鞏生輝何云凌趙名趙彤成祥吳奎武范明吳麗穎朱玲玲

高原低氧腦損傷是由低氧等多種高原環(huán)境因素對腦組織造成的一系列損傷綜合征。近年來多項(xiàng)研究從不同方面部分闡述了其致病機(jī)制，如低氧刺激所致的腦血流動(dòng)力學(xué)改變[1]、氧化應(yīng)激學(xué)說[2]以及炎性介質(zhì)的活化[3-4]等，但高原低氧所致腦損傷的具體病理生理機(jī)制還不十分清楚。因此，目前對高原低氧腦損傷治療仍缺乏特異性方法。

亞甲藍(lán)(methylene blue，MB)是一種人工合成的含有3個(gè)雜環(huán)的芳香族噻嗪類化合物，鑒于最初的活體內(nèi)注射研究發(fā)現(xiàn)它可以特異性染色神經(jīng)組織，隨后多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)對異環(huán)磷酰胺所致腦病[5]、阿爾茨海默病[6]以及缺血性腦損傷[7]等多種腦損傷具有腦組織保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能通過其自身的氧化-還原特性改善線粒體功能，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。本文作者前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MB可通過誘導(dǎo)線粒體自噬而對大鼠缺血性腦損傷具有腦組織保護(hù)作用[7]，但MB對高原缺氧引起的腦損傷是否具有腦組織保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究利用高原低氧模擬艙建立高原低氧腦損傷模型，評價(jià)高原低氧對腦組織的損傷情況以及MB對損傷腦組織的保護(hù)作用，并初步探索MB的腦組織保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥品、試劑以主要儀器：脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、自噬蛋白輕鏈3(autophagy marker light chain 3， LC3)抗體、β-actin抗體(Sigma公司，美國)，MB(Amresco公司，美國)，B淋巴細(xì)胞-2結(jié)合蛋白1(Bcl-2 binding protein 1， Beclin1)抗體(BD公司，美國)，電子密天平(上海天平儀器廠)，低壓低氧實(shí)驗(yàn)動(dòng)物艙(DYC-DWY，貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司，中國)，Morris 水迷宮動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)(北京鼎大軟件技術(shù)有限公司，中國)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康、雄性的SPF 級C57BL/6小鼠(體質(zhì)量22～24 g)75只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號SCXX(京)2012-0001。小鼠飼養(yǎng)于恒溫(22±2 ℃)、晝夜節(jié)律12/12 h的動(dòng)物室中，小鼠可自由取食水。

1.2方法

1.2.1腦組織含水量測定：(1)處理及分組：35只健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為常氧組、低氧組和低氧+亞甲藍(lán)組，其中低氧+亞甲藍(lán)組按體質(zhì)量設(shè)0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mg/kg[8]5個(gè)MB濃度組，共計(jì)7個(gè)組，每組5只。低氧組和低氧+亞甲藍(lán)組小鼠在低壓低氧前30 min按體質(zhì)量0.5 mg/kg[4]給予腹腔注射LPS；常氧組小鼠給予腹腔注射等體積生理鹽水作為對照；30 min后，低氧+亞甲藍(lán)組小鼠給予MB注射，隨后將低氧組和低氧+亞甲藍(lán)組小鼠置于低壓低氧實(shí)驗(yàn)動(dòng)物艙，以10 m/s的上升速度模擬海拔6000 m持續(xù)低壓低氧6 h。實(shí)驗(yàn)過程中未出現(xiàn)小鼠死亡。低壓低氧艙內(nèi)的溫度和濕度分別保持在20～24℃和40%～50%，小鼠可自由取食飲水。常氧組小鼠置于低氧艙外的正常環(huán)境中，可自由取食飲水。

