王洪陽(yáng)　王海濤　李樹(shù)偉

843300新疆阿拉爾，塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

毛囊干細(xì)胞巢［1］的生物學(xué)功能探究是目前干細(xì)胞研究較為熱門(mén)的方向，研究者已將其定位在毛囊隆突部位［2］，且發(fā)現(xiàn)毛囊隆突部細(xì)胞具有修復(fù)創(chuàng)面及再生皮膚的功能［3］。但是毛囊干細(xì)胞巢的形成機(jī)制與過(guò)程尚不明確。干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2作為Sox B1家族的重要一員，主要調(diào)控干細(xì)胞發(fā)育及決定干細(xì)胞分化方向，尤其在維持干細(xì)胞多能性方面具有重要作用［4?5］，其表達(dá)是保證干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)的重要條件之一［6］。我們?cè)贓dU標(biāo)記后進(jìn)行免疫染色，檢測(cè)小鼠毛囊細(xì)胞增殖活躍區(qū)，并針對(duì)Sox2進(jìn)行免疫熒光染色，定位不同發(fā)育階段毛囊Sox2表達(dá)區(qū)域，追蹤定位毛囊干細(xì)胞巢祖細(xì)胞來(lái)源，初步演化毛囊隆突部的形成過(guò)程。

圖1　不同時(shí)期觸須毛囊發(fā)育形態(tài)及觸須毛囊結(jié)構(gòu)；1A～1C：出生后第1、7、15天觸須毛囊實(shí)物圖；1D：第7天觸須毛囊縱切面結(jié)構(gòu)圖（×100）；1E：第7天觸須毛囊橫切面結(jié)構(gòu)圖（×400）

一、材料

1.小鼠：成年發(fā)情期的SPF級(jí)健康昆明（KM）遠(yuǎn)交系小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)（軍）：SCXK 2012?0007，批號(hào)0014379，雌雄各10只，體重60 ～ 80 g。飼養(yǎng)在潔凈通風(fēng)處，塔里木大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心定期檢測(cè)致病原，以確保新生KM小鼠符合本試驗(yàn)要求，試驗(yàn)小鼠均采用SPF級(jí)潔凈鼠糧飼養(yǎng)。

2.主要試劑和儀器：KeyFluor488 Click?iT 5-溴-2-脫氧尿嘧啶（EdU）成像檢測(cè)試劑盒（KGA331?50，南京凱基生物科技有限公司），一抗兔抗小鼠Sox2蛋白（SC?20088，上海玉博生物科技有限公司），二抗KeyFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（SA00003?2，武漢三鷹生物科技有限公司）。牛血清蛋白（BSA）（美國(guó)Gibco公司），抗熒光猝滅劑（北京索萊寶科技有限公司），杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS，北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）。

二、方法

1.觸須毛囊樣品處理：隨機(jī)選取剛出生、6 d齡乳小鼠、14 d齡斷乳鼠各2只，雌雄不限，每年齡段小鼠均隨機(jī)分成兩組，即標(biāo)記組和無(wú)標(biāo)記組：標(biāo)記組小鼠觸須部位皮下注射40 μl用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的EdU（20 μmol/L）；無(wú)標(biāo)記組小鼠不做任何處理。6只小鼠正常飼養(yǎng)24 h后，均斷頸處死。采用顯微外科解剖法獲取不同日齡小鼠觸須完整毛囊60個(gè)/只，PBS清洗干凈，OCT冰凍包埋，液氮速凍1 h，-80℃冰箱冷凍48 h，制作8 μm厚冰凍切片，正電荷防脫載玻片吸附冰凍切片，-20℃冰箱中凍存。

