固化，介質(zhì)混勻。取200 μL介質(zhì)懸液分別于至1.5 mL EP管中，標(biāo)為A、B管，4000 rmp離心5 min，小心棄掉上清。洗雜。重復(fù)以上步驟3次。根據(jù)蛋白定量將等量的GST-HDAC8蛋白和GST標(biāo)簽蛋白移入預(yù)冷的裝有谷胱甘肽介質(zhì)的A、B管中，4℃，旋轉(zhuǎn)結(jié)合3h。取出EP管，小心棄掉上清。往EP管中加入1 mL PBS，輕輕顛倒混勻，4℃，4000 rmp離心 5 min，小心棄掉上清。按1:500的比例加入Hela細(xì)胞的總蛋白裂解液，輕輕顛倒混勻，4℃，結(jié)合12 h。次日，用2×GSH將融合蛋白洗脫，各步驟取樣跑膠，質(zhì)譜鑒定。
2 結(jié)果與討論
2.1 pGEX-6p-1-hHDAC8的表達(dá)純化
本實(shí)驗(yàn)將pGEX-6p-1-hHDAC8蛋白，經(jīng)超聲破碎前后，分別取全菌、上清、沉淀、穿透、洗雜、洗雜后的柱料、洗脫、洗脫后的柱料的樣，洗脫步驟可以完全洗脫下目的蛋白，幾乎無(wú)目的蛋白殘留于柱料上，pGEX-6p-1-hHDAC8蛋白的親和層析各步驟的結(jié)果如圖1。
結(jié)果如下：由于HDAC8蛋白與GST融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量是67 KD左右，所以由親和層析圖可以看出，HDAC8融合蛋白出現(xiàn)在洗脫樣品中，可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。我們將洗脫液經(jīng)過(guò)換buffer之后濃縮到1.5 mL，采用陰離子交換柱Hitrap Q進(jìn)行純化，平衡離子柱用低鹽緩沖液，蛋白洗脫將鹽濃度由0 mM拉至500 mM NaCl，初期的上樣過(guò)程蛋白有穿透峰，當(dāng)電導(dǎo)為24 mS/cm左右時(shí)，即開始出現(xiàn)目的蛋白峰，如圖2，SDS-PAGE結(jié)果顯示34管-46管均為目的蛋白，取37-46管進(jìn)行下一步純化，如圖3。
圖2pGEX-6p-1-hHDAC8 Hitrap Q陰離子交換峰形圖
圖3pGEX-6p-1-hHDAC8 Hitrap Q陰離子交換SDS-PAGE結(jié)果
取第37～46管用10 KD濃縮管進(jìn)行濃縮，濃縮到500 μL左右的時(shí)候，使用Superdex 200進(jìn)行進(jìn)一步的純化，平衡Superdex 200，保持離子濃度在150 mM NaCl，上樣，洗脫，從10 mL到13 mL出現(xiàn)了雜峰，14 mL左右開始出現(xiàn)目的蛋白峰，峰形單一對(duì)稱，按照峰寬收集蛋白跑膠，如圖4，SDS-PAGE結(jié)果顯示 14～26 管均為目的蛋白 HDAC8（67 KDa），取第18～26管進(jìn)行濃縮，-80℃?zhèn)溆谩?/p>
圖4 pGEX-6p-1-hHDAC8 Superdex 200分子篩峰形圖
2.2 GST標(biāo)簽蛋白的純化
本實(shí)驗(yàn)將GST標(biāo)簽蛋白，經(jīng)超聲破碎前后，分別取全菌、上清、沉淀、穿透、洗雜、洗雜后的柱料、洗脫、洗脫后的柱料的樣，洗脫步驟可以完全洗脫下目的蛋白，幾乎無(wú)目的蛋白殘留于柱料上，GST標(biāo)簽蛋白的親和層析各步驟的結(jié)果如圖6。白，取2-32管進(jìn)行下一步純化備用，如圖8。
圖5pGEX-6p-1-hHDAC8 Superdex 200分子篩SDS-PAGE結(jié)果
圖6GST標(biāo)簽蛋白親和層析SDS-PAGE結(jié)果
圖7 GST標(biāo)簽蛋白hitrap Q陰離子交換峰形圖
結(jié)果如下：由于GST蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量25 KD左右，所以由親和層析圖可以看出，GST蛋白出現(xiàn)在洗脫樣品中，可以進(jìn)行下一步的離子交換實(shí)驗(yàn)如圖7。SDS-PAGE結(jié)果顯示2-32管均為目的蛋
圖8 GST標(biāo)簽蛋白hitrap Q陰離子交換SDS-PAGE結(jié)果
2.3 GST pull-down的方法尋找互作蛋白
本實(shí)驗(yàn)將GST pull-down各個(gè)步驟取樣，SDSPAGE跑膠，結(jié)果如圖9。
