陳蘭洲，趙瑞雪，武艷芳，鄧松強(qiáng)，梁亞楠，劉思瑤

(1 武漢大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖北省環(huán)境修復(fù)技術(shù)研究中心，武漢 430072；2 武漢文科生態(tài)環(huán)境有限公司，武漢 430223)

我國鉛資源豐富，鉛及其化合物廣泛應(yīng)用于制酸工業(yè)、冶金工業(yè)、電器產(chǎn)業(yè)、汽油抗爆添加劑、顏料、油漆涂料，以及防腐劑及護(hù)膚美容品等輕工業(yè)領(lǐng)域. 這些產(chǎn)業(yè)的繁榮，伴隨著大量含鉛廢水的產(chǎn)生與排放，這些鉛進(jìn)入水體后，可以通過皮膚接觸、飲用水及食物鏈等途徑進(jìn)入人體內(nèi)，并在人體內(nèi)富集，嚴(yán)重威脅人類健康.

傳統(tǒng)的含鉛廢水處理方法有化學(xué)沉淀、氧化還原、離子交換、膜處理以及電化學(xué)等，但是存在費(fèi)用高、處理不完全、修復(fù)效果不佳、容易造成二次污染等缺點(diǎn). 利用水體和土壤中能夠耐受、鈍化、沉淀或吸附重金屬的生物來建立的處理方法是一種高效、安全、無污染和廉價的修復(fù)方式[1]. 同時，微生物具有種類豐富多樣、分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、易馴化易突變等特點(diǎn)，當(dāng)前在重金屬生物修復(fù)中具有較好的優(yōu)勢[2]. 研究發(fā)現(xiàn)包括細(xì)菌、放線菌、真菌和藻類在內(nèi)的多種微生物對鉛離子具有很好的吸附和富集固定[3, 4]，然而許多微生物諸如短小芽孢桿菌、拉微球菌、鐮刀霉菌屬、曲霉、根霉、Phanerochaetechrysosporium等對鉛離子耐受能力有限，且去除效果容易受環(huán)境影響. 本研究從重金屬污染土壤中篩選出一株鉛的高耐受菌，分析了其對鉛Pb的吸附能力，并深入研究了其吸附機(jī)理.

1　材料與方法

1.1　菌種來源

從湖北省武漢市某廠周邊植物根際與非根際土壤中篩選到一株耐鉛菌Z-y3，通過生理生化實驗及16S rDNA測序分析初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.).

1.2　重金屬吸附特性分析

LB培養(yǎng)液中37 ℃、180 r/min對菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)12 h，得到的活化菌株離心(8000 r/min，10 min)分離得到的純菌株用無菌水/稀硝酸洗滌2～3次后制備成濃縮菌液(OD500=2.3，約20 g/L)備用. 使用1 mol/L的NaOH和HNO3對含一定量Pb(II)的溶液調(diào)節(jié)pH為2、3、4、5、6，接種濃縮菌液于100 mg/L Pb(II)溶液中，設(shè)置3個平行實驗組，定期取上清液測定pH值及Pb(II)含量.

1.3　吸附機(jī)理研究

取吸附前后的菌液，分別進(jìn)行X射線衍射、傅里葉紅外、X射線光電子能譜和SEM-EDS分析，觀察該菌株在吸附前后的形態(tài)、菌體表面元素、官能團(tuán)以及Pb的賦存形態(tài)變化，研究其吸附機(jī)理. 具體方法如下.

濃縮菌液制備方法同上，使用含Pb(II)20 g/L的儲備液配置25、50和100 mg/L等不同濃度梯度的Pb(II)溶液，其余使用的Pb(II)濃度(無濃度梯度的情況)統(tǒng)一為100 mg/L.

1.3.1X射線衍射分析(XRD)

分別取吸附前后的菌液離心去上清液，得到的菌體真空干燥后研磨成粉末，X射線衍射儀(X’Pert Pro 型XRD，荷蘭PANalytical公司)測定分析.

1.3.2傅里葉紅外分析(FTIR)

菌體處理方法同上，菌粉與一定量溴化鉀混合制成溴化鉀壓片，利用紅外光譜儀(FT-IR，Nicolet5700，Thermo Fisher公司)分析.

1.3.3X射線光電子能譜分析(XPS)

菌體處理方法同上，利用X射線光電子能譜儀(XPS，ESCALAB 250Xi，Thermo Fisher 公司)分析.

