儲 新， 李 彤， 楊永曜

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科, 2貴州省人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡科， 3貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科， 貴州 貴陽 550000)

近年來，易損血管(vulnerable vessel)，即 “易于出現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)浸潤和血管壁炎癥，動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展迅速，進(jìn)而導(dǎo)致心肌缺血癥狀或發(fā)展成為易損斑塊的血管”的概念提出后，易損血管中斑塊不穩(wěn)定及不良血管功能導(dǎo)致的心、腦血管事件，如心肌梗塞和腦卒中等已成為全球的主要死因[1-2]，日益受到重視。因此，尋找新的治療靶點，改善易損血管中易損斑塊的成份及血管舒縮功能，使其向穩(wěn)定性斑塊方向逆轉(zhuǎn)，成為防治急性心血管事件的重要內(nèi)容。FIZZ1屬于抵抗素(resistin)樣分子家族成員，因此又命名為抵抗素樣分子α(resistin-like molecule α，RELMα)，在選擇性激活的巨噬細(xì)胞、缺氧的肺血管壁和炎癥的肉芽組織中均有表達(dá)，具有促增殖、血管收縮、血管新生和類趨化因子的作用。Chen等[3]研究提示FIZZ1通過激活Raf-ERK1/2-p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路收縮氣道平滑肌，而RELMα/FIZZ1 與動脈粥樣硬化血管新生的關(guān)系及其機制報道甚少，因此，本文探討RELMα/FIZZ1對易損的小鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞MOVAS及小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(mouse aortic endothelial cell,MAEC)的血管生成的影響及其相關(guān)機制。

材 料 和 方 法

1 材料

MAEC和MOVAS細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；聚凝胺(polybrene)購自上海吉凱制藥技術(shù)有限公司；兔抗鼠FIZZ1(RELMα)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)和肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自博士德公司；pGSadeno-HK、pGSadeno-RELMα/FIZZ1、pGSadeno-shRNA control和pGSadeno-shRNA RELMα/FIZZ1腺病毒表達(dá)載體均由美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Angelini教授惠贈；Ca2+檢測試劑盒購自凱基公司；Matirgel購自Corning；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR 試劑盒購自TaKaRa；FIZZ1(RELMα)、CaM和MLCK引物均由上海吉凱制藥技術(shù)有限公司合成。

2 方法

2.1腺病毒感染細(xì)胞 通過免疫熒光法對2種細(xì)胞進(jìn)行鑒定，其中MAEC以vWF抗體免疫熒光進(jìn)行鑒定，MOVAS細(xì)胞以α-SMA免疫熒光進(jìn)行鑒定。2株細(xì)胞均培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化收集細(xì)胞，按照每孔4×105個接種于6孔培養(yǎng)板，生長至80%左右時，將腺病毒液加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，并加入5 mg/L的polybrene進(jìn)行病毒感染；同時取未感染細(xì)胞作為對照(control)組，混勻、過夜感染后換成正常的完全培養(yǎng)基。感染72 h后觀察熒光，判斷感染效率，并檢測 FIZZ1/RELMα蛋白的表達(dá)。

2.2MTT實驗和活細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)胞的增殖能力 腺病毒分別感染MAEC 和MOVAS細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后將各組細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種3×103個細(xì)胞， 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)0、24、48和72 h，設(shè)3個復(fù)孔，收集各個時點細(xì)胞，每孔加入 20 μL 5 g/L MTT檢測試劑，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，檢測波長490 nm處各孔的吸光度(A)，同時通過人工計數(shù)的方法檢測各時點活細(xì)胞數(shù)，以103為數(shù)量級計數(shù)。

2.3MAEC基質(zhì)膠管腔形成的觀察 96孔板中每孔加人50 μL Matrigel，輕輕搖晃培養(yǎng)板使其鋪平于孔內(nèi)，37 ℃放置2 h，使Matrigel凝固。MAEC感染腺病毒，培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，每孔加入1×104個細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的管腔形成情況。在特定的時點采集圖片，并且進(jìn)行圖像分析(Wimasis全自動分析軟件)，統(tǒng)計成環(huán)數(shù)、細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點。

2.4MOVAS細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的檢測 腺病毒感染MOVAS細(xì)胞72 h后，用胰酶將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，加入離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；用1×PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清；用1 mL 1×PBS重懸細(xì)胞；加入5 μmol/L Fluo-3 AM-DMSO，混勻，置入37 ℃水浴箱中避光孵育30 min；1 000 r/min離心5 min，棄上清，1×PBS洗滌2次， 1 mL 1×PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

