李軼劉會占何志洲

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院院耳鼻咽喉頭頸外科，耳鼻咽喉頭頸科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室首都醫(yī)科大學(xué)(北京100730)2Department of Biomedical Sciences,Creighton University SchoolofMedicine

對于多細(xì)胞生物體來說，雖然每個細(xì)胞的基因組是相同的，但是每個細(xì)胞表達(dá)的基因（即轉(zhuǎn)錄組）各不相同。轉(zhuǎn)錄組是指一個細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄本，包括mRNAs、rRNAs、tRNAs以及其它非編碼RNA，它控制著不同細(xì)胞所表現(xiàn)出的功能和形態(tài)。轉(zhuǎn)錄組在單細(xì)胞水平被調(diào)節(jié)，甚至在同一類細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄組也會隨時間、環(huán)境有所不同。研究不同發(fā)育階段、生理、病理條件下的轉(zhuǎn)錄組對揭示細(xì)胞分化、增殖、衰老、代謝、病理變化、形態(tài)和功能特點(diǎn)具有重要意義。

哺乳動物的聽覺感受器(Corti’s器)由內(nèi)、外毛細(xì)胞和支持細(xì)胞構(gòu)成，內(nèi)毛細(xì)胞是感受器細(xì)胞，外毛細(xì)胞是效應(yīng)器細(xì)胞[1]。支持細(xì)胞包括內(nèi)指細(xì)胞、柱細(xì)胞、Deiters'細(xì)胞、內(nèi)緣細(xì)胞、Hensen細(xì)胞和Claudius細(xì)胞，為毛細(xì)胞提供必需的代謝、電解質(zhì)環(huán)境以維護(hù)其正常生理功能，并為Corti’s器的機(jī)械特性提供支撐[2]。毛細(xì)胞和支持細(xì)胞共同來源于聽囊內(nèi)的感覺前體細(xì)胞。在非哺乳動物如魚類、兩棲類和鳥類，支持細(xì)胞在毛細(xì)胞凋亡后可自發(fā)的轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞[3]。新生哺乳動物的內(nèi)指細(xì)胞、柱細(xì)胞在毛細(xì)胞凋亡后也能轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞[4,5]。成年哺乳動物的支持細(xì)胞則喪失這種能力[6]，因此分析內(nèi)耳Corti’s器各細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組對研究哺乳動物毛細(xì)胞再生的分子機(jī)理和尋找基因療法的靶點(diǎn)具有重要指導(dǎo)意義。

在單類細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究中，最大的困難是獲取足夠數(shù)量的高純度單一細(xì)胞?，F(xiàn)有的獲取單類細(xì)胞樣本的方法很難在內(nèi)耳組織中加以應(yīng)用。這是由于哺乳動物耳蝸組織的特殊性：細(xì)胞本身數(shù)量較少、分離困難、難以進(jìn)行體外培養(yǎng)，另外，成年動物的毛細(xì)胞易損傷，在體外只能存活很短的時間。因此對于成年哺乳動物耳蝸內(nèi)的各類細(xì)胞，很難獲得數(shù)量足夠的高純度的一類細(xì)胞來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究[7]。目前聽覺領(lǐng)域的此類研究大都局限在新生和胚胎動物的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞[8-10]。

采用微吸管單類細(xì)胞收集技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對內(nèi)耳細(xì)胞進(jìn)行單個分類收集，并獲得足夠的樣本量。微吸管細(xì)胞收集技術(shù)是將動物的耳蝸解剖出來后進(jìn)行消化，得到Corti’s器中各種單個離體活細(xì)胞，運(yùn)用微操縱器連接玻璃微電極在顯微鏡直視下，根據(jù)各種細(xì)胞的形態(tài)特征，用負(fù)壓吸引、收集單種活細(xì)胞的技術(shù)[11-13]。采用這種方式收集內(nèi)耳細(xì)胞，使分析成年動物的內(nèi)耳單類細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組成為可能[13,14]。

本文以成年小鼠為例，詳細(xì)介紹了耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的分離方法、辨認(rèn)特征，以及采用微吸管收集單類細(xì)胞的設(shè)備和方法，該方法同樣適用于低等動物如鳥類和魚類（斑馬魚）內(nèi)耳毛細(xì)胞的分離和收集。同時詳細(xì)介紹了進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究所采用的單類細(xì)胞RNA收集、提取、放大和逆轉(zhuǎn)錄的方法。