1.3.4掃描電子顯微鏡能譜聯(lián)用(SEM-EDS)

將培養(yǎng)好的菌液取樣(8000 r/min，5 min)離心后，棄上清液，用10 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)洗滌3次；清洗后的菌體加入 10 mL 2.5%的戊二醛溶液，固定過夜；PBS清洗3次，然后用梯度乙醇逐級脫水30%-50%-70%-80%-90%，每個濃度15 min，100%乙醇脫水2次，20 min/次，接著叔丁醇置換2次，20 min/次；將處理好的樣品放置于4 ℃冰箱內(nèi)冷卻 15 min，然后低溫真空干燥過夜. 最后噴金鍍膜，掃描電鏡觀察并用能量色散X射線譜儀(SEM-EDS，F(xiàn)EI QUNTA200)分析.

2　結(jié)果與討論

2.1　吸附特性分析

由圖1A中低初始pH值實驗組的pH值隨時間變化可知，該菌有產(chǎn)堿作用；結(jié)合去除率變化圖1B可知，對比各個初始pH值條件下，不同時間段(1～6 h)Pb的去除率差異并不顯著(p>0.05)，即Z-y3達(dá)到吸附平衡所需時間較短，去除效果迅速；另一方面pH對最終去除率有一定程度的影響(p<0.05)，但相對而言影響較小，最終去除率最值相差不超過15%，即在酸性條件下去除效果比較穩(wěn)定.這說明該菌于偏酸性環(huán)境下對鉛整體上有較好的去除效果.

2.2　吸附機(jī)理分析

2.2.1Pb的形態(tài)變化

XRD結(jié)果(圖2)顯示，Pb(II)處理后的樣品中含鉛的晶體為磷酸鉛化合物Pb3(PO4)2、鈣和鉀的磷酸鉛化合物Ca2.5Pb7.5(OH)2(PO4)6和KPb4(PO4)3、堿式磷酸鉛Pb5(PO4)3OH以及磷氯鉛類物質(zhì)Pb5(PO4)3Cl. 結(jié)合2.1的pH影響實驗結(jié)果可知，該菌株具有一定的產(chǎn)堿礦化能力，可將游離態(tài)Pb轉(zhuǎn)化為難溶晶體態(tài)，將重金屬Pb(II)固定并減輕其對人身的毒害.

XPS寬掃描圖吸附前后對比可以明顯看出吸附后Pb(II)峰的存在(圖3)，分析高分辨率XPS譜圖，擬合結(jié)果與鉛的標(biāo)準(zhǔn)譜圖Pb(4f5/2)和Pb(4f7/2)非常接近，結(jié)合能位于143.5 eV和138.6 eV，結(jié)合能位于 138.6 eV的Pb4f峰是鉛被活菌體沉淀形成氫氧化鉛、碳酸鉛、磷酸鉛、Pb(OH)+等[5].

圖1　pH對Z-y3去除Pb2+的影響及去除率變化情況Fig.1　Effect of pH on biosorption of Pb(Ⅱ) by strain Z-y3 and change of removal rates

圖2　菌株Z-y3吸附Pb(II)前后的X射線衍射分析圖Fig.2　X-ray diffraction (XRD) patterns of strain Z-y3 before and after Pb2+ biosorption

圖3　菌株Z-y3吸附Pb(II)前后的XPS掃描及分峰譜圖Fig.3　XPS survey scanning spectra and peak of strain Z-y3 before and after Pb2+ biosorption

2.2.2菌體形態(tài)變化

未處理活菌體表面光滑且呈飽滿的短桿狀(圖4A)，Pb(II)處理后的菌體表面有一定的褶皺、凹陷、聚集的趨勢，黏性變大(圖4B)，處理前后菌體形態(tài)產(chǎn)生了明顯的變化. 研究表明，菌體形態(tài)變化與重金屬離子的作用有關(guān)，該菌株吸附前后形態(tài)的變化可能是重金屬Pb(II)脅迫誘導(dǎo)的結(jié)果[6，7].

A).吸附前；B)吸附后圖4　菌株Z-y3吸附Pb(II)前后的掃描電鏡圖Fig.4　SEM images of strain Z-y3 before and after Pb2+ biosorption

2.2.3菌體表面元素變化

無重金屬Pb脅迫時，菌體表面存在C、N、O、Na、Mg、S、P、Cl、K的峰；經(jīng)25、50和100 mg/L Pb(II)濃度分別處理后，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面的Pb含量隨Pb(II)處理濃度升高而遞增(表1)；同時，K含量明顯減少，其降幅遠(yuǎn)超過Na、Mg，結(jié)合XRD分析結(jié)果推測這可能是由于部分K+與Pb(II)以及PO43-結(jié)合形成了鉀的磷酸鉛化合物KPb4(PO4)3；與此類似，重金屬處理下菌體表面P、O元素的含量減少也是由于這些元素與Pb結(jié)合生成難溶晶體(如磷酸鉛、堿式磷酸鉛等)有關(guān). 此外，Pb脅迫下，菌體表面Na、Mg含量減少，可能是Na+、Mg2+以及部分K+與Pb(II)發(fā)生了離子交換[8]；C、S元素含量明顯增加，可能在重金屬脅迫下，菌體啟動了防御機(jī)制，合成了一些多聚體螯合劑，如金屬硫蛋白等[9-11].

