支曉陽 畢文姿 吳慶 李佳慧 董通雨 張藝之 董郭楓 周鐵麗

肺炎克雷伯菌是造成醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌，可引起人體多部位感染[1]。隨著抗菌藥物的廣泛使用甚至濫用，多重耐藥和廣泛耐藥肺炎克雷伯菌檢出率不斷增加，尤其對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥菌株的大量出現(xiàn)，使臨床抗感染治療面臨“束手無策”的局面[2]。復方新諾明為甲氧芐啶和磺胺甲惡唑的復方制劑，對多種革蘭陰性菌、革蘭陽性菌具有協(xié)同抑菌、殺菌作用，且對多重耐藥菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染具有良好的治療效果[3]。研究表明，肺炎克雷伯菌臨床分離株對復方新諾明的逐年耐藥率較平穩(wěn)，且耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對復方新諾明仍保持一定程度的敏感性[4]。整合子是多種抗菌藥物耐藥基因水平傳播的重要因素，可捕獲、重排和表達耐藥基因，與復方新諾明等多種抗菌藥物的耐藥性相關[5]。目前尚缺乏關于肺炎克雷伯菌內整合子分布及其與耐藥表型相關性的系統(tǒng)研究。為探究肺炎克雷伯菌對復方新諾明的耐藥性、臨床菌株內整合子分布及其與耐藥表型的相關性，筆者對812株臨床分離肺炎克雷伯菌進行分析，為臨床耐藥基因的水平傳播、耐藥菌株的控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2013年1月至2015年5月溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床分離的812株肺炎克雷伯菌，剔除了同一例患者相同部位分離的重復菌株。所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀鑒定。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853，購自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.2 儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀（法國生物梅里埃公司）；S－100TMThermal Cycler PCR儀（美國BIO－RAD公司）；Bio－Rad凝膠電泳成像分析儀（美國BIO－RAD公司）；Thermo FRESCO21型離心機（美國Thermo Fisher有限公司）；DR100型比濁儀（法國Biomerieux有限公司）；DYY－5穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR反應試劑盒（日本TaKaRa公司）；PCR引物（上海華大基因科技有限公司）；核酸染料Gelred（索萊寶科技有限公司）；瓊脂糖干粉（法國Biowest有限公司）。

1.3 菌株純化、鑒定與藥敏試驗 參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》對細菌進行分離純化。使用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀對細菌進行菌種鑒定。按照操作規(guī)程檢測肺炎克雷伯菌對臨床常用抗菌藥物的敏感性。藥敏結果參照2015年美國臨床和實驗室標準協(xié)會標準被判讀為敏感、中介和耐藥[6]，其中中介和耐藥合并稱為非敏感，其所占比率為非敏感率。

1.4 基因組提取 將細菌接種至哥倫比亞血平板，置35℃孵箱培養(yǎng)16～18h后，通過煮沸法粗提肺炎克雷伯菌基因組作為PCR反應模板，具體步驟如下：取新鮮培養(yǎng)的純菌于含200μl雙蒸水的EP管中充分研磨、混勻和溶解，100℃煮沸15min，并快速置于冰上10min，使其充分變性，12000r/min離心2min，吸取上清液（即菌株DNA基因組）于新的EP管中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 整合子擴增檢測 整合子的PCR擴增體系及引物合成參照先前報道[7]。整合子引物序列和目的產(chǎn)物長度見表1。反應條件：預變性94℃ 5min；變性94℃ 30s，退火 55℃ 30s，延伸 72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，Gelred染色后凝膠成像觀察結果，陽性產(chǎn)物送至上海華大基因科技公司進行測序。

表1 PCR引物序列及目的產(chǎn)物長度

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性分析 肺炎克雷伯菌臨床分離株對頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、亞胺培南、厄他培南耐藥率相對較低，對其他抗菌藥物3年耐藥率呈逐年遞增趨勢或趨于平穩(wěn)，但僅對復方新諾明的耐藥率呈逐年遞減趨勢。進一步對115株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌分析發(fā)現(xiàn)，耐亞胺培南（111株）和耐厄他培南（85株）肺炎克雷伯菌對復方新諾明耐藥率較低，總體耐藥率分別為13.5%、18.8%。詳見表2～3。

2.2 肺炎克雷伯菌整合子分布情況 812株肺炎克雷伯菌中，302株攜帶Ⅰ型整合子，陽性率為37.2%，本研究未檢測到Ⅱ、Ⅲ型整合子。按照藥敏試驗結果，將肺炎克雷伯菌臨床分離株分為復方新諾明耐藥組（175株）和復方新諾明敏感組（637株），復方新諾明耐藥組的整合子陽性率為63.4%（111/175），復方新諾明敏感組的整合子陽性率為30.0%（191/637），復方新諾明耐藥組的整合子陽性率明顯高于敏感組（P＜0.01）。由于樣本量較大，選取其中24株Ⅰ型整合子陽性菌株進行圖示，其PCR電泳結果如圖1。