1 材料和方法

1.細(xì)胞的獲取和分離：使用CBA/J小鼠（25至30天齡，購買于美國Jackson Laboratory），性別不限。將基底膜與Corti’s器一起分離并轉(zhuǎn)移到含有酶消化培養(yǎng)液的小培養(yǎng)皿中（圖1-A，1）。酶消化培養(yǎng)液含有1ml Leibovitz’s-15(L-15)和1mgIV型膠原酶（Sigma）。在室溫下孵育5分鐘后，將組織用小吸管轉(zhuǎn)移到含有無酶培養(yǎng)液（L-15,7.35 pH，300mOsm）的小液槽（體積為0.8-1.0ml）中（圖1-A,2）。用小號移液管輕輕吹打組織以使細(xì)胞分離。然后將裝有毛細(xì)胞的小液槽（圖1-A,2）安放在裝有攝像機(jī)的倒置顯微鏡（Olympus IX71）的鏡臺上（圖1-B）。

2.分離細(xì)胞的收集：為了收集孤立的細(xì)胞，使用直徑為30μm左右的兩個輔助微吸管來接收和轉(zhuǎn)移細(xì)胞。微吸管由微電極拉制儀(Model P-97,Sutter Instrument)用直徑為1.5mm薄壁玻璃管拉制而成，尖端加熱拋光(Micro Forge MF-830,Nar?ishige)防止損傷細(xì)胞。微吸管分別安裝在兩臺Nar?ishige顯微操作器（MHW-3，Narishige，圖1-B，白色箭頭所指）上的兩個獨(dú)立的電極支架中（圖1-B，黃色箭頭所指）。通過移動顯微操作器和顯微鏡載物臺，可將要收集的細(xì)胞定位在微吸管尖端附近。微吸管的另一端通過電極支架的出口與2mm直徑的硅膠管相連，并連接到微米螺旋推動式注射器（圖1-C），以提供正壓或負(fù)壓，以便吸取或排出細(xì)胞。圖2顯示的是一個外毛細(xì)胞在被吸入微吸管之前（圖2-A）和之后（圖2-B）的顯微鏡下照片。微吸管內(nèi)充滿細(xì)胞外液，當(dāng)4至5個細(xì)胞吸入玻璃微吸管后，將微吸管從液槽中取出并迅速轉(zhuǎn)移到含有50μlRNAlater（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）的微量離心管的蓋子里（圖1-A，3），并通過施加正壓將細(xì)胞從移液管中排出。微量離心管要放置在冰塊中以防止細(xì)胞收集期間RNA的降解。約500個以上細(xì)胞所獲得的總RNA可滿足高質(zhì)量RNA測序分析的要求，重復(fù)這些步驟，直到采集到足夠的細(xì)胞數(shù)。在正常情況下，我們可以從每只小鼠中收集到約50個內(nèi)毛細(xì)胞和100-200個外毛細(xì)胞，時間在一小時內(nèi)。

為了獲得高純度的細(xì)胞，常采取以下方式以避免所采集的樣本被其他類型的細(xì)胞污染。首先，要確定收集的細(xì)胞種類。哺乳動物的內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞和支持細(xì)胞都具有獨(dú)特的形態(tài)特征，很容易根據(jù)其形態(tài)識別[11]。對于任何形態(tài)特征不明確的細(xì)胞不予以收集。其次，要確保所收集的細(xì)胞表面沒有附著任何其他類型的細(xì)胞。第三，注意施加在微吸管上的吸力，以避免吸入雜細(xì)胞，在微吸管移出培養(yǎng)液的瞬間要保持壓力恒定防止吸入過多的液體和其他細(xì)胞。