2.常規(guī)病理染色：HE染色毛囊組織切片，晾干，封片，顯微鏡觀察并拍照。

3.毛囊切片EdU標(biāo)記染色：EdU標(biāo)記培養(yǎng)的組織切片滴加1 ml 4%多聚甲醛室溫固定30 min，然后3%BSA溶液清洗2次，加入0.5%Triton X?100溶液（混合PBS配制）透化細(xì)胞質(zhì)膜和核膜，20 min后，再使用3%BSA溶液清洗2次。每張玻片上加入0.5 ml Click?iT反應(yīng)混合物，室溫避光孵育30 min，同時(shí)以PBS代替Click?iT反應(yīng)混合物作為陰性對(duì)照。棄去Click?iT反應(yīng)混合物，使用3%BSA溶液漂洗2次，采用抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡拍照觀察。

4.毛囊切片Sox2免疫熒光染色：冰凍切片自然晾干30 min，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，使用0.5%Triton X?100透膜20 min，3%BSA和10%山羊血清各250 μl混合滴至冰凍切片，放入濕盒4℃避光孵育1 h，棄孵育液，滴加100 μl一抗兔抗小鼠Sox2蛋白稀釋液，以PBS代替一抗做免疫熒光陰性對(duì)照，4℃下濕盒孵育過(guò)夜，然后使用PBS漂洗3次，滴加二抗KeyFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG。加入細(xì)胞核熒光染色劑DAPI，4℃濕盒避光孵育1 h，PBS漂洗3次，棄漂洗液，抗熒光猝滅劑封片。熒光顯微鏡拍照觀察。

三、結(jié)果

1.觸須毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)：對(duì)每個(gè)日齡無(wú)標(biāo)記小鼠30個(gè)毛囊HE染色后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，同一日齡不同毛囊間形態(tài)結(jié)構(gòu)類(lèi)似。第1天時(shí)（圖1A），觸須毛囊呈灰白色，可以看到毛干，毛球部中可明顯區(qū)分出真皮乳頭；第7天時(shí)（圖1B），觸須毛囊毛干變得粗壯，同時(shí)毛囊外根鞘上部出現(xiàn)環(huán)周隆突，并且大量毛細(xì)血管包繞整個(gè)毛囊，但毛球部毛細(xì)血管數(shù)沒(méi)有毛囊中上部多；第15天時(shí)（圖1C），觸須毛囊毛干變得更加粗壯，且每個(gè)觸須毛囊不僅伸出1條毛干，同時(shí)包繞毛囊的毛細(xì)血管更加豐富，但相對(duì)于第7天毛囊球部毛細(xì)血管依舊沒(méi)有出現(xiàn)增多的跡象。從第7天分離出的單獨(dú)觸須毛囊的縱切（圖1D）和橫切（圖1E）圖上可以清楚地看到觸須毛囊的各個(gè)結(jié)構(gòu)，包括結(jié)締組織鞘、毛囊外根鞘、毛囊內(nèi)根鞘、毛干、毛母質(zhì)、玻璃膜、真皮乳頭。

2.觸須毛囊發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞增殖活躍區(qū)標(biāo)記：對(duì)每個(gè)日齡Edu標(biāo)記小鼠60個(gè)毛囊染色后發(fā)現(xiàn)，同一日齡不同毛囊間細(xì)胞增殖活躍區(qū)分布一致。見(jiàn)圖2。第1天時(shí)，小鼠觸須毛囊細(xì)胞的增殖活躍區(qū)在真皮乳頭以及毛母質(zhì)，增殖活躍區(qū)呈現(xiàn)“O”型，毛囊的中上端增殖不明顯，只在毛囊外根鞘上端存在散在增殖毛囊細(xì)胞；第7天時(shí)真皮乳頭不再是小鼠觸須毛囊細(xì)胞增殖活躍區(qū)，毛母質(zhì)依舊是增殖活躍區(qū)，但活躍區(qū)開(kāi)始向毛球部外根鞘轉(zhuǎn)移，增殖活躍區(qū)呈“∩”型，毛囊中上端細(xì)胞增殖依舊不明顯；第15天時(shí)，小鼠觸須毛囊細(xì)胞增殖活躍區(qū)開(kāi)始轉(zhuǎn)變成毛球基底部，同時(shí)沿著內(nèi)根鞘向上延伸，增殖活躍區(qū)呈現(xiàn)“U”型，同時(shí)毛囊中上段細(xì)胞增殖明顯（白色箭頭示），陽(yáng)性細(xì)胞信號(hào)增多，并在毛囊外根鞘處形成一定的隆起。陰性對(duì)照組不顯示增殖活躍區(qū)。

