時磊　魏明　師廣勇　劉佳　龔艷杰　陳河濤　梁穎紅　涂玲

450052鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院藥學(xué)部（時磊），檢驗科（魏明、師廣勇、劉佳、龔艷杰、陳河濤、梁穎紅、涂玲）

皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）具有高度的侵襲能力，可能與紫外線照射損傷、免疫抑制及其他皮膚疾病有關(guān)［1］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長21～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，它通過介導(dǎo)靶mRNA的降解或阻遏轉(zhuǎn)錄后翻譯，在細胞生長、凋亡、分化等諸多生物學(xué)過程中起調(diào)控作用。miRNA的異常表達常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用［2?3］。近年研究表明，多種miRNA與皮膚腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲等密切相關(guān)，如 miRNA?203［4］、miRNA?125b［5］、miRNA?128［6］等。但有關(guān)miRNA?155在皮膚鱗癌中的作用研究還較少。我們通過反義技術(shù)抑制miRNA?155在人皮膚鱗癌細胞株A431中的表達，觀察miRNA?155對A431細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響。

材料與方法

一、材料與儀器

A431細胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑盒、RNA提取試劑Trizol（德國Invitrogen公司），噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；高糖改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）及胎牛血清（美國Gibco公司）；脂質(zhì)體試劑異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ（annexinⅤ?FITC）細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）。反義抑制序列miRNA?155（5′?ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA?3′）、無義對照序列miRNA?155（5′?CAGUACUUUUGUGUAGUACA A?3′）、Hairpin?itTMmiRNA熒光定量PCR試劑盒、U6核內(nèi)小RNA（snRNA）熒光定量校正試劑盒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。酶聯(lián)免疫檢測儀、FACScalibur流式細胞儀（美國BD公司），插入式細胞培養(yǎng)皿（Transwell）（美國康寧公司）。

二、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A431細胞。將對數(shù)生長期細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，細胞鋪板在2 ml含血清、不含抗生素的培養(yǎng)基中，24 h內(nèi)細胞融合達50%～70%時，按實驗要求分組：空白對照組，僅加含有Lipofectamine2000的DMEM；無義序列組，加入含Lipofectamine2000的DMEM和無義序列miRNA?155；反義序列組，加入含Lipofectamine2000的DMEM和反義序列miRNA?155。轉(zhuǎn)染體系500 μl，轉(zhuǎn)染終濃度100 nmol/L。孵育6 h后，換為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

三、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測轉(zhuǎn)染后miRNA?155的表達

轉(zhuǎn)染48 h后，使用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，取0.5 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后擴增，以U6 snRNA作為內(nèi)參。miRNA?155正向引物序列：5′?GCCGTTAATGCTAATCGTGAT?3′，反向引物序列：5′?TGGGTTCATTTTCTGGGTCTT?3′，探針序列：FAM?TCTATTCCATTGGTCTACT?MGB；U6 snRNA正向引物序列：5′?CTCGCTTCGGCAGCAC?3′，反向引物序列：5′?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3′，探針序列：FAM?AACGATACAGAGAAGATT?MGB。反轉(zhuǎn)錄特異性引物為各自的反向引物。均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR體系25 μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火、延伸60 s，共40個循環(huán)。每個樣本均測3次。采用LightCycler 480熒光定量PCR儀（美國Roche公司）檢測各樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct值），以2?△△Ct反映目的基因表達量，△Ct=Ct反義序列組或無義序列組-Ct內(nèi)參，△△Ct=△Ct反義序列組-△Ct無義序列組。

四、MTT實驗檢測細胞增殖活性

將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的細胞消化離心（轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心半徑13.0 cm），按每孔2 × 103個（200 μl）接種于5塊96孔板，每組接種6個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)并隔天換液，于接種后24、48、72、96、120 h時各取1塊96孔板，每孔加入20 μl MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定各孔吸光度（A值），細胞存活率（%）=（A反義序列組/A空白對照組）× 100%。

五、流式細胞儀檢測細胞周期

將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞消化離心（轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心半徑13.0 cm），用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸、洗滌2次，加入預(yù)冷的75%乙醇3 ml，4℃過夜，離心收集細胞，PBS洗滌后加入400 μl溴化乙錠染色液（50 mg/L）和100 μl核糖核酸酶A（RNase A）（100 mg/L），4 ℃避光孵育30 min，過300目尼龍網(wǎng)，于流式細胞儀中488 nm激發(fā)波長處檢測處于G0/G1、S、G2/M期的細胞比例，計算細胞增殖指數(shù)（PI）。PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。

六、流式細胞儀檢測細胞凋亡

收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞，每組設(shè)3個平行孔。按照說明書清洗、消化、離心細胞后，每管加入結(jié)合緩沖液懸浮細胞200 μl（細胞密度為1×106/ml）。避光下每管加入3 μl annexinⅤ?FITC，再加入溴化乙錠（其中1個對照孔兩者都不加，1個對照孔只加溴化乙錠）2 μl，混勻，室溫避光孵育15 min，置于冰上。流式細胞儀檢測細胞凋亡，激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長530 nm。凋亡率=凋亡細胞數(shù)/（凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù)）×100%。