3.RNA提取和純化和反轉(zhuǎn)錄：將所獲得的樣本拿到專門處理RNA的房間，在專門處理RNA的超凈臺上進(jìn)行RNA提取。使用Qiagenmicro RNA isolation kit進(jìn)行細(xì)胞裂解、總RNA提取和收集，所收集的RNA不要存放，使用Qubit@RNA HSAssay試劑盒在Qubit?2.0熒光計上進(jìn)行RNA數(shù)量的檢測，使用Agilent RNA 6000 Pico試劑盒，在Agilent 2100生物檢測儀器上測定RNA的質(zhì)量，若樣本存在少量DNA污染，可采用DNA酶消化去除污染。由于從內(nèi)耳細(xì)胞中可獲得的RNA總量相對較少，因此獲得較高質(zhì)量的RNA后，建議盡快將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，以保證RNA不會因降解造成質(zhì)量的降低。使用Colontech Laboratories cDNA合成試劑盒（SMARTer@UltraTM Low input RNA for illu?mine@sequencing-HV kit）將所獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增和純化。同樣，使用Qubit?2.0儀器對擴(kuò)增及純化后所獲得的cD?NA進(jìn)行樣本數(shù)量檢測，使用Agilent High Sensitity DNA試劑盒來檢測cDNA的質(zhì)量。然后將可所獲得的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。對每種采集的細(xì)胞我們都分別制備三個樣本，以保證樣本的生物重復(fù)性和可靠性。

2 結(jié)果

每種單類細(xì)胞收集500個左右即可滿足轉(zhuǎn)錄組分析的需要，視細(xì)胞種類不同約需7-10只小鼠，每種細(xì)胞均進(jìn)行三個生物學(xué)重復(fù)。

2.3.3 5-HT 3RA的應(yīng)用情況 本研究中患者應(yīng)用的 5-HT3RA 包括 Tro、Pal和 Ond。“指南”推薦 Tro 只在第1天靜脈應(yīng)用或口服5mg。有59例（53.15%）連續(xù)多日應(yīng)用Tro，療程過長。應(yīng)用Pal存在的主要問題與Tro一致，有11例（9.91%）應(yīng)用Pal療程過長。有4例將Pal與Tro重復(fù)應(yīng)用，因藥物與受體的結(jié)合存在飽和現(xiàn)象，重復(fù)用藥并不能增強(qiáng)療效，反而會增大不良反應(yīng)的發(fā)生率，兩藥重復(fù)應(yīng)用為不合理用藥。Ond應(yīng)用主要存在超致吐級別應(yīng)用、給藥劑量偏小和療程不合理。Ond為短效的5-HT3RA，應(yīng)用Ond的例數(shù)較Pal和Tro少。見表6。

1、內(nèi)耳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征及辨認(rèn)：小鼠的內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞、柱細(xì)胞和Deiters'細(xì)胞在分離后常常保持了它們特有的形態(tài)學(xué)特征，在光學(xué)顯微鏡下容易辨認(rèn)，下面列舉了一些圖例來描述它們的形態(tài)學(xué)特征。圖2-C和圖2-D中所顯示的是分離得到的成年小鼠單個內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞、柱細(xì)胞和Deiters'細(xì)胞在光鏡下（使用DIC鏡頭）的照片，圖2-E顯示的是雞的長細(xì)胞（tall hair cell）和短細(xì)胞（shorthair cell）的照片，長細(xì)胞的功能與哺乳動物內(nèi)毛細(xì)胞類似，短細(xì)胞的功能與外毛細(xì)胞功能類似。圖2-F顯示的是斑馬魚內(nèi)耳的毛細(xì)胞的照片。哺乳動物內(nèi)毛細(xì)胞的形狀通常被描述為燒瓶狀，在表皮板和胞體之間有一個狹窄的頸部，細(xì)胞核位于細(xì)胞中下部。小鼠內(nèi)毛細(xì)胞的直徑約8-10μm，長度約15-20μm。外毛細(xì)胞呈圓柱形，細(xì)胞核位于細(xì)胞底部，小鼠外毛細(xì)胞的直徑約6μm，長度約15-32μm，兩類毛細(xì)胞頂端都有約4-5μm長的纖毛，纖毛是毛細(xì)胞特征性標(biāo)記。另外，兩類毛細(xì)胞都具有豐富的線粒體（在光鏡下呈顆粒狀并具有明顯的布朗運(yùn)動）。柱細(xì)胞呈柱狀，可以明顯的看見胞漿內(nèi)縱行排列的絲狀結(jié)構(gòu)即Actin，表皮板端膨大并沒有纖毛，Deiters'細(xì)胞具有特征性的指突，如圖2-D中黑色箭頭所示，還具有典型的容納外毛細(xì)胞突觸端的杯狀結(jié)構(gòu)（圖2-D中白箭頭所示）。所獲得的單細(xì)胞還可根據(jù)不同實(shí)驗?zāi)康挠脕磉M(jìn)行分子生物學(xué)、單細(xì)胞電生理、形態(tài)學(xué)實(shí)驗。圖3-A所顯示的是使用掃描電鏡研究單個外毛細(xì)胞的形態(tài)的掃描電鏡照片，圖3-B顯示的是使用電壓鉗技術(shù)記錄外毛細(xì)胞離子通道的光鏡照片。

