盧建博，鄭文鋁，，余云舟，葉建強(qiáng)，戴秋云，劉珠果

1.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071；2.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225100

水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）屬彈狀病毒科，為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。負(fù)鏈RNA病毒的包裝需要RNA與核衣殼蛋白形成有活性的核糖核蛋白，以此作為RNA依賴的RNA聚合酶的模板，所以單純的負(fù)鏈RNA無感染性，且病毒復(fù)制周期中沒有出現(xiàn)DNA環(huán)節(jié)，病毒基因組不會整合到宿主細(xì)胞基因組中，因此來源于改構(gòu)的VSV的重組VSV（rVSV）載體疫苗具有較高的安全性。近年來，隨著流感、埃博拉病毒病和寨卡病毒病等大規(guī)模暴發(fā)，其疫苗的研制已被世界各國廣泛關(guān)注。以rVSV為載體的疫苗已研究多年，具有免疫效率高、無預(yù)存免疫等優(yōu)點(diǎn)，已用于人類免疫缺陷病毒、流感病毒[1]、尼帕病毒[1]、埃博拉病毒[2-5]、馬爾堡病毒[6-7]和中東呼吸綜合征冠狀病毒[8]等的疫苗研究，其中以rVSV為載體的埃博拉疫苗已經(jīng)完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)并提交美國FDA審批[9]。

此外，VSV能在多種細(xì)胞中高滴度快速生長，可建立VSV反向遺傳操作系統(tǒng)[10-12]，特別適合于絲狀病毒及黃熱病毒疫苗的設(shè)計(jì)及制備。表達(dá)外源基因的rVSV的穩(wěn)定高效包裝是制備rVSV載體疫苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。提高病毒包裝的成功率，除須準(zhǔn)確合成病毒的基因組cDNA外，病毒包裝細(xì)胞系的選擇、rVSV骨架質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的用量、重組痘病毒（vTF7-3）的感染時(shí)間、轉(zhuǎn)染試劑作用時(shí)間等均影響病毒的穩(wěn)定高效包裝。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的條件進(jìn)行了rVSV的包裝，發(fā)現(xiàn)其包裝效率較低，穩(wěn)定性不高[13-16]。本研究中，我們對該系統(tǒng)包裝條件進(jìn)行探索及優(yōu)化，為建立表達(dá)外源基因的rVSV載體疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

BHK21-WI2細(xì)胞購自Kerafast公司；293T細(xì)胞購自Clontech公司；重組痘病毒vTF7-3購自ATCC公司；prVSVΔG-GFP骨架質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒（pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L）、pCAGGS-G由MichaelA.Whitt教授饋贈；轉(zhuǎn)染試劑 Lipo?fectAMINE 2000購自Invitrogen公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（0.25%）、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自NEST公司；0.22 μm針頭濾器購自Millipore公司；TH4-200型倒置熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 rVSVΔG-GFP包裝及擴(kuò)增

1.2.1 細(xì)胞接種 以3.5×105～5×105/孔接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育14～16 h，使細(xì)胞密度達(dá)到85%～95%，同一細(xì)胞系后續(xù)操作中培育條件不變。

1.2.2 vTF7-3感染細(xì)胞 自-80℃取出凍存的vTF7-3至37℃快速解凍，加入37℃預(yù)熱的無血清DMEM培養(yǎng)基，混勻病毒液，移除1.2.1項(xiàng)中的培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的無血清DMEM漂洗細(xì)胞，將病毒液接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（MOI=5），在培養(yǎng)箱中孵育1 h。

1.2.3 質(zhì)粒體系配制 將prVSVΔG-GFP骨架質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒（pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L）分別以5、3、5、8、1 μg/孔移取。

1.2.4 轉(zhuǎn)染試劑配制及準(zhǔn)備 將1.2.3項(xiàng)中的質(zhì)粒移至含500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基的1.5 mL離心管中混勻，記為A管；LipofectAMINE 2000與質(zhì)粒以2.5～5 μL∶1 μg的比例添加到含500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基的1.5 mL離心管中混勻，記為B管，室溫靜置5 min；將B管移入A管并混勻，室溫靜置20 min。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞并觀察 棄除1.2.2項(xiàng)中的培養(yǎng)液，移入1.2.4項(xiàng)中轉(zhuǎn)染試劑，輕搖混勻，培養(yǎng)6 h后更換為含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞病變（CPE）及熒光。