2.5Western blot檢測MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCK蛋白的表達(dá) 腺病毒感染MOVAS細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，消化收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，蛋白經(jīng)溴酚藍(lán)處理后進(jìn)行SDS-PAGE，上樣量為20 μg，濃縮膠60 V電泳60 min，分離膠120 V電泳70 min，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜100 V 60 min，5% BSA封閉60 min用相應(yīng)的I抗(根據(jù)說明書稀釋)4 ℃孵育過夜，后加入II抗(羊抗兔IgG, 1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光，X線底片顯影。

2.6Real-time PCR檢測MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCK的mRNA表達(dá) 腺病毒感染培養(yǎng)72 h后，棄去原培養(yǎng)基，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞；TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，以提取的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為70 ℃保溫10 min后迅速在冰上冷卻2 min、42 ℃ 60 min、72℃ 15 min。按照Real-Time PCR試劑盒(RR420A)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增 40 個循環(huán)周期，每個標(biāo)本3個復(fù)孔。檢測CaM和MLCK的mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腺病毒感染細(xì)胞的鑒定結(jié)果

MAEC 和MOVAS 細(xì)胞感染腺病毒，其感染效率較高，Western blot檢測顯示過表達(dá)RELMα/FIZZ1組中RELMα/FIZZ1蛋白表達(dá)顯著升高，而干擾組中RELMα/FIZZ1蛋白表達(dá)顯著減低(P<0.05)，見圖1。

2 MTT法檢測RELMα/FIZZ1對MAEC和MOVAS細(xì)胞增殖能力的影響

細(xì)胞活力檢測結(jié)果表明，以MAEC為研究對象，過表達(dá)RELMα/FIZZ1可顯著提高細(xì)胞活力，而干擾RELMα/FIZZ1的表達(dá)則顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)；以MOVAS細(xì)胞為研究對象，過表達(dá)RELMα/FIZZ1可顯著提高細(xì)胞活力，而干擾RELMα/FIZZ1的表達(dá)則顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)；顯示過表達(dá)RELMα/FIZZ1可促進(jìn)MAEC和MOVAS的生長，干擾 RELMα/FIZZ1抑制MAEC和MOVAS的生長，見表2?；罴?xì)胞計數(shù)結(jié)果與MTT法檢測結(jié)果趨勢相同，隨實驗進(jìn)行，與過照組比較， RELMα/FIZZ1過表達(dá)組活細(xì)胞數(shù)量顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而干擾RELMα/FIZZ1則活細(xì)胞數(shù)量升高受抑制(P<0.05)，顯示過表達(dá)RELMα/FIZZ1可促進(jìn)MAEC和MOVAS細(xì)胞的增殖，干擾 RELMα/FIZZ1抑制MAEC和MOVAS細(xì)胞的生長，見表3。

3 MAEC管腔形成的觀察

管腔形成實驗結(jié)果示，與對照組比較，過表達(dá)RELMα/FIZZ1使MAEC管腔形成數(shù)目顯著增加，而干擾RELMα/FIZZ1的表達(dá)，MAEC管腔形成數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖2。

4 MOVAS細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化

各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+平均熒光強度結(jié)果顯示，與對照組比較，RELMα/FIZZ1過表達(dá)可顯著提高M(jìn)OVAS細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，而干擾RELMα/FIZZ1則細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著降低(P<0.05)，見圖3。

5 RELMα/FIZZ1對MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCK蛋白表達(dá)的影響

過表達(dá)RELMα/FIZZ1上調(diào)MOVAS的CaM與MLCK表達(dá)(P<0.05)；干擾RELMα/FIZZ1抑制MOVAS的CaM與MLCK表達(dá)(P<0.05)，見圖4。

6 RELMα/FIZZ1對MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCK mRNA表達(dá)的影響

過表達(dá)RELMα/FIZZ1上調(diào)MOVAS胞內(nèi)CaM與MLCK的mRNA表達(dá)(P<0.05)；干擾RELMα/FIZZ1抑制MOVAS胞內(nèi)CaM與MLCK的mRNA表達(dá)(P<0.05)，見圖5。

Figure 1. The cell infection rate and the results of Western blot detection in the cells infected with adenovirus for 72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspGSadeno-HK group；#P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

圖1腺病毒感染72h細(xì)胞感染率與Westernblot檢測結(jié)果的比較

表2MTT法檢測感染腺病毒后MAEC和MOVAS細(xì)胞活力的變化

Table 2. MTT assay was used to detect the viability of the MAEC and MOVAS cells infected with adenovirus (A490value. Mean±SD.n=3)