2、使用微吸管單類細(xì)胞收集法所獲取的單類細(xì)胞總RNA樣本的可靠性：從采集到的單類細(xì)胞樣本中提取出的總RNA，我們進(jìn)行了的RNA樣品的濃度以及質(zhì)量的檢測。根據(jù)我們的經(jīng)驗，RNA樣本的濃度至少要保證在100ng/ml以上才能滿足后續(xù)實(shí)驗要求，我們以此法所獲得的單類細(xì)胞總RNA樣本濃度一般都可以達(dá)到4μg/ml左右。為了保證能在RNA-seq檢測中可以測到盡可能完整的mRNA序列，還需對總RNA樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測。RNA的質(zhì)量判斷包括RNA完整性及純度兩個方面，在檢測RNA樣本所獲得的電泳圖中，如果28S和18S條帶清晰，且亮度比28S:18S＞1，則證明該樣本的完整性很好，基本無降解。同時，點(diǎn)樣槽內(nèi)或附近不應(yīng)存在其他熒光區(qū)帶，否則表明RNA樣品中有DNA污染。圖4-A中顯示的是我們以此方法獲取的小鼠外毛細(xì)胞總RNA樣本（使用Agilent RNA 6000 Pico試劑盒，在Agilent2100生物分析儀上測定）的質(zhì)量，可以看到18S和28S這兩個核糖體RNA的電泳峰分別出現(xiàn)在38秒和46秒，同時兩峰呈現(xiàn)高、尖的形態(tài)，說明RNA降解少、完整性好。Agilent2100生物檢測儀器自帶分析軟件，根據(jù)信號面積、強(qiáng)度、比值等信息計算RNA完整值（RIN）對RNA完整度進(jìn)行評估，圖中所顯示的樣本檢測后的RIN值為9.2（10為滿分）。通常選擇用于測序的RNA樣品的RIN值至少要大于8.0，我們用于測序的總RNA樣本的RIN都為9.0以上。

同樣，在進(jìn)行RNA-seq的過程中，也需要一些指標(biāo)來驗證測序樣本的質(zhì)量，以保證測序結(jié)果的可靠性。首先，數(shù)據(jù)分析的第一步，要把測到mRNA片段，比對（Mapping）到基因組上，驗證測序中所捕獲到的mRNA是否完整。圖4-B上方顯示的是成年小鼠外毛細(xì)胞RNA測序樣本中捕獲的mRNA片段在參考基因上的分布均勻性統(tǒng)計圖，可見圖形的5’端的曲線非常飽滿，高度和3’端幾乎相等，中間區(qū)域分布均勻，無偏向性分布，這表明測序中所捕獲的mRNA大部分是完整的。圖4-B中下方顯示的是對于所捕獲的mRNA樣本統(tǒng)計數(shù)進(jìn)行基因組比對后的分布情況（Alignment Distribution）。圖4-C中顯示的是所捕獲的mRNA樣本統(tǒng)計數(shù)進(jìn)行基因組比對后總體情況，能夠比對上的樣本統(tǒng)計數(shù)的比例是一個重要的質(zhì)量控制參數(shù)，這個參數(shù)能指示整個測序的準(zhǔn)確性和是否有污染DNA的存在。一般情況下，樣本統(tǒng)計數(shù)的比對率能達(dá)到90%以上就表明測序樣本具有相當(dāng)高的質(zhì)量，當(dāng)使用轉(zhuǎn)錄組作為參考時，一般還會將這個參數(shù)下調(diào)。從圖中可見我們所獲得標(biāo)本的總比對率高達(dá)95.24%。

3、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取及利用單類細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：RNA-Seq數(shù)據(jù)分析時使用TopHat v1.4.1將樣品分別定位到小鼠基因組(mm10，GRCm38)。使用 HTSeq-count從配對序列中得到基因表達(dá)，使用DESeq來識別差異表達(dá)的基因，假發(fā)現(xiàn)率（FDR）設(shè)定在5%，至少有2倍的變化閾值，歸一化讀取計數(shù)設(shè)置為10%的中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化閱讀計數(shù)。Entrez Gene,HGNC,OMIM和Ensembl數(shù)據(jù)庫用于驗證、參考和分析。