1.2.6 病毒收獲 從6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上刮下細(xì)胞，反復(fù)吹打，經(jīng)0.22 μm針頭濾器過濾，收集濾液，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 pCAGGS-G質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21-WI2細(xì)胞 按1.2.1項(xiàng)接種細(xì)胞，pCAGGS-G質(zhì)粒為2 μg/孔，用LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)明顯的合胞體。

1.2.8 病毒擴(kuò)增 取1.2.6項(xiàng)中初次包裝病毒至37℃快速解凍，按500 μL/孔移至1.2.7項(xiàng)中已棄除培養(yǎng)液的細(xì)胞中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中感染1 h，每隔15 min輕微搖晃，然后以1.5 mL/孔添加預(yù)熱的含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察CPE及熒光變化。

1.3 rVSVΔG-GFP包裝條件探索及優(yōu)化

1.3.1 輔助質(zhì)粒用量比較 選取293T細(xì)胞用于病毒包裝，實(shí)驗(yàn)方法同1.2，輔助質(zhì)粒的比例與方法1.2.3項(xiàng)中輔助質(zhì)粒比例相同，用量在原基礎(chǔ)上減至1/2（8.50 μg）、1/4（4.25 μg）、1/6（2.83 μg）、1/8（2.16 μg）、1/10（1.70 μg）。

1.3.2 質(zhì)?？傆昧勘容^ 選取293T細(xì)胞用于病毒包裝，實(shí)驗(yàn)方法同1.2，質(zhì)粒的比例與方法與

1.2.3項(xiàng)相同，骨架質(zhì)粒及輔助質(zhì)?？偭烤鶞p為原用量的1/2（11.00 μg）、1/4（8.50 μg）、1/6（3.67 μg）、1/8（2.75 μg）、1/10（2.20 μg）。

1.3.3 包裝細(xì)胞系比較 以1.3.1與1.3.2項(xiàng)的結(jié)果確定優(yōu)化的質(zhì)粒用量，實(shí)驗(yàn)方法同1.2，將BHK21-WI2作為病毒包裝細(xì)胞系，BHK21-WI2細(xì)胞培養(yǎng)需7.5%CO2。

1.3.4 重組痘病毒vTF7-3作用時(shí)間比較 以

1.3.3的優(yōu)化結(jié)果確定質(zhì)粒用量及細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)方法同1.2。將重組痘病毒vTF7-3在作用1 h后移棄，更換為500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)作用1.5和3 h。

1.3.5 轉(zhuǎn)染試劑作用時(shí)間組 以1.3.3項(xiàng)優(yōu)化結(jié)果確定質(zhì)粒用量及細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)方法同1.2，將包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)間在6 h基礎(chǔ)上增加至8、10、12、14 h。

1.4 TCID50法測定包裝病毒滴度

收集BHK21-WI2細(xì)胞，用含5%FBS的DMEM配制成2×105/mL的細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后于37℃快速解凍1.3項(xiàng)各批次病毒，按10-1～10-10梯度稀釋至無血清DMEM中，再添加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各梯度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)4～7 d。觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光變化，統(tǒng)計(jì)CPE孔數(shù)，按Karber法計(jì)算病毒滴度。

1.5 表達(dá)寨卡病毒E蛋白的rVSV（rVSVΔG-ZE）包裝

在prVSVΔG-GFP骨架質(zhì)?；A(chǔ)上，構(gòu)建缺失VSV的包膜糖蛋白（GP）基因而帶有寨卡病毒包膜蛋白（E）基因的VSV重組質(zhì)粒prVSVΔG-ZE，按1.2方法及1.3項(xiàng)優(yōu)化條件進(jìn)行病毒包裝，并測定病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞感染病毒的CPE及熒光觀察

在病毒擴(kuò)增階段，BHK21-WI2細(xì)胞先轉(zhuǎn)染pCAGGS-G質(zhì)粒至逐漸融合、形成大小不等的合胞體（圖1C），隨后，細(xì)胞在感染rVSVΔG-GFP后，逐漸出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落、漂浮等現(xiàn)象（圖1A），在熒光顯微鏡下觀察到明亮的綠色熒光（圖1B）。由于BHK21-WI2細(xì)胞CPE變化較293T細(xì)胞顯著，因此選擇BHK21-WI2細(xì)胞用于觀察。

圖1 病毒感染BHK21-WI2細(xì)胞后的CPE變化（100×）A：rVSVΔG-GFP感染細(xì)胞（光鏡）；B：rVSVΔG-GFP感染細(xì)胞（熒光）；C：轉(zhuǎn)染pCAGGS-G質(zhì)粒細(xì)胞（光鏡）；D：轉(zhuǎn)染pCAGGSG質(zhì)粒細(xì)胞（熒光）