圖9GST pull-down尋找HDAC8互作蛋白
將樣品GST-HDAC8+全細(xì)胞的樣進(jìn)行質(zhì)譜送樣，結(jié)果如圖10。
圖10GST pull-down尋找HDAC8互作蛋白質(zhì)譜結(jié)果圖
我們除了發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中報(bào)道的蛋白，還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的蛋白，如糖代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用的烯醇酶ENO1，第一次驗(yàn)證了ENO1可能作為HDAC8復(fù)合物發(fā)揮作用過(guò)程中的其中之一蛋白。
3 結(jié)論
我們開展了GST pull-down實(shí)驗(yàn)，GST pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中報(bào)道的蛋白，還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的蛋白，如糖代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用的烯醇酶ENO1，第一次驗(yàn)證了ENO1可能作為HDAC8復(fù)合物發(fā)揮作用過(guò)程中的其中之一蛋白。與其他尋找HDAC8互作蛋白的方法相比較，作為參照與互補(bǔ)，GST pull-down實(shí)驗(yàn)存在的缺點(diǎn)，主要是因?yàn)镚ST標(biāo)簽蛋白占據(jù)了HDAC8蛋白的表位，影響了酶的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，造成假陰性和假陽(yáng)性的結(jié)果，我們將在今后提出方法模擬酶過(guò)渡態(tài)設(shè)計(jì)的底物抑制劑分子，一方面，抑制劑分子占據(jù)了酶活中心，沒(méi)有占據(jù)其它位點(diǎn)，不影響酶的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；另一方面，該抑制劑分子和HDAC8的結(jié)合模擬了底物與酶結(jié)合的過(guò)程，使“抓取”到的互作蛋白結(jié)果更加可靠，本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)pull-down發(fā)現(xiàn)一些未被發(fā)現(xiàn)的互作蛋白，同時(shí)，可以將此方法平移到其它HDAC亞型。
ENO1是發(fā)現(xiàn)的未知互作蛋白，我們后期再通過(guò)“凸凹互補(bǔ)”的親和柱實(shí)驗(yàn)繼續(xù)驗(yàn)證此類蛋白，是否與HDAC8存在互作關(guān)系。
參考文獻(xiàn)：
[1]Berger S L.The complex language of chromatin regulation during transcription[J].Nature,2007,447(7143):407-412.
[2]De Ruijter A J,Van Gennip A H,Caron H N,et al.Histone deacet?ylases(HDACs):characterization of the classical HDAC family[J].Biochemical Journal,2003,370(3):737-749.
[3]Gregoretti I,Lee Y-M,Goodson H V.Molecular evolution of the histone deacetylase family:functional implications of phylogenetic analysis[J].Journal of molecular biology,2004,338(1):17-31.
[4]Fischle W,Kiermer V,Dequiedt F,et al.The emerging role of class II histone deacetylases[J].Biochemistry and Cell Biology,2001,79(3):337-348.
