莊璐 萬劍華 黃浩杰 李兆申 紀(jì)保安

胰腺腺泡細(xì)胞的離體制備可從人、豬、禽類的胰腺中獲取，但既往的研究主要在于鼠類(包括大鼠、小鼠和荷蘭豬)。1972年Amsterdam和Jamieson[1]首次報(bào)道動物體內(nèi)胰腺腺泡的分離方法，目前所采用的標(biāo)準(zhǔn)方法是基于1978年報(bào)道的提取方法的改進(jìn)[2-3]，但這些分離方法均耗時(shí)較長。本研究對小鼠胰腺腺泡細(xì)胞的提取和純化進(jìn)行了簡化，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

8～12周健康成年野生型C57BL/6(Black 6)小黑鼠，雌雄不限，體重23～28 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，在第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室的清潔級環(huán)境下由專人飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)型進(jìn)食和飲水。

膠原酶溶液用含1%雙抗生素及0.1 mg/ml胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor, SBTI, Sigma #T9003)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco #12273)配制，終濃度為100 U/ml。4%小牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)溶液用上述同樣的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液配制。

淀粉酶溶液用含0.05 mol/L NaCl、0.02 mol/L NaH2PO4、終濃度為0.02% NaN3的溶液(pH 7.4)配制，置4℃保存。Phadebas溶液用1粒phadebas amylase substrate藥片溶于14 ml淀粉酶溶液配制，在加入樣本之前需不停漩渦攪拌。

二、實(shí)驗(yàn)方法

以斷頸法或二氧化碳麻醉法處死小鼠，固定于超凈工作臺上，皮膚消毒后，在小鼠腹部生殖區(qū)至隔膜區(qū)間剪開一個(gè)V字型切口，于肝臟下緣找到脾臟和胰腺，快速切除完整胰腺，置PBS溶液，去除多余脂肪及淋巴組織后將完整胰腺移入盛有5～7 ml膠原酶溶液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。用5 ml注射器吸取培養(yǎng)皿中的膠原酶溶液，以27 G小針頭多次往胰腺內(nèi)注射，直到胰腺變大，組織間質(zhì)變透明，類似水腫狀態(tài)(圖1)。將胰腺剪成5 mm～1 cm大小的組織塊，連同培養(yǎng)皿中的膠原酶溶液一起移入50 ml塑料燒瓶中，充入95%氧氣，迅速蓋緊瓶蓋，置37℃旋轉(zhuǎn)水浴槽內(nèi)，以120～150 r/min震蕩10～15 min。取出燒瓶，倒掉瓶內(nèi)的膠原酶溶液，加入5 ml新鮮配制的膠原酶溶液，充入95%氧氣后繼續(xù)在37℃水浴槽內(nèi)以同樣轉(zhuǎn)速繼續(xù)震蕩40～60 min。取出燒瓶，用10 ml移液器上下吹打成細(xì)胞懸液，經(jīng)150 μm孔徑的無菌尼龍篩網(wǎng)過濾，待其自然沉淀，棄上清，將底部沉淀的細(xì)胞移入4% BSA溶液中自然沉淀以純化細(xì)胞。若移液器吹打后仍有較多較大胰腺組織塊未被消化，可重復(fù)上述操作。以50×g離心2 min后棄上清，此時(shí)沉淀細(xì)胞為純化后的胰腺腺泡細(xì)胞，為防止細(xì)胞貼壁可將細(xì)胞移至含有0.5%～1% BSA的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，以移液器吹打混懸，置入細(xì)胞培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)30 min。