(2)腦組織含水量測定：低壓低氧處理結(jié)束后，將經(jīng)常氧組及低氧組和低氧+亞甲藍(lán)各組小鼠給予1%(體積濃度)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，快速頸椎脫臼獲取腦組織，置于已稱重的小玻璃瓶中，計(jì)量腦組織濕重(精確到0.001 g)，然后在100℃電熱恒溫箱中烘烤24 h，計(jì)量腦組織干重。根據(jù)Elliot公式計(jì)算腦組織含水量，即腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%[9]。選取腦組織含水量降低最明顯的MB劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2腦組織病理學(xué)和自噬活性觀察：(1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：40只小鼠先進(jìn)行隱蔽平臺(tái)訓(xùn)練以獲得學(xué)習(xí)和記憶，訓(xùn)練結(jié)束后隨機(jī)分為常氧組、常氧+亞甲藍(lán)組、低氧組以及低氧+亞甲藍(lán)組4組，每組10只。低氧組和低氧+亞甲藍(lán)組小鼠給予腹腔注射0.5 mg/kg LPS，常氧組和常氧+亞甲藍(lán)組小鼠給予等體積生理鹽水；30 min后，常氧+亞甲藍(lán)組和低氧+亞甲藍(lán)組小鼠按體質(zhì)量給予腹腔注射0.5 mg/kg MB，常氧組和低氧組給予等體積生理鹽水，然后將低氧組和低氧+亞甲藍(lán)組小鼠置于低壓低氧實(shí)驗(yàn)動(dòng)物艙，以10 m/s的上升速度模擬海拔6000 m持續(xù)低壓低氧6 h。觀察低壓低氧對小鼠的學(xué)習(xí)記憶的損傷情況以及MB對低壓低氧引起的小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的保護(hù)作用。低壓低氧期間未出現(xiàn)小鼠死亡情況。低壓低氧處理結(jié)束后，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，從任一入水點(diǎn)將4組小鼠依次面向池壁放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)穿越靶標(biāo)的次數(shù)、潛伏期、小鼠在靶標(biāo)象限的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和距離以及小鼠的運(yùn)動(dòng)速度。

(2)腦組織病理學(xué)觀察：Morris水迷宮結(jié)束后，每組選3只小鼠取新鮮腦組織，以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛固定24 h后，酒精脫水、石蠟包埋，腦組織制成4 μm切片后于60℃恒溫烤干切片。然后經(jīng)二甲苯和酒精梯度脫水，充分沖洗，蘇木素-伊紅染色，然后鹽酸乙醇分化，流水沖洗。切片隨后經(jīng)酒精梯度85%-90%-95%-100%(體積分?jǐn)?shù))逐級脫水和二甲苯透明，最后封片。切片于光學(xué)顯微鏡下放大200倍觀察病理改變，并拍攝圖片。

(3)Western blot檢測腦組織自噬活性：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組選取3只小鼠分離新鮮皮質(zhì)，用RIPA裂解液(含2%蛋白酶抑制劑)裂解組織，4℃離心后取上清定量，制備蛋白上樣緩沖樣品。然后按電泳-電轉(zhuǎn)-封閉-一抗-二抗-顯影Western blot常規(guī)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。主要一抗稀釋比例：Beclin1 1∶1000，LC3 1∶5000，β-actin 1∶10000，二抗稀釋比例均為1∶5000。將Beclin1和LC3的表達(dá)X線片進(jìn)行掃描拍片，Image J軟件分析計(jì)算Beclin1/β-actin和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的灰度值，并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠腦含水量比較亞甲藍(lán)劑量篩選結(jié)果顯示：與常氧組〔(78.42±0.01)%〕相比，低氧組小鼠腦組織含水量明顯升高〔(78.62±0.01)%，P<0.01)〕；與低氧組相比，低氧+亞甲藍(lán)不同劑量組小鼠腦組織含水量〔亞甲藍(lán)0.1 mg/kg組(78.57±0.01)%， 0.2 mg/kg組(78.53±0.02)%， 0.5 mg/kg組(78.44±0.02)%， 1.0 mg/kg組(78.52±0.01)%，2.0 mg/kg組(78.54±0.02)%〕呈現(xiàn)不同程度的減輕(均P<0.01)。而低氧+亞甲藍(lán)各劑量組中，低氧+亞甲藍(lán)0.1 mg/kg組(P<0.01)、低氧+亞甲藍(lán)0.2 mg/kg組(P<0.01)、低氧+亞甲藍(lán)1.0 mg/kg組(P<0.05)以及低氧+亞甲藍(lán)2.0 mg/kg組(P<0.05)小鼠腦組織含水量均高于低氧+亞甲藍(lán)0.5 mg/kg組。因此，選取0.5 mg/kg MB用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2MB改善低壓低氧造成的小鼠空間記憶能力的減退在連續(xù)6天的隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，小鼠表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)效應(yīng)，隨著訓(xùn)練天數(shù)的延長，小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，即潛伏期明顯縮短(圖1)。