我們已經(jīng)使用微吸管收集法和RNA-seq技術(shù)成功獲得了成年小鼠內(nèi)、外毛細(xì)胞、柱細(xì)胞、Deit?ers'細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（所有數(shù)據(jù)均已上傳，可在SHARED Harvard Inner-Ear Laboratory Database:https://shield.hms.harvard.edu/index.htm l查閱）。通過對內(nèi)耳細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，我們可以獲得很多重要信息。除了分析哪些基因在這幾類細(xì)胞中共同表達(dá)、差異表達(dá)、特異性表達(dá)之外，我們也對比分析了耳聾基因在內(nèi)、外毛細(xì)胞、柱細(xì)胞和Deiters'細(xì)胞上表達(dá)情況。

目前已知大約有120個基因的突變或缺陷與遺傳性綜合征性耳聾或非綜合征性耳聾的發(fā)生有關(guān)[15]，去除X染色體連鎖和線粒體遺傳基因后，我們對其中101個基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析比較。以確定他們在內(nèi)、外毛細(xì)胞、柱細(xì)胞和Deiters細(xì)胞中表達(dá)情況的差異。圖5顯示了這些耳聾相關(guān)基因在內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞、柱細(xì)胞、Deiters細(xì)胞中的表達(dá)水平。在所有四種細(xì)胞類型中，有7個基因（Hgf，Gjb3，Mir96，Col4a6，F(xiàn)oxi1，Myo1a和Pax3）沒有檢測到表達(dá)，有5個基因（Tecta，Esrrb，Diap3，Col4a3和Edn3）的表達(dá)水平非常低，或者只在其中一到兩種細(xì)胞類型中可以檢測到表達(dá)。在毛細(xì)胞中表達(dá)的大多數(shù)基因也在柱細(xì)胞和Deiters細(xì)胞中表達(dá)，但它們中的大部分表達(dá)水平不同。這些基因在毛細(xì)胞和支持細(xì)胞中的表達(dá)譜為了解人類聽力損失的病理機(jī)制提供了重要的分子基礎(chǔ)。

圖1 使用微吸管收集細(xì)胞所用的設(shè)備、裝置。Fig.1 Setup for using suction pipette technique for collecting isolated hair cells and supporting cells.

圖2 使用微電極收集毛細(xì)胞及光鏡下內(nèi)耳各類細(xì)胞的圖例。Fig.2 Imagesof using suction pipetteand isolated hair cells.

圖3 游離的單個外毛細(xì)胞Fig.3 Imagesof isolated outerhair cells

圖4 從小鼠外毛細(xì)胞提取的RNA質(zhì)量分析及RNA-seq質(zhì)量檢測結(jié)果。Fig.4:Quality analyses of RNA extracted from mouse outer hair cells.

圖5 除外X染色體連鎖和線粒體遺傳基因后，101個耳聾相關(guān)基因在內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞、柱細(xì)胞、Deiters細(xì)胞中的表達(dá)水平.（數(shù)據(jù)為三個生物學(xué)重復(fù)的均值）Fig.5 Expression(RPKM)values of 101 deafness-related genes in IHCs,OHCs,pillar cells and Deiters’cells from adultmouse cochleae.（the datawere from means of three biological repeats foreach cellpopulation）

3 討論

單一種類細(xì)胞的異質(zhì)性對其功能、形態(tài)具有至關(guān)重要的影響，而大量異質(zhì)細(xì)胞群體的分析只能提供關(guān)于群體的平均數(shù)據(jù)，某些相對微小但潛在相關(guān)的重要信息會在群體的數(shù)據(jù)背景下丟失，因此單類細(xì)胞分析在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域具有越來越重要的作用[16,17]。為了實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分析，需要首先進(jìn)行單細(xì)胞分選、收集以獲得足夠的單類細(xì)胞樣本。目前，單類細(xì)胞的分離面臨的主要挑戰(zhàn)是分離的產(chǎn)量和質(zhì)量，或換句話說，所分離細(xì)胞的完整性、純度以及單類細(xì)胞分離方法的效率[18,19]。目前被廣泛采用的有以下三類單細(xì)胞分選方法：1、使用流體技術(shù)的分選方法如：流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（Fluoresence activated cellsorting，F(xiàn)ACS）；2、使用激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser capturemicrodissection technique LCM）；3、人工細(xì)胞采集/顯微操作法（Manual cellpicking）。