[5]柴政斌，張更林，韓金祥．GST pull-down技術(shù)在研究蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用[J]．中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013．
[6]王學(xué)政，張更林，崔亞洲，等．牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1功能片段的融合表達(dá)及細(xì)胞定位[J]．中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013；26(4)：491-494．
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目前，組蛋白去乙酰化酶根據(jù)其與酵母同源物被分為四種類型[2,3]。I型HDACs成員包括HDAC 1，HDAC 2，HDAC 3，HDAC 8，與酵母 Rpd3 同源，長(zhǎng)度是350～500個(gè)氨基酸，主要位于細(xì)胞核中；II型HDACs成員包括：IIa類，HDAC 4，HDAC 5，HDAC 7和 HDAC 9；IIb 類，HDAC 6 和 HDAC 10，與酵母Hda1同源；IV型成員主要包括HDAC11，主要是酶活中心與I型、II型不同，也是Zn2+依賴型的水解酶[4]。HDAC與多種人類重大疑難疾病密切相關(guān)，包括癌癥、心臟疾病、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病等[5]。
本研究選擇I類HDAC成員HDAC8作為研究對(duì)象，采用GST pull-down的方法尋找組蛋白去乙酰化酶的互作蛋白[6]。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)中所用的HDAC8質(zhì)粒pGEX-6p-1-hHDAC8由實(shí)驗(yàn)室保存，用于質(zhì)粒擴(kuò)增的菌株E.coli trans 5α（DH 5α）感受態(tài)細(xì)胞和用于表達(dá)蛋白的菌株BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)買于全式金生物技術(shù)有限公司，所用細(xì)胞株Hela細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室凍存。
1.2 儀器與試劑
Millipore型純水儀（蘇州賽恩斯儀器有限公司）、BS124S天平（德國(guó) Sartorius）、YC-2層析實(shí)驗(yàn)冷柜（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、AKTA蛋白純化儀（通用醫(yī)療生命科學(xué)上海有限公司）、Hitrap Q離子交換柱（通用醫(yī)療生命科學(xué)上海有限公司）、Superdex 200分子篩柱（通用醫(yī)療生命科學(xué)上海有限公司）、還原型谷胱甘肽（上海生工生物工程有限公司）、氯化鈉（上海生工生物工程有限公司）、胰蛋白胨（上海生工生物工程有限公司）、酵母粉（上海生工生物工程有限公司）
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 pGEX-6p-1-hHDAC8的表達(dá)純化
取20μL HDAC8蛋白甘油菌于5 mL含氨芐(100 mg/L LB)液體培養(yǎng)基中，37℃220 rpm振蕩培養(yǎng)12 h。次日將過(guò)夜培養(yǎng)菌加入1 L LB液體培養(yǎng)基（含氨芐 100 mg/L）中，于 37℃振蕩培養(yǎng)，4～6 h后加入0.4 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)16℃培養(yǎng)18 h后收取菌體。取6 L收集好的溶解在平衡液中的菌體，待其解凍，在冰浴中超聲破碎40%功率，超4 s，停6 s，30 min，每隔10 min將菌液攪拌均勻，最后將超聲好的菌液放到高速離心管里，18000 rpm 4℃離心40 min，保留上清，棄去沉淀。
使用GST-HDAC8平衡緩沖液平衡GST柱三次，每次一到兩個(gè)柱體積，放于4℃。將高速所得的菌液上清流經(jīng)GST柱三遍，用高低鹽洗雜緩沖液進(jìn)行交替洗雜，取20 μL的洗雜液和80 μL的G250混合，直至G250不變藍(lán)，洗雜結(jié)束，然后用2×GSH洗脫目的蛋白。取20 μL的洗脫液和80 μL的G250混合，直至G250不變藍(lán)，洗脫結(jié)束，用10 KD的濃縮管將GST-HDAC8蛋白濃縮到小體積，備用。