圖 1 隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期間小鼠潛伏期變化

在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與常氧組比較，常氧+亞甲藍(lán)組小鼠穿越靶標(biāo)的次數(shù)增加(表1，P<0.05)，潛伏期略有縮短但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在靶標(biāo)象限的運(yùn)動(dòng)時(shí)間、距離延長及運(yùn)動(dòng)速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與常氧組比較，低氧組小鼠的空間記憶能力以及運(yùn)動(dòng)能力明顯受損，表現(xiàn)為小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P<0.01)、運(yùn)動(dòng)距離明顯縮短(P<0.01)，運(yùn)動(dòng)速度明顯減慢(P<0.05)，小鼠潛伏期延長，在靶標(biāo)象限的運(yùn)動(dòng)時(shí)間有所減少，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與低氧組小鼠相比，低氧+亞甲藍(lán)組(0.5 mg/kg)小鼠潛伏期縮短但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，穿越靶標(biāo)的次數(shù)明顯增加(P<0.05)，在靶標(biāo)象限的運(yùn)動(dòng)距離延長(P<0.05)。具體結(jié)果見表1。

表1 4組小鼠Morris水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)檢測比較(n=10，±s)

注：與常氧組比較，*P<0.05，**P<0.01；與低氧組比較，#P<0.05

2.3各組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)的變化各組腦組織HE常規(guī)染色結(jié)果顯示(圖2)，常氧組小鼠皮質(zhì)和海馬DG區(qū)域組織結(jié)構(gòu)清晰完整、細(xì)胞層次清楚，形態(tài)正常，常氧+亞甲藍(lán)組(0.5 mg/kg)腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與常氧組相似，低氧組較常氧組小鼠腦組織除血管間隙增寬外，小鼠腦組織并沒出現(xiàn)明顯的腦組織結(jié)構(gòu)紊亂以及神經(jīng)細(xì)胞損傷，低氧+亞甲藍(lán)組(0.5 mg/kg)小鼠的腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與低氧組相比亦無明顯變化。

2.4各組腦組織自噬活性比較與常氧組比較，常氧+亞甲藍(lán)組小鼠腦Beclin1的表達(dá)和LC3自噬流升高，低氧組小鼠腦組織中Beclin1表達(dá)(P<0.01)和LC3自噬流(P<0.01)減低；與低氧組比較，低氧+亞甲藍(lán)組小鼠腦組織的Beclin1表達(dá)(P<0.01)和LC3自噬流(P<0.01)明顯升高。具體結(jié)果見表2、圖3。

表2 4組小鼠腦組織中Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)比較(n=3，±s)

注：與常氧組比較，*P<0.01；與低氧組比較，#P<0.01

3 討論

高原腦損傷是急性高原病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的表現(xiàn)，主要包括高原性頭痛、急性高山病以及高原腦水腫[10]。從臨床診斷角度來看，急性高山病是高原性頭痛病情進(jìn)展所致，而高原腦水腫則是急性高山病最嚴(yán)重的形式[11]。流行病學(xué)調(diào)查顯示在海拔4500 m高原腦水腫的發(fā)病率雖然僅為0.5%～1.0%[10]，但是高原性頭痛和急性高山病的發(fā)病率在此海拔高度可達(dá)100%[12]和70%[13]。遺憾的是，目前仍沒有針對高原腦損傷的特效藥。

圖 3 4組小鼠皮質(zhì)中Beclin1和LC3表達(dá)比較(Western blot)