CellsGroup0h24h48h72hMAECpGSadeno?HK0．348±0．0030．417±0．0041．040±0．0151．347±0．023pGSadeno?RELMα/FIZZ10．354±0．0060．538±0．006?1．286±0．016?1．743±0．011?pGSadeno?shRNAcontrol0．349±0．0020．428±0．0051．084±0．0391．348±0．017pGSadeno?shRELMα/FIZZ10．341±0．0020．396±0．0060．818±0．005#0．99±0．011#MOVASpGSadeno?HK0．359±0．0020．437±0．0050．942±0．0101．278±0．023pGSadeno?RELMα/FIZZ10．355±0．0030．502±0．005?1．187±0．013?1．538±0．008?pGSadeno?shRNAcontrol0．367±0．0050．448±0．0040．979±0．0071．298±0．009pGSadeno?shRELMα/FIZZ10．352±0．0030．405±0．006#0．796±0．005#0．907±0．004#

*P<0.05vspGSadeno-HK group；#P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

表3活細(xì)胞計數(shù)法檢測感染腺病毒的MAEC和MOVAS細(xì)胞增殖能力的變化

Table 3. The viable cell number counting was udes to detect the proliferation ability the MAEC and MOVAS cells infected with adenovirus (×103viable cell numbers. Mean±SD.n=3)

CellsGroup0d1d2d3d4dMAECpGSadeno?HK3．480±0．0304．173±0．0407．787±0．0914．109±5．3015．319±6．860pGSadeno?RELMα/FIZZ13．574±0．0645．377±0．055?9．063±0．047?12．857±0．160?17．433±0．106?pGSadeno?shRNAcontrol3．493±0．0214．277±0．0457．687±0．03510．840±0．38713．477±0．170pGSadeno?shRNARELMα/FIZZ13．413±0．0214．057±0．0576．560±0．050#8．177±0．051#9．897±0．110#MOVASpGSadeno?HK3．587±0．0214．737±0．0477．493±0．0359．417±0．10112．783±0．230pGSadeno?RELMα/FIZZ13．553±0．0295．020±0．046?8．630±0．069?11．870±0．131?15．383±0．078?pGSadeno?shRNAcontrol3．667±0．0514．477±0．0427．653±0．0519．787±0．07412．977±0．095pGSadeno?shRELMα/FIZZ13．517±0．0314．050±0．061#6．663±0．090#9．575±0．046#9．070±0．040#

*P<0.05vspGSadeno-HK group；#P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

Figure 2. The angiogenesis of the MAEC (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vspGSadebo-HK group#P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

圖2MAEC的血管生成情況

Figure 3. The changes of Ca2+concentration in the MOVAS cells. Mean±SD.n=3.▲P<0.05vspGSadeno-HK group;△P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

圖3MOVAS細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化

Figure 4. The effects of RELMα/FIZZ1 on the protein expression of CaM and MLCK in the MOVAS cells. Mean±SD.n=3.▲P<0.05vspGSadeno-HK group;△P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

圖4RELMα/FIZZ1對MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCK蛋白表達(dá)的影響

Figure 5. The effects of RELMα/FIZZ1 on the mRNA expression of CaM and MLCK in the MOVAS cells. Mean±SD.n=3.▲P<0.05vspGSadeno-HK group;△P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

圖5RELMα/FIZZ1對MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCKmRNA表達(dá)的影響

討 論

易損斑塊(vulnerable plaque)是動脈粥樣硬化斑塊(atheromatous plaque)的重要類型，是動脈血管壁上的病理性結(jié)構(gòu)。斑塊改變了血管壁的組織結(jié)構(gòu)，使得血管管腔狹窄，血流阻力增加；血流動力學(xué)也發(fā)生改變，流體剪切力加強，血管內(nèi)皮(endothelium)損傷加重；同時，斑塊內(nèi)包含了大量脂質(zhì)和血細(xì)胞。當(dāng)斑塊收到較強流體剪切力的作用或血管收縮痙攣時，脆弱的被膜破裂，使得斑塊內(nèi)容物沖刷進(jìn)入血管，形成血栓，是導(dǎo)致突發(fā)心腦血管事件(如心肌梗塞和腦卒中等)的關(guān)鍵因素[4]。易損斑塊具有特別的病理性結(jié)構(gòu)，斑塊的管腔面是薄纖維帽(thin fibrous cap)，中間是由脂質(zhì)組成的壞死核心區(qū)(necro-tic core)，周邊浸潤了大量的以巨噬細(xì)胞(macro-phage)和T細(xì)胞為主的血細(xì)胞，伴隨著逐漸增強的斑塊炎癥反應(yīng)(plaque inflammation)、正性血管重構(gòu)(positive vascularremodeling)、滋養(yǎng)血管新生(vasa-vasorum neovascularization)和斑塊內(nèi)出血(intra-plaque hemorrhage)[5]。