2.2 rVSVΔG-GFP滴度測定結(jié)果

不同條件包裝病毒TCID50結(jié)果見表1。在輔助質(zhì)粒單獨(dú)遞減時(shí)，病毒滴度降低；在骨架質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒同時(shí)遞減時(shí)，滴度降低，但趨勢較小。不同細(xì)胞系包裝rVSV時(shí)，293T細(xì)胞組包裝病毒滴度遠(yuǎn)高于BHK21-WI2細(xì)胞組，延長vTF7-3作用時(shí)間或轉(zhuǎn)染時(shí)間后，BHK21-WI2細(xì)胞系包裝病毒滴度有一定提高。

表1 TCID50法測定rVSVΔG-GFP滴度

2.3 骨架質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒用量的影響

本實(shí)驗(yàn)中rVSVΔG-GFP為復(fù)制缺陷型重組病毒，包裝過程中還用到輔助質(zhì)粒pBS-G、pBS-N、pBS-P、pBS-L，其比例為8∶3∶5∶1[17]。熒光觀察結(jié)果顯示，總質(zhì)粒用量遞減對熒光細(xì)胞數(shù)量影響不明顯（圖2A），但骨架質(zhì)粒用量不變時(shí)，熒光細(xì)胞數(shù)量隨輔助質(zhì)粒用量遞減而減少（圖2B）。滴度測定結(jié)果顯示總質(zhì)粒用量為3.67～22 μg時(shí)可高效包裝rVSVΔG-GFP，各組滴度變化差異不明顯，總質(zhì)粒用量低于3.67 μg時(shí)包裝效率明顯降低。骨架質(zhì)粒為5 μg時(shí)，輔助質(zhì)粒（pBS-N、pBS-P、pBS-L）的合適用量為3～9 μg，用量低于3 μg時(shí)包裝效率極低。骨架質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒用量較低時(shí)，或造成病毒基因組RNA及N、P、L蛋白表達(dá)量過低，而骨架質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒比例相差過大時(shí)難以形成持續(xù)復(fù)制單位。這與已報(bào)道的rVSV載體非復(fù)制缺陷型疫苗包裝條件較為一致[14]，各文獻(xiàn)中骨架質(zhì)粒用量為2～6 μg，輔助質(zhì)粒pBS-N、pBS-P、pBS-L比例近似為3∶5∶1，用量2～9 μg。

圖2 不同質(zhì)粒用量病毒感染BHK21-WI2細(xì)胞后CPE變化及熒光結(jié)果（100×）A1～A4：總質(zhì)粒用量依次為1/2（11.00 μg）、1/4（8.50 μg）、1/6（3.67 μg）、1/8（2.75 μg）；B1～B4：輔助質(zhì)粒用量依次為（1/2（8.50 μg）、1/4（4.25 μg）、1/6（2.83 μg）、1/8（2.16 μg）

2.4 包裝細(xì)胞系的影響

以2.3項(xiàng)結(jié)果確定優(yōu)化的質(zhì)粒用量為原骨架質(zhì)粒和輔助質(zhì)?？偭康?/2（11.00 μg），分別考察293T、BHK21-WI2細(xì)胞的包裝效率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)293T細(xì)胞系熒光細(xì)胞數(shù)量及包裝穩(wěn)定性顯著優(yōu)于BHK21-WI2細(xì)胞系（圖3），且293T細(xì)胞包裝能獲得高滴度的病毒。293T細(xì)胞感染病毒時(shí)CPE不明顯，生長較慢，而BHK21-WI2細(xì)胞包裝效率低于同條件包裝的293T細(xì)胞，生長快速，感染病毒后CPE明顯[14,17]。另外，我們還嘗試了BHK21和293T/Vero E6混合細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，293T/ Vero E6混合細(xì)胞體系包裝效率高于BHK21-WI2細(xì)胞，BHK21-WI2細(xì)胞與BHK21細(xì)胞包裝效率差異不明顯。