高原低氧所致腦組織損傷的具體病理生理過程還不明確，目前有多項(xiàng)研究從不同方面闡述了其發(fā)病機(jī)制。Ross等認(rèn)為高原腦損傷的發(fā)生與神經(jīng)軸順應(yīng)性相關(guān)，即當(dāng)顱腔和椎管不能緩沖因高原低氧導(dǎo)致的腦組織體積增加時(shí)，便可出現(xiàn)腦組織腫脹，顱內(nèi)壓升高等現(xiàn)象，進(jìn)而引起高原腦損傷[10]。氧化應(yīng)激學(xué)說則認(rèn)為，低氧應(yīng)激使得細(xì)胞內(nèi)自由基生成增加，一方面其可直接激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)導(dǎo)致偏頭痛以及急性高山病[14]，另一方面自由基生成增加使得鈉鉀泵衰竭從而使體液重新分布，最終導(dǎo)致高原腦水腫[2，10，14]。此外，低氧暴露所致的自由基生成增加或可激活核因子κB(NF-κB)通路，致使炎性因子生成增加，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞造成腦水腫[2-3，15]。

MB是人工合成的芳香族化合物，芳香族屬性賦予的親脂性使其易于穿過血腦屏障，它自身具有的氧化-還原特性致使其進(jìn)入腦組織后可被線粒體捕獲進(jìn)入線粒體，從而參與氧化呼吸鏈電子的傳遞并減少自由基的生成。本實(shí)驗(yàn)前期工作表明，MB能顯著改善永久性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能障礙，其機(jī)制與MB促進(jìn)線粒體自噬、減少活性氧生成有關(guān)[7]。自噬在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，尤其當(dāng)缺血/缺氧等氧化應(yīng)激時(shí)自噬可通過清除受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)或過多產(chǎn)生的自由基使細(xì)胞度過危險(xiǎn)期[9]。

本研究采用低劑量LPS復(fù)合低壓低氧模擬6000 m海拔高度建立高原低氧腦損傷模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在LPS復(fù)合低壓低氧處理小鼠6 h后，低氧組小鼠腦組織含水量明顯升高，而與低氧組相比，而預(yù)先給予不同劑量MB腹腔注射后，低氧+亞甲藍(lán)各組小鼠腦組織含水量較低氧組小鼠腦組織含水量呈不同程度的降低，其中按體質(zhì)量0.5 mg/kg劑量 MB作用最顯著。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還顯示，低壓低氧可損傷小鼠的空間記憶能力，與常氧組小鼠相比，低氧組小鼠潛伏期延長、穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P<0.01)，運(yùn)動(dòng)路程明顯縮短(P<0.01)；而按體質(zhì)量0.5 mg/kg預(yù)先給予MB可明顯改善低壓低氧導(dǎo)致的小鼠空間記憶能力受損，表現(xiàn)為穿越靶標(biāo)的次數(shù)明顯增加(P<0.05)，在靶標(biāo)象限的運(yùn)動(dòng)距離明顯延長(P<0.05)。MB改善記憶的作用在腦缺血損傷、輕度認(rèn)知障礙的阿爾茨海默病等疾病模型中已被報(bào)道[16]，分析其作用機(jī)制可能是通過增強(qiáng)腦組織細(xì)胞色素氧化酶的活性，或者作為電子循環(huán)體參與電子呼吸鏈傳遞并減少自由基的生成，維持腦組織細(xì)胞的氧耗而減少了神經(jīng)元的死亡[17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MB具有增強(qiáng)自噬作用，無論是在常氧還是在低氧情況下，MB都有助于激活自噬的發(fā)生，小鼠腦組織自噬分子Beclin1的表達(dá)以及LC3Ⅱ/LCⅠ自噬流明顯增加。目前認(rèn)為自噬是一種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的質(zhì)量控制和代謝調(diào)控系統(tǒng)。Congdon等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MB可通過抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素(mTOR)的活性誘導(dǎo)細(xì)胞自噬進(jìn)而消除tau蛋白纏結(jié)所致的神經(jīng)變性，提示MB可通過誘導(dǎo)自噬的發(fā)生發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但是對于MB如何誘導(dǎo)自噬的發(fā)生仍需要進(jìn)一步的探索。

綜上，本研究中發(fā)現(xiàn)，低壓低氧可抑制腦組織的自噬活性，而MB卻可以解除這種抑制作用，推測MB可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬這一細(xì)胞保護(hù)機(jī)制維持神經(jīng)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但MB是如何誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的還有待于進(jìn)一步探索。

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