流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（FACS）的工作原理是將熒光染色或標(biāo)記的單細(xì)胞懸液放入樣品管中，并用高壓壓入充滿鞘液的流動室。在鞘液的包裹和推動下，細(xì)胞被排成單列，以一定速度從流動室噴口噴出，流動室的噴口上配有一個超高頻的壓電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測細(xì)胞就分散在這些液滴之中。細(xì)胞性質(zhì)在進(jìn)入液滴以前已經(jīng)被測定，如果其特征與被選定的細(xì)胞特征相符，則儀器在這個被選定的細(xì)胞剛形成液滴時給整個液柱充以指定的電荷，使其形成液滴時帶有特定的電荷，而未被選定細(xì)胞的細(xì)胞液滴和不含細(xì)胞的空白液滴不被充電。帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場，按照所帶電荷符號發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，完成分類收集[20-23]。

FACS操作相對簡便，分選效率高，細(xì)胞分選精確度高（99%以上），速度快[20]。先進(jìn)的流式細(xì)胞儀的分選速度可達(dá)每秒25000個細(xì)胞以上，因此FACS已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究，但是有幾個缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用。首先，細(xì)胞在機(jī)器中的快速流動過程中，機(jī)器和非特異性的熒光分子可能損壞所分選的細(xì)胞，使分離失敗[24]。其次，在FACS分析之前，細(xì)胞需要進(jìn)行單獨(dú)的處理以產(chǎn)生帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞，這個過程非常耗時[18,19,24,25]。上述兩個原因可使分選細(xì)胞的RNA質(zhì)量受到影響或發(fā)生變化。

激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM），是一種在顯微鏡可視條件下，直接從冰凍或石蠟包埋組織切片中獲取目標(biāo)細(xì)胞的方法[26]。其工作原理是顯微鏡直視下選擇目標(biāo)細(xì)胞，機(jī)械臂控制覆有熱塑膜（Ethyl?ene Vinylacetate，EVA）的塑料帽，放到組織切片上的目標(biāo)部位，通過低能紅外激光脈沖激活熱塑膜，瞬間升溫可在使EVA膜局部熔化，熔化的EVA膜滲透到切片上極微小的組織間隙中，并在幾毫秒內(nèi)迅速凝固。組織與膜的粘合力超過了其與載玻片間的粘合力，從而可以選擇性地轉(zhuǎn)移目標(biāo)細(xì)胞。激光脈沖通常持續(xù)0.5～5.0毫秒，并且可在整個塑料帽表面進(jìn)行多次重復(fù)，從而可以迅速分離大量的目標(biāo)細(xì)胞[27]。

LCM最顯著的優(yōu)點(diǎn)在于其迅速、準(zhǔn)確和多用途的特性[28]。根據(jù)組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及所需的切割精確度，來選擇激光束的直徑大小，可以迅速獲取大量的目標(biāo)細(xì)胞，捕獲細(xì)胞和剩余組織的形態(tài)學(xué)特征均保持完好，可以較好地控制捕獲細(xì)胞的特異性[29,30]。但此項技術(shù)要求組織表面不能有蓋玻片，沒有蓋片、封片劑和組織間的折射率匹配，干燥組織的折射性質(zhì)會導(dǎo)致在高放大倍數(shù)下模糊細(xì)胞細(xì)節(jié)，使其視覺分辨率受到很大限制，因而無法應(yīng)用于那些本身缺乏一定結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的復(fù)雜組織[24]。同時，要進(jìn)行有效LCM，操作人員必須具有通過顯微鏡檢查形態(tài)特征正確鑒定復(fù)雜組織中細(xì)胞亞群或單細(xì)胞的能力。此外，LCM會導(dǎo)致很多技術(shù)偽差，包括在制備組織切片期間對細(xì)胞的切割，以及激光切割能量對DNA或RNA進(jìn)行紫外線損傷[18,31]。同時，激光會產(chǎn)生約1μm的切割寬度。因此，解剖靶細(xì)胞同時要避免相鄰細(xì)胞或其他非特異性片段的污染，否則會導(dǎo)致假陽性和假陰性。解剖太保守會造成不能包括完整的整個細(xì)胞，導(dǎo)致用于下游分析的RNA收獲不足，但是解剖過多則會導(dǎo)致將不想要的RNA包含到樣品中[18,24]。