2.5 重組痘病毒vTF7-3作用時(shí)間的影響

采用BHK21-WI2細(xì)胞包裝時(shí)，熒光細(xì)胞數(shù)目較少且穩(wěn)定性較差，我們期望通過延長vTF7-3的作用時(shí)間來提高其病毒包裝效率。將vTF7-3的作用時(shí)間在1 h基礎(chǔ)上分別延至1.5和3 h，發(fā)現(xiàn)均可成功包裝病毒，且熒光細(xì)胞數(shù)量增多，滴度略有提高。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)vTF7-3以5～15 MOI感染細(xì)胞1 h或以5 MOI感染細(xì)胞1～4 h可成功包裝病毒。當(dāng)vTF7-3低于1 MOI感染1 h時(shí)，產(chǎn)生的T7RNA聚合酶量過少，導(dǎo)致后續(xù)包裝效率低。當(dāng)vTF7-3用量大于15 MOI或感染時(shí)間超過4 h時(shí)，包裝效率變化不明顯，甚至由于vTF7-3大量擴(kuò)增抑制VSV包裝。該結(jié)果與國外報(bào)道有部分差異，文獻(xiàn)報(bào)道vTF7-3用量為5～10 MOI、感染時(shí)間45～60 min[18]。最近也有采用重組真核載體表達(dá)T7RNA聚合酶，而不用vTF7-3的報(bào)道[18]。

2.6 轉(zhuǎn)染試劑作用時(shí)間的影響

同樣為提高BHK21-WI2細(xì)胞包裝效率，將轉(zhuǎn)染試劑作用時(shí)間延長至8、10、12、14 h，其他條件不變。本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)間為6～14 h時(shí)包裝效果較好，可見適當(dāng)提高轉(zhuǎn)染時(shí)間有利于提高包裝效率。當(dāng)轉(zhuǎn)染時(shí)間小于6 h時(shí)，質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞量過少，包裝效率低。轉(zhuǎn)染時(shí)間長于14 h時(shí)包裝效率未能提高甚至出現(xiàn)降低，這可能是轉(zhuǎn)染試劑作用時(shí)間過長導(dǎo)致細(xì)胞損傷，該結(jié)果比國外報(bào)道的轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)間（4～7 h）長[18]。

圖3 不同包裝細(xì)胞系包裝病毒感染BHK21-WI2細(xì)胞后的熒光觀察結(jié)果（100×）A：293T包裝細(xì)胞系組；B：BHK21-WI2包裝細(xì)胞系組；C：轉(zhuǎn)染pCAGGS-G質(zhì)粒的對照細(xì)胞組

2.7 rVSVΔG-ZE組的包裝結(jié)果

在rVSVΔG-GFP包裝條件優(yōu)化基礎(chǔ)上，對rVSVΔG-ZE進(jìn)行了病毒包裝嘗試，條件見表2。結(jié)果顯示，在3種條件下實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)明顯的CPE，如圖4所示，病毒均能包裝且滴度較高。

表2 TCID50法測定rVSVΔG-ZE滴度

3 討論

rVSV的包裝包括以下幾個(gè)主要方面：重組痘病毒vTF7-3感染細(xì)胞表達(dá)T7RNA聚合酶、轉(zhuǎn)染的輔助質(zhì)粒分別表達(dá)相應(yīng)蛋白（核蛋白N、磷蛋白P、基質(zhì)蛋白M、包膜蛋白G及大聚合酶蛋白L），骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄生成病毒基因組RNA，核蛋白N與基因組RNA組裝形成持續(xù)復(fù)制單位[17,19]。我們基于這些方面考察重組痘病毒vTF7-3的作用時(shí)間、總質(zhì)粒用量與輔助質(zhì)粒用量、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)間以及細(xì)胞系對rVSV包裝效率的影響。此外，表達(dá)的外源蛋白也是影響rVSV包裝的重要因素，如表達(dá)的外源蛋白有類似VSV野生型包膜GP蛋白的介導(dǎo)病毒與膜融合的性質(zhì)，則包裝效率高、擴(kuò)增能力強(qiáng)，而類似GFP自身無包膜蛋白性質(zhì)，則需要借助輔助質(zhì)粒pBS-G包裝形成復(fù)制缺陷性重組病毒，包裝效率、擴(kuò)增能力較低。VSV病毒包裝是一個(gè)多條件影響的過程，單一適宜條件或許能得到病毒，但綜合優(yōu)化各個(gè)條件才能獲得穩(wěn)定高效的高滴度病毒株。

圖4 rVSVΔG-ZE組感染BHK21-WI2細(xì)胞結(jié)果（100×）A：1/2（11.00 μg）全質(zhì)粒293T細(xì)胞包裝組；B：1/2（8.50 μg）輔助質(zhì)粒293T細(xì)胞包裝組；C：1/2（11.00 μg）質(zhì)粒vTF7-3作用4 h轉(zhuǎn)染試劑作用14 h于BHK21-WI2細(xì)胞包裝組；D：轉(zhuǎn)染pCAGGS-G質(zhì)粒的對照細(xì)胞組

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