表1不同 Pb(II)濃度下活菌吸附前后的元素原子比
Tab.1 Ratios of atomic concentrations of strain Z-y3 before and after biosorption under different initial Pb2+concentrations

Element0mg/LPb2+25mg/LPb2+50mg/LPb2+100mg/LPb2+CK71．5871．9174．2174．38NK08．3109．0207．1908．06OK18．0517．1315．9815．16NaK00．2900．2700．1900．10MgK00．1900．1800．1400．11PK00．6600．6500．7400．55SK00．1800．2700．3900．46ClK00．0700．1400．1400．19KK00．7700．8500．3000．05PbL———00．3000．5200．76

2.2.4菌體表面官能團(tuán)變化

對所有可能參與吸附的菌體表面官能團(tuán)的變化進(jìn)行測定[12-15]，結(jié)果見表2. 在3500 ～3000 cm-1之間有一個較寬而強(qiáng)的吸收峰，主要是羧酸(3300～2500 cm-1)、醇類、酚類的 O-H 的伸縮振動峰及N-H 鍵的吸收峰，由-OH重疊和-NH2伸縮振動引起；在3000～2900 cm-1范圍內(nèi)吸收峰是由含有=CH2和-CH3的功能性基團(tuán)中對稱和不對稱鍵合點(diǎn)=CH鍵的伸縮振動引起，2930 cm-1和2960 cm-1處的雙峰是由脂肪族C-H鍵的伸縮振動引起的；1730 cm-1處的吸收峰是羧酸 C=O 的伸縮振動峰；1654 cm-1是蛋白質(zhì)酰胺I帶(主要-C=O鍵的伸縮振動)的特征譜峰，1545 cm-1是蛋白質(zhì)酰胺II帶(主要N-H鍵伸縮振動)的特征譜峰；而苯環(huán)中的C-H鍵的振動在1455 cm-1處可觀察到；在1398 cm-1處出現(xiàn)吸收峰可能是因為有羧酸鹽的存在，其中的M表示像鈉、鎂、鉀、鈣這類可以自然存在于細(xì)胞表面的金屬；1310 cm-1可能是蛋白質(zhì)脂肪酸混合振動引起的譜峰；1243 cm-1處的峰是羧基(-COOH)和磷酸鹽中部分P=O和P-O鍵的伸縮振動峰；而1067 cm-1處的譜峰是特定的羧酸和醇類物質(zhì)的C-O伸縮振動吸收峰. 重金屬與官能團(tuán)結(jié)合生成鹽，可引起峰形的變化. 由表2可知，隨著Pb濃度升高，峰形變化較為明顯的有1730 cm-1處的峰，即羧基-COOH參與了吸附作用；濃度100 mg/L條件下，3500～3000 cm-1峰寬明顯變寬，可能吸附過程中形成羧酸鹽，且蛋白質(zhì)或脂肪酸中的-OH、-NH2也參與了作用，同時1067 cm-1羧酸和醇類物質(zhì)的C-O伸縮振動吸收峰發(fā)生明顯變化也說明了這一點(diǎn).

表2　Z-y3活菌吸附Pb(II)前后紅外光譜的變化以及相應(yīng)的官能團(tuán)

3　結(jié)語

從重金屬污染場地篩選到的耐鉛芽孢桿菌Z-y3對Pb(II)的去除機(jī)制主要有表面靜電吸附、離子交換、產(chǎn)堿沉淀. 吸附作用的官能團(tuán)和離子主要包括蛋白質(zhì)和脂肪酸的羧基、羥基、酰胺帶，磷酸根、氫氧根、鉀離子、鈣離子，最終形成的產(chǎn)物或絡(luò)合物有磷酸鉛化合物，螯合多聚體，鉀、鈣的磷酸鉛化合物，堿式磷酸鉛，磷氯鉛類物質(zhì)等.

Z-y3對Pb(II)的吸附效果好，速率快，在酸性條件下受pH影響不大，過程中無有毒產(chǎn)物參與(或產(chǎn)生),其作為一種處理低濃度含鉛廢水的生物吸附劑具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景.

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