圖1 被膠原酶溶液完全充盈的新鮮小鼠全胰腺組織

將腺泡細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50 ml離心管，靜置沉淀后棄上清，加入30 mlDMEM培養(yǎng)液洗滌，吹打混勻，取2 ml細(xì)胞(約1×105個(gè))分裝于血液稀釋管內(nèi)，分別加入1、50、100、1 000 mol/L CCK-8，每組設(shè)3管，以不加CCK-8的細(xì)胞作為對照，置37℃旋轉(zhuǎn)水浴槽內(nèi)以100 r/min震蕩培養(yǎng)30 min。冰上放置5 min后取100 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清移至新的DEPC管，放置冰上保存。每管細(xì)胞沉淀同剩余上清液一起混均，取1 ml置冰上超聲破碎后再以DMEM稀釋10倍。取10 μl培養(yǎng)上清液或超聲破碎后稀釋10倍的細(xì)胞混懸液，分別與20 μl淀粉酶溶液置冰上混合，總體積為30 μl。以單加30 μl淀粉酶溶液作為對照。所有各樣本內(nèi)加入1 ml Phadebas溶液，迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴鍋水浴10～15 min，期間不斷上下震蕩混勻，當(dāng)不同組間樣本顏色變化差異明顯時(shí)(淀粉酶水平高變藍(lán))再次同時(shí)移入冰盒內(nèi)，加4 ml 0.05 mol/L NaOH終止反應(yīng)，輕柔上下顛倒混勻，4℃ 4 000 r/m低溫離心5 min。上分光光度儀，以空白孔調(diào)0，測各管在620 nm波長處的吸光值(A620值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成相應(yīng)淀粉酶水平，總淀粉酶水平是測定值的10倍，以不同上清液淀粉酶水平與總淀粉酶水平的百分比繪制不同CCK-8濃度刺激后腺泡細(xì)胞分泌的淀粉酶水平的曲線。

結(jié) 果

一、細(xì)胞培養(yǎng)及CCK-8刺激后的細(xì)胞形態(tài)變化

光鏡下可見腺泡細(xì)胞在培養(yǎng)液中散在懸浮分布，狀態(tài)較好的腺泡細(xì)胞多呈團(tuán)狀，其基底外側(cè)區(qū)域表面呈光滑圓形且沒有泡狀物，胞質(zhì)清晰，頂端區(qū)域被數(shù)百個(gè)酶原顆粒包圍，顏色較暗，細(xì)胞核位于囊泡狀區(qū)域的基底部，培養(yǎng)液中未見明顯細(xì)胞碎片(圖2A)。新鮮提取的腺泡細(xì)胞可置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)懸浮培養(yǎng)24～48 h，但培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后就逐漸失去細(xì)胞極性和細(xì)胞分泌功能。培養(yǎng)后期，腺泡細(xì)胞轉(zhuǎn)為單層細(xì)胞，且酶活性消失。加入CCK-8刺激后30 min，光鏡下見腺泡細(xì)胞基底部外側(cè)產(chǎn)生不規(guī)則泡狀物，這是腺泡細(xì)胞經(jīng)CCK-8刺激后受損傷的標(biāo)志(圖2B)。

圖2 新鮮提取的小鼠胰腺腺泡細(xì)胞(2A)及100 pmol/L CCK-8刺激30 min后的腺泡細(xì)胞(2B)

二、CCK-8刺激后腺泡細(xì)胞淀粉酶的釋放水平

未加CCK-8刺激組腺泡細(xì)胞的淀粉酶基礎(chǔ)分泌水平約占總淀粉酶分泌水平的2.5%；CCK-8刺激后腺泡細(xì)胞分泌的淀粉酶水平升高，CCK-8濃度為50 pmol/L時(shí)淀粉酶分泌水平達(dá)到峰值，該比例上升為(12.83±1.04)%，接近基礎(chǔ)分泌水平的5倍。隨后高于此濃度CCK-8刺激時(shí)細(xì)胞分泌的淀粉酶水平/總淀粉酶水平百分比下降(圖3)。

討論

胰腺腺泡細(xì)胞占據(jù)胰腺實(shí)質(zhì)的90%，其主要作用是合成和分泌消化酶[4]。有研究者認(rèn)為腺泡細(xì)胞的損傷參與了胰腺炎的初始階段[1，5]，急性胰腺炎的胰腺形態(tài)學(xué)改變已被證實(shí)是由于胰腺腺泡細(xì)胞合成和分泌的酶導(dǎo)致腺體自身消化所引起[6]，因此獲得穩(wěn)定可靠的胰腺腺泡細(xì)胞可為胰腺疾病的基礎(chǔ)研究提供重要工具和平臺。然而，長期以來胰腺腺泡細(xì)胞的分離和提純均較為棘手。