人工細(xì)胞采集/顯微操作法：人工細(xì)胞采集系統(tǒng)由顯微操縱器、倒置顯微鏡、微量移液管構(gòu)成?？梢栽陲@微鏡下觀察和拍攝每個分離的單細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的分離（圖1D）[19,32]。這是一種簡單，方便和有效的隔離單細(xì)胞的方法，在配有膜片鉗系統(tǒng)的電生理實(shí)驗室中可以容易地進(jìn)行此類顯微操作。與需要從固定組織切片中分離單細(xì)胞的LCM不同，人工細(xì)胞采集對游離或培養(yǎng)的活細(xì)胞進(jìn)行收集，顯微操作在此過程中起到重要作用，這種整細(xì)胞的收集方式保證了完整的細(xì)胞分離，并最大限度地減少了在反轉(zhuǎn)錄步驟之前的RNA的損失[18,33]。然而，此種分選方式工作效率相對較低，同時需要操作人員具有高度的專業(yè)技能。人工細(xì)胞采集技術(shù)在分離培養(yǎng)的活細(xì)胞中有大量的應(yīng)用，也被廣泛應(yīng)用于大量培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞中。對于數(shù)量豐富的單個游離細(xì)胞如精子細(xì)胞或培養(yǎng)的活細(xì)胞，可使用此方法方便的收獲數(shù)量豐富的單個細(xì)胞[34-36]。

由于FACS和LCM技術(shù)的局限性，使得此兩種分選技術(shù)難以在成年動物內(nèi)耳組織細(xì)胞分選中加以應(yīng)用。針對內(nèi)耳組織的自身特點(diǎn)，我們將現(xiàn)有的人工細(xì)胞采集技術(shù)進(jìn)行了改良，摸索出了適合應(yīng)用于內(nèi)耳組織單類細(xì)胞收集的微吸管細(xì)胞收集技術(shù)方法。

使用該方法進(jìn)行內(nèi)耳單類細(xì)胞收集及轉(zhuǎn)錄組分析具有顯著優(yōu)勢。首先，由于內(nèi)耳組織中各類細(xì)胞形態(tài)的高度特異性，使得根據(jù)細(xì)胞獨(dú)特形態(tài)在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞辨認(rèn)具有高度準(zhǔn)確性，微吸管內(nèi)耳細(xì)胞收集是根據(jù)細(xì)胞的獨(dú)特形態(tài)來進(jìn)行單種細(xì)胞收集，加之分選過程中防止污染的控制措施，可使分選出的細(xì)胞達(dá)到很高純度。有效的避免了使用FACS分選過程中因細(xì)胞黏附所造成的雜細(xì)胞污染，以及使用LCM細(xì)胞分選過程中解剖靶細(xì)胞所帶來的相鄰細(xì)胞或周圍其他非特異性組織的污染。

其次，這種對內(nèi)耳細(xì)胞的收集方法可以避免使用FACS分選過程中對細(xì)胞的機(jī)械損傷和分選時間較長所造成的RNA的降解。通過對我們收集樣本的RNA質(zhì)量分析和測序過程中的質(zhì)量控制指標(biāo)的驗證可以看出，使用微吸管收集技術(shù)獲得的內(nèi)耳單細(xì)胞樣本的RNA質(zhì)量好、純度高，沒有污染及降解，而采用FACS及LCM法均難以獲得如此高質(zhì)量的RNA樣本。

第三，由于內(nèi)耳組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及其他細(xì)胞分選技術(shù)所存在的技術(shù)限制，若需要對成年的哺乳動物內(nèi)耳細(xì)胞樣本進(jìn)行單種收集，其他單細(xì)胞分選技術(shù)很難成功應(yīng)用。熒光分選技術(shù)只適合于帶有熒光的細(xì)胞，這大大降低了該技術(shù)的適應(yīng)性。而微吸管細(xì)胞收集法的應(yīng)用，可以收集到實(shí)驗需要的，最能代表功能成熟的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的成年動物的內(nèi)耳細(xì)胞。

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