七、Transwell法檢測細胞遷移與侵襲收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的A431細胞，制備單細胞懸液，密度為1×106/ml。取3個細胞小室放入24孔板中，每個細胞小室加入對應(yīng)分組稀釋后的細胞懸液100 μl（即每孔細胞數(shù)為1×105個），細胞小室的下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM/高糖完全培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h，PBS浸洗，80%乙醇固定，伊紅染色；取出小室放入含有3 ml PBS的6孔板中，于倒置熒光顯微鏡下隨機取6個視野照相、計數(shù)（200倍），取平均值為細胞遷移數(shù)。另外將-20℃保存Matrigel膠置于4℃冰箱過夜，融化稀釋后加入細胞小室上室，覆蓋整個聚碳酯膜，重復(fù)以上步驟檢測細胞侵襲數(shù)。

八、統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD?t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　A431細胞轉(zhuǎn)染反義微小RNA?155后不同時間點細胞存活率（x±s）

結(jié)　果

一、轉(zhuǎn)染后A431細胞miRNA?155表達水平

轉(zhuǎn)染后反義序列組、無義序列組、空白對照組細胞miRNA?155表達水平分別為0.28±0.18、0.98±0.02、1.00± 0.01，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=634.57，P＜0.001），反義序列組表達水平低于空白對照組和無義序列組，t值分別為6.371、5.863，均P＜0.05；而空白對照組和無義序列組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.261，P＞ 0.05）。

二、轉(zhuǎn)染后A431細胞存活率變化

轉(zhuǎn)染miRNA?155后孵育24～120 h，反義序列組細胞存活率呈降低趨勢。見表1。轉(zhuǎn)染后24、48 h時，3組細胞存活率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染后72、96、120 h時，反義序列組細胞存活率均低于空白對照組和無義序列組（均P＜0.05）。

三、轉(zhuǎn)染后A431細胞周期變化

轉(zhuǎn)染后3組間細胞G0/G1期、S期細胞比例差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），G2/M期細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），細胞PI值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表2。反義序列組G0/G1期細胞比例高于空白對照組、無義序列組（t值分別為3.261、3.185，P＜ 0.05），S期細胞比例低于空白對照組、無義序列組（t值分別為7.259、6.983，P＜0.05），PI值低于空白對照組、無義序列組（t值分別為5.396、5.273，P＜ 0.05）。

四、轉(zhuǎn)染后A431細胞凋亡率變化

反義序列組、空白對照組和無義序列組A431細胞的凋亡率分別為13.16%±0.62%、7.02%±0.80%和6.74%±1.26%，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=56.27，P＜0.05），反義序列組高于空白對照組和無義序列組，t值分別為5.672、5.713，P＜ 0.05。見圖2。

五、轉(zhuǎn)染后A431細胞遷移和侵襲數(shù)變化

轉(zhuǎn)染后各組細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；反義序列組細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均低于空白對照組（t值分別為7.231、7.203，均P＜0.05）和無義序列組（t值分別為5.687、5.612，均P＜0.05）；而空白對照組和無義序列組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為0.218、0.227，均P＞ 0.05），見表2。

圖1　流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染反義微小RNA?155后A431細胞周期變化

表2　轉(zhuǎn)染反義微小RNA?155后各組A431細胞周期、增殖指數(shù)及遷移數(shù)和侵襲數(shù)（x±s）

圖2　流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染反義微小RNA?155對A431細胞凋亡的影響　反義序列組細胞凋亡比例高于空白對照組和無義序列組

討　論

近來miRNA在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制以及靶向miRNA基因治療已經(jīng)成為腫瘤學(xué)研究熱點［7］。有研究表明，miRNA?155在多種腫瘤中表達上調(diào)，發(fā)揮促癌作用［8?12］；也有研究證實，miRNA?155可通過減少激活誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶產(chǎn)生的癌基因易位而發(fā)揮抑癌作用［13?14］。

我們利用反義技術(shù)抑制miRNA?155在A431細胞中的表達，觀察細胞增殖能力及凋亡的變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染反義miRNA?155后，A431細胞中miRNA?155的表達明顯降低。腫瘤失控性生長的主要分子機制為細胞周期紊亂，導(dǎo)致腫瘤細胞增殖過多和凋亡過少。本研究中，A431細胞轉(zhuǎn)染反義miRNA?155后，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，細胞的增殖能力降低，凋亡率升高，提示抑制miRNA?155的表達可使細胞周期阻滯，細胞增殖能力受限，促進A431細胞的凋亡。

一般認(rèn)為，腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移需要具備遷移能力及穿透周圍組織進入血液或淋巴循環(huán)的能力［15?16］。本研究中，轉(zhuǎn)染反義miRNA?155后穿過小室的A431細胞數(shù)明顯減少，提示反義miRNA?155能抑制A431細胞的侵襲及遷移。

綜上，轉(zhuǎn)染反義序列miRNA?155后A431細胞miRNA?155表達水平降低，細胞遷移、侵襲及增殖受到抑制，提示miRNA?155在調(diào)控皮膚鱗癌生物學(xué)行為中發(fā)揮了重要作用。

圖3　顯微鏡下觀察Transwell法檢測轉(zhuǎn)染反義微小RNA-155后A431細胞的遷移與侵襲（×200）反義序列組細胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)低于空白對照組、無義序列組

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