離子交換層析（Hitrap Q柱），按系統(tǒng)操作執(zhí)行進(jìn)行洗泵，結(jié)束后將泵頭A、B分別放入到抽濾過(guò)的His-HDAC8離子交換低鹽緩沖液和GST-HDAC8離子交換高鹽緩沖液中。設(shè)置流速，接離子柱，高低鹽各處理離子柱三次，最后用緩沖液平衡離子柱。上樣，待樣品進(jìn)入系統(tǒng)內(nèi)后，將模式由Inject改為L(zhǎng)oad。用0%～50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的GST-HDAC8離子交換高鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，1 mL/tube進(jìn)行適當(dāng)收集。SDS-PAGE跑膠鑒定。
凝膠過(guò)濾層析（Superdex 200），按系統(tǒng)操作執(zhí)行進(jìn)行洗泵，結(jié)束后將泵頭A、B放入到抽濾過(guò)的GST-HDAC8分子篩緩沖液中。設(shè)置流速，接柱，用GST-HDAC8分子篩緩沖液平衡Superdex 200。上樣，收集0.5 mL/tube。SDS-PAGE跑膠鑒定。
1.3.2 GST pull-down的方法尋找互作蛋白
Hela細(xì)胞的收集與裂解，刮下細(xì)胞，離心，冰PBS清洗三次，置于冰上。用RIPA裂解液，取適量加入細(xì)胞中冰上裂解30 min，離心，取上清備用。GST-HDAC8和GST標(biāo)簽蛋白的固化，介質(zhì)混勻。取200 μL介質(zhì)懸液分別于至1.5 mL EP管中，標(biāo)為A、B管，4000 rmp離心5 min，小心棄掉上清。洗雜。重復(fù)以上步驟3次。根據(jù)蛋白定量將等量的GST-HDAC8蛋白和GST標(biāo)簽蛋白移入預(yù)冷的裝有谷胱甘肽介質(zhì)的A、B管中，4℃，旋轉(zhuǎn)結(jié)合3h。取出EP管，小心棄掉上清。往EP管中加入1 mL PBS，輕輕顛倒混勻，4℃，4000 rmp離心 5 min，小心棄掉上清。按1:500的比例加入Hela細(xì)胞的總蛋白裂解液，輕輕顛倒混勻，4℃，結(jié)合12 h。次日，用2×GSH將融合蛋白洗脫，各步驟取樣跑膠，質(zhì)譜鑒定。
2 結(jié)果與討論
2.1 pGEX-6p-1-hHDAC8的表達(dá)純化
本實(shí)驗(yàn)將pGEX-6p-1-hHDAC8蛋白，經(jīng)超聲破碎前后，分別取全菌、上清、沉淀、穿透、洗雜、洗雜后的柱料、洗脫、洗脫后的柱料的樣，洗脫步驟可以完全洗脫下目的蛋白，幾乎無(wú)目的蛋白殘留于柱料上，pGEX-6p-1-hHDAC8蛋白的親和層析各步驟的結(jié)果如圖1。
結(jié)果如下：由于HDAC8蛋白與GST融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量是67 KD左右，所以由親和層析圖可以看出，HDAC8融合蛋白出現(xiàn)在洗脫樣品中，可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。我們將洗脫液經(jīng)過(guò)換buffer之后濃縮到1.5 mL，采用陰離子交換柱Hitrap Q進(jìn)行純化，平衡離子柱用低鹽緩沖液，蛋白洗脫將鹽濃度由0 mM拉至500 mM NaCl，初期的上樣過(guò)程蛋白有穿透峰，當(dāng)電導(dǎo)為24 mS/cm左右時(shí)，即開始出現(xiàn)目的蛋白峰，如圖2，SDS-PAGE結(jié)果顯示34管-46管均為目的蛋白，取37-46管進(jìn)行下一步純化，如圖3。
圖2pGEX-6p-1-hHDAC8 Hitrap Q陰離子交換峰形圖
圖3pGEX-6p-1-hHDAC8 Hitrap Q陰離子交換SDS-PAGE結(jié)果
取第37～46管用10 KD濃縮管進(jìn)行濃縮，濃縮到500 μL左右的時(shí)候，使用Superdex 200進(jìn)行進(jìn)一步的純化，平衡Superdex 200，保持離子濃度在150 mM NaCl，上樣，洗脫，從10 mL到13 mL出現(xiàn)了雜峰，14 mL左右開始出現(xiàn)目的蛋白峰，峰形單一對(duì)稱，按照峰寬收集蛋白跑膠，如圖4，SDS-PAGE結(jié)果顯示 14～26 管均為目的蛋白 HDAC8（67 KDa），取第18～26管進(jìn)行濃縮，-80℃?zhèn)溆谩?/p>