圖3 不同濃度CCK-8離體刺激胰腺腺泡細(xì)胞30 min后的淀粉酶分泌曲線

Dorrell等[7]使用熒光激活細(xì)胞分選法(fluoresc-ence-activated cell sorting, FACS)有效分離了小鼠胰腺腺泡、導(dǎo)管及內(nèi)分泌細(xì)胞，但該方法較為復(fù)雜，需要以熒光標(biāo)記特定抗體進(jìn)行細(xì)胞分選，對其技術(shù)水平有較高要求，且分選出來的胰腺腺泡細(xì)胞缺失部分初始結(jié)構(gòu)。 此外由于正常胰腺腺泡細(xì)胞可被蛋白水解酶分解或被Ca2+等螯合劑損傷，腺泡細(xì)胞的體外培養(yǎng)更為困難。Gout等[8]使用含有HEPES、膠原酶和胰蛋白酶抑制劑的Hank′s消化液分離胰腺腺泡細(xì)胞，并在培養(yǎng)液中加入表皮生長因子體外培養(yǎng)腺泡細(xì)胞可達(dá)1周以上，但該法提取的腺泡細(xì)胞會在培養(yǎng)過程中加速腺泡細(xì)胞向?qū)Ч軜蛹?xì)胞的轉(zhuǎn)變。張樺等[9]用Hank′s消化液內(nèi)灌注法機(jī)械提取腺泡細(xì)胞，何忠野和郭仁宣[10]向大鼠胰膽管內(nèi)逆行注射膠原酶溶液提取腺泡細(xì)胞，王連才等[11]用Hank′s消化液改進(jìn)法提取大鼠胰腺腺泡細(xì)胞，以上研究雖然都對經(jīng)典提取方法有不同程度改進(jìn)，也獲得了符合要求的腺泡細(xì)胞，但在一定時(shí)間范圍內(nèi)胰腺組織的消化并不充分，同時(shí)也對胰腺細(xì)胞的功能產(chǎn)生了不同程度的損傷。以往文獻(xiàn)中所提到的胰腺腺泡分離方法耗時(shí)均較長，通常需要在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天新鮮配置或購置Hank′s液、調(diào)節(jié)溶液pH值等。此外，目前最為常用的胰腺腺泡細(xì)胞系是從移植性大鼠胰腺癌組織中分離提取的AR42J細(xì)胞[12]以及從彈性蛋白酶I/SV-40 T抗原融合基因誘導(dǎo)的成年小鼠胰腺癌組織中分離提取的266-6細(xì)胞[13]。本研究采用的改進(jìn)方法能快速從小鼠胰腺成功分離提純質(zhì)量較好的腺泡細(xì)胞，過程較其他研究更為簡便且經(jīng)濟(jì)，所用到的膠原酶和胰蛋白酶抑制劑、BSA試劑、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液均為常規(guī)試劑，無需額外調(diào)節(jié)溶液的pH值，提取過程中細(xì)胞離心次數(shù)較少，降低了細(xì)胞污染和損傷概率。

分泌淀粉酶能力是胰腺腺泡細(xì)胞的重要功能之一。CCK在食物消化的刺激后調(diào)控胰腺外分泌的功能中起主要作用，胰腺炎動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统Ｊ褂肅CK或CCK類似物(雨蛙素等)刺激胰腺細(xì)胞及胰腺分泌大量消化酶，CCK對胰腺急性損傷的刺激程度具有明顯的時(shí)間和劑量依賴性[14-15]。本法提取的胰腺腺泡細(xì)胞在CCK-8刺激后的淀粉酶分泌水平曲線結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的[16]使用配制過程繁瑣的Krebs-Ringer bicarbonate HEPES (KRBH)溶液提取腺泡細(xì)胞的曲線較為一致，說明本法提取的腺泡細(xì)胞功能活性保持較好，非常適合用于與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對應(yīng)的胰腺炎體外造模的腺泡細(xì)胞病理生理變化相關(guān)的研究。

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