圖2　不同發(fā)育時(shí)期觸須毛囊干細(xì)胞增殖活躍區(qū)標(biāo)記　白色虛線(xiàn)內(nèi)部為細(xì)胞增殖強(qiáng)活躍區(qū)，白色箭頭示毛囊中上部隆突部旁細(xì)胞增殖。ORS：外根鞘；Bulge：隆突部；DP：真皮乳頭

圖3　免疫熒光染色檢測(cè)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2在不同發(fā)育時(shí)期觸須毛囊中的表達(dá)　白色箭頭示Sox2表達(dá)區(qū)域；Bulge：隆突部（白色虛線(xiàn)部位）；ORS：外根鞘；IRS：內(nèi)根鞘；GM：玻璃膜；HS：毛干；HM：毛母質(zhì)；DP：真皮乳頭（白色虛線(xiàn)部位）

3.Sox2在觸須毛囊中的表達(dá)：對(duì)每個(gè)日齡無(wú)標(biāo)記小鼠30個(gè)毛囊行Sox2染色顯示，同一日齡不同毛囊間Sox2表達(dá)相似，見(jiàn)圖3。在出生第1天的小鼠觸須毛囊中，Sox2的表達(dá)主要集中在毛囊外根鞘，且在外根鞘的外圍形成一層表達(dá)帶。毛囊球部外根鞘細(xì)胞中Sox2表達(dá)強(qiáng)于其他部位，真皮乳頭部位也有少量Sox2表達(dá)。第7天Sox2的表達(dá)主要集中在毛囊中上部，且中上部毛囊外根鞘中表達(dá)Sox2的細(xì)胞增多，表達(dá)帶增厚，但毛球部毛囊細(xì)胞中Sox2表達(dá)減弱。第15天Sox2的表達(dá)依舊主要集中在毛囊中上部，且毛囊最上端的外根鞘周?chē)霈F(xiàn)次級(jí)毛囊，Sox2在次級(jí)毛囊中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，毛囊中部外根鞘有隆起，且隆起部中有大量表達(dá)Sox2的細(xì)胞存在，毛球部毛囊細(xì)胞中Sox2表達(dá)依舊減弱，且真皮乳頭細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)Sox2的細(xì)胞。陰性對(duì)照組觸須毛囊中無(wú)Sox2表達(dá)。

四、討論

本研究發(fā)現(xiàn)，毛囊隆突部的形成基礎(chǔ)來(lái)源于毛囊真皮乳頭，即毛囊毛球部的成纖維細(xì)胞，毛球部成纖維細(xì)胞的大量增殖及遷移在不同時(shí)期的毛囊中顯示出動(dòng)態(tài)變化，Sox2定位顯示隨著毛囊的成熟，毛囊干細(xì)胞增殖能力下降，但是Sox2的表達(dá)增多，同時(shí)Sox2也主要集中在毛囊隆突部，形成相對(duì)封閉的空間，空間內(nèi)細(xì)胞大量表達(dá)Sox2，但是卻不再增殖，毛囊隆突部細(xì)胞進(jìn)入靜息期，毛囊干細(xì)胞不再分化增殖，除非毛囊受損，毛囊啟動(dòng)修復(fù)再生機(jī)制，受損毛囊干細(xì)胞巢中干細(xì)胞激活后開(kāi)始增殖、分化，遷移出干細(xì)胞巢，分化成受損處的同源細(xì)胞，修復(fù)毛囊受損或者皮膚創(chuàng)面［7］。