圖4 pGEX-6p-1-hHDAC8 Superdex 200分子篩峰形圖
2.2 GST標(biāo)簽蛋白的純化
本實(shí)驗(yàn)將GST標(biāo)簽蛋白，經(jīng)超聲破碎前后，分別取全菌、上清、沉淀、穿透、洗雜、洗雜后的柱料、洗脫、洗脫后的柱料的樣，洗脫步驟可以完全洗脫下目的蛋白，幾乎無(wú)目的蛋白殘留于柱料上，GST標(biāo)簽蛋白的親和層析各步驟的結(jié)果如圖6。白，取2-32管進(jìn)行下一步純化備用，如圖8。
圖5pGEX-6p-1-hHDAC8 Superdex 200分子篩SDS-PAGE結(jié)果
圖6GST標(biāo)簽蛋白親和層析SDS-PAGE結(jié)果
圖7 GST標(biāo)簽蛋白hitrap Q陰離子交換峰形圖
結(jié)果如下：由于GST蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量25 KD左右，所以由親和層析圖可以看出，GST蛋白出現(xiàn)在洗脫樣品中，可以進(jìn)行下一步的離子交換實(shí)驗(yàn)如圖7。SDS-PAGE結(jié)果顯示2-32管均為目的蛋
圖8 GST標(biāo)簽蛋白hitrap Q陰離子交換SDS-PAGE結(jié)果
2.3 GST pull-down的方法尋找互作蛋白
本實(shí)驗(yàn)將GST pull-down各個(gè)步驟取樣，SDSPAGE跑膠，結(jié)果如圖9。
圖9GST pull-down尋找HDAC8互作蛋白
將樣品GST-HDAC8+全細(xì)胞的樣進(jìn)行質(zhì)譜送樣，結(jié)果如圖10。
圖10GST pull-down尋找HDAC8互作蛋白質(zhì)譜結(jié)果圖
我們除了發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中報(bào)道的蛋白，還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的蛋白，如糖代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用的烯醇酶ENO1，第一次驗(yàn)證了ENO1可能作為HDAC8復(fù)合物發(fā)揮作用過(guò)程中的其中之一蛋白。
3 結(jié)論
我們開展了GST pull-down實(shí)驗(yàn)，GST pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中報(bào)道的蛋白，還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的蛋白，如糖代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用的烯醇酶ENO1，第一次驗(yàn)證了ENO1可能作為HDAC8復(fù)合物發(fā)揮作用過(guò)程中的其中之一蛋白。與其他尋找HDAC8互作蛋白的方法相比較，作為參照與互補(bǔ)，GST pull-down實(shí)驗(yàn)存在的缺點(diǎn)，主要是因?yàn)镚ST標(biāo)簽蛋白占據(jù)了HDAC8蛋白的表位，影響了酶的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，造成假陰性和假陽(yáng)性的結(jié)果，我們將在今后提出方法模擬酶過(guò)渡態(tài)設(shè)計(jì)的底物抑制劑分子，一方面，抑制劑分子占據(jù)了酶活中心，沒(méi)有占據(jù)其它位點(diǎn)，不影響酶的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；另一方面，該抑制劑分子和HDAC8的結(jié)合模擬了底物與酶結(jié)合的過(guò)程，使“抓取”到的互作蛋白結(jié)果更加可靠，本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)pull-down發(fā)現(xiàn)一些未被發(fā)現(xiàn)的互作蛋白，同時(shí)，可以將此方法平移到其它HDAC亞型。
ENO1是發(fā)現(xiàn)的未知互作蛋白，我們后期再通過(guò)“凸凹互補(bǔ)”的親和柱實(shí)驗(yàn)繼續(xù)驗(yàn)證此類蛋白，是否與HDAC8存在互作關(guān)系。
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