表2 肺炎克雷伯菌對臨床常用抗生素的逐年耐藥率（%）

表3 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對復方新諾明敏感性分析

圖1 Ⅰ型整合子陽性菌株PCR電泳圖

2.3 整合子陽性/陰性菌株對臨床常用抗菌藥物耐藥性比較 整合子陽性菌株組對頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的非敏感率均明顯高于整合子陰性菌株組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 肺炎克雷伯菌整合子陽性/陰性菌株對其他抗生素敏感性分析

2.4 不同耐藥表型菌株的整合子分布情況 復方新諾明耐藥組中，多重耐藥菌株中有92株攜帶Ⅰ型整合子，陽性率為73.0%（92/126），廣泛耐藥菌株有20株攜帶Ⅰ型整合子，陽性率為100.0%（20/20）；復方新諾明敏感組中，多重耐藥菌株有93株攜帶Ⅰ型整合子，陽性率為53.1%（93/175），低于復方新諾明耐藥組的多重耐藥菌株，廣泛耐藥菌株有79株攜帶Ⅰ型整合子，陽性率為84.9%（79/93），同樣低于復方新諾明耐藥組的廣泛耐藥菌株，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。詳見表4。

3 討論

肺炎克雷伯菌是引起院內感染的常見條件致病菌之一。多重耐藥肺炎克雷伯菌檢出率不斷增高，導致住院患者出現(xiàn)較高的致死率[8]。隨著耐藥基因的水平傳播，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌分離率不斷增高，使臨床抗感染治療更加困難[9]。由于碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌數(shù)量逐年增加，因此臨床亟需尋找其他可替代的抗菌藥物。

表4 復方新諾明耐藥菌株和敏感菌株內IntⅠ整合子攜帶情況

復方新諾明抗菌譜廣，對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、志賀菌屬等均具有抗菌作用[10]。盡管肺炎克雷伯菌臨床分離株對復方新諾明總耐藥率達21.6%，但筆者分析發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌對復方新諾明的耐藥率呈逐年下降趨勢，這種現(xiàn)象可能與臨床用藥頻度的相對較低以及抗菌藥物的合理使用有關[11-12]。Xiao等[13]研究表明產(chǎn)碳青霉烯酶菌株對復方新諾明耐藥率高于碳青霉烯酶陰性菌株。而本研究，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對復方新諾明敏感性良好，亞胺培南和厄他培南耐藥菌株對復方新諾明總耐藥率分別僅為9.9%、10.2%，提示復方新諾明可作為耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染治療良好的藥物選擇，為臨床抗感染治療提供指導。

整合子是具有位點特異性重組功能的可移動基因元件，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子可導致耐藥基因在腸桿菌科細菌間的克隆傳播。這種播散可使菌株產(chǎn)生對多種抗菌藥物的耐藥性，進而導致多重耐藥菌株的暴發(fā)流行，因此又稱為耐藥整合子[14-15]。Frank等[16]研究表明，sul與dfrA可分別拮抗磺胺甲惡唑、甲氧芐啶的抗菌機制，且主要由Ⅰ型整合子介導，在不同菌株間進行播散，成為病原菌對復方新諾明的重要耐藥機制。本研究發(fā)現(xiàn)，復方新諾明耐藥組的Ⅰ型整合子檢出率明顯高于復方新諾明敏感組，且兩組中多重耐藥菌株和廣泛耐藥菌在的Ⅰ型整合子陽性率顯著高于非多重耐藥菌株。此外，整合子陽性菌株對頭孢類、氨基糖苷類、喹諾酮類等臨床常用抗菌藥物耐藥率均明顯高于整合子陰性菌株。以上結果均說明整合子不僅與復方新諾明耐藥性相關，整合子上耐藥基因盒的整合與播散也是菌株獲得對臨床常用抗菌藥物耐藥性的重要耐藥機制，這與Xu等[7]研究結果相契合。

本研究中，肺炎克雷伯菌僅對復方新諾明的耐藥率呈現(xiàn)逐年降低趨勢，且耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對復方新諾明敏感性良好。據(jù)分析，整合子與復方新諾明耐藥性、多重耐藥表型、廣泛耐藥表型的出現(xiàn)均密切相關?；趶头叫轮Z明可作為耐碳青霉烯菌株抗感染治療的另一藥物選擇，加強感染控制、合理用藥、及時監(jiān)測、有效隔離等措施對保持抗菌藥物良好的敏感性、限制整合子耐藥基因的水平傳播都至關重要。

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