研究發(fā)現(xiàn)，毛囊干細(xì)胞巢的生成過(guò)程中，可能是表皮基底層首先形成毛囊樣結(jié)構(gòu)［8?9］，毛囊發(fā)育過(guò)程中形成毛囊毛球部，毛球部中真皮乳頭具有較強(qiáng)的增殖分化功能，真皮乳頭細(xì)胞增殖分化出的細(xì)胞沿著毛囊外根鞘和內(nèi)根鞘向毛囊上部遷移，集中在毛囊中上部，形成隆突（隆突部中的細(xì)胞也被稱(chēng)為毛囊干細(xì)胞），進(jìn)入不再增殖分化的靜息期。

毛囊隆突部干細(xì)胞巢的形成是一復(fù)雜的過(guò)程，形成機(jī)制涉及皮膚表皮和真皮的相互作用以及毛囊內(nèi)部細(xì)胞的自身發(fā)育過(guò)程等。另外毛囊隆突部位鎖定在毛囊中上部，離表皮的基底層很近，但同時(shí)它又處在皮膚的真皮層中，因此，皮膚受創(chuàng)后，毛囊隆突部干細(xì)胞巢中的干細(xì)胞可以就近根據(jù)創(chuàng)面的大小與深度增殖遷移,修復(fù)創(chuàng)面，修復(fù)過(guò)程中，毛囊隆突部的位置對(duì)縮短增殖細(xì)胞的遷移距離具有重要作用。

綜上所述，我們初步探索了毛囊隆突部干細(xì)胞巢的形成過(guò)程，同時(shí)也為進(jìn)一步研究毛囊隆突部干細(xì)胞巢中細(xì)胞生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

［1］Paus R,Arck P,Tiede S.（Neuro?）endocrinology of epithelialhairfolliclestemcells［J］.MolCell Endocrinol,2008,288（1?2）:38?51.doi:10.1016/j.mce.2008.02.023.

［2］Demehri S,Kopan R.Notch signaling in bulge stem cells is not required for selection of hair follicle fate［J］.Development,2009,136（6）:891?896.doi:10.1242/dev.030700.

［3］Taylor G,Lehrer MS,Jensen PJ,et al.Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis［J］.Cell,2000,102（4）:451?461.doi:10.1016/S0092?8674（00）00050?7.

［4］Girouard SD,Laga AC,Mihm MC,et al.SOX2 contributes to melanoma cell invasion［J］.Lab Invest,2012,92（3）:362?370.doi:10.1038/labinvest.2011.188.

［5］Kamachi Y,Kondoh H.Sox proteins:regulators of cell fate specification and differentiation［J］.Development,2013,140（20）:4129?4144.doi:10.1242/dev.091793.

［6］Gao Z,Cox JL,Gilmore JM,et al.Determination of protein interactome of transcription factor Sox2 in embryonic stem cells engineered for inducible expression of four reprogramming factors［J］.J Biol Chem,2012,287（14）:11384?11397.doi:10.1074/jbc.M111.320143.

［7］Plikus MV,Gay DL,Treffeisen E,et al.Epithelial stem cells and implications for wound repair［J］.Semin Cell Dev Biol,2012,23（9）:946?953.doi:10.1016/j.semcdb.2012.10.001.

［8］Nakrieko KA,Rudkouskaya A,Irvine TS,et al.Targeted inactiva?tion of integrin?linked kinase in hair follicle stem cells reveals an important modulatory role in skin repair after injury［J］.Mol Biol Cell,2011,22（14）:2532?2540.doi:10.1091/mbc.E11?01?0035.

［9］Cotsarelis G.Epithelial stem cells:a folliculocentric view［J］.J Invest Dermatol,2006,126（7）:1459 ?1468.doi:10.1038/sj.jid.5700376.