最近研究表明，新生血管是血脂沉積斑塊局部的重要通道之一，生長入斑塊內(nèi)具有高通透性的新生血管為斑塊中脂蛋白的主要來源，致使大的纖維帽覆蓋下斑塊中的脂質(zhì)聚集仍在進(jìn)行，斑塊內(nèi)新生血管管壁發(fā)育不完善，容易破碎，它的臨床重要性在于與斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂和不穩(wěn)定型心絞痛高度相關(guān)[6]，在易損斑塊滋養(yǎng)血管的新生方面，局部浸潤的巨噬細(xì)胞扮演了重要的角色，一方面，巨噬細(xì)胞浸潤和激活，另一方面，巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子啟動相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生[7]。

FIZZ1是2000年新發(fā)現(xiàn)的一個與炎癥相關(guān)的缺氧誘導(dǎo)有絲分裂因子，是運用表達(dá)序列標(biāo)記數(shù)據(jù)庫掃描的方法發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白。目前發(fā)現(xiàn)，缺氧、高血糖和吸煙等能刺激巨噬細(xì)胞中RELMα/FIZZ1表達(dá)，而脂多糖能下調(diào)脂肪組織中RELMα/FIZZ1表達(dá)[8-9]。研究表明，RELMα/FIZZ1能刺激肺血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，明顯促進(jìn)肺組織血管新生。Sun等[10]在檢測哮喘患者肺組織內(nèi)的新生血管時發(fā)現(xiàn)，RELMα/FIZZ1在肺血管以及巨噬細(xì)胞內(nèi)明顯表達(dá)，其表達(dá)強度與血管新生面積明顯正相關(guān)；RELMα/FIZZ1在培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及鼠哮喘模型體內(nèi)也有類似的發(fā)現(xiàn)[11]。

目前國內(nèi)外關(guān)于RELMα/FIZZ1蛋白在呼吸系統(tǒng)疾病中的研究較多，主要集中在缺氧性肺血管重構(gòu)、肺纖維化、過敏性肺病及肺發(fā)育和肺動脈高壓等過程中的作用。而在心血管疾病方面僅為初步研究，RELMα/FIZZ1與動脈粥樣硬化進(jìn)展中血管新生、血管功能與斑塊易損性關(guān)系的報道甚少。本課題組首先在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)證實了RELMα/FIZZ1的表達(dá)[12]，利用RELMα/FIZZ1 刺激大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)處理組細(xì)胞的體外血管新生數(shù)目均明顯高于正常對照組，且呈劑量依賴性，明確了RELMα/FIZZ1在動脈粥樣硬化進(jìn)程中血管生成開關(guān)基因的地位[12-13]。

本研究結(jié)果提示，過表達(dá)RELMα/FIZZ1可顯著提高M(jìn)AEC的增殖能力，管腔的形成數(shù)目顯著增加；干擾RELMα/FIZZ1的表達(dá)抑制MAEC的活力和管腔的形成，通過調(diào)節(jié)斑塊內(nèi)RELMα/FIZZ1表達(dá)，影響動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生，進(jìn)而影響動脈粥樣硬化易損斑塊的進(jìn)展。過表達(dá)RELMα/FIZZ1顯著增高M(jìn)OVAS細(xì)胞的活力和細(xì)胞內(nèi)Ca2+平均熒光強度增強，細(xì)胞內(nèi)CaM和MLCK蛋白和mRNA表達(dá)顯著升高；干擾RELMα/FIZZ1的表達(dá)顯著抑制MOVAS細(xì)胞的活力，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+平均熒光強度，抑制CaM和MLCK 的mRNA和蛋白表達(dá)。RELMα/FIZZ1刺激血管平滑肌細(xì)胞后，可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，活化CaM，與鈣離子結(jié)合后，可能會引起某些通路激活，進(jìn)而對動脈粥樣硬化易損斑塊的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

綜上所述RELMα/FIZZ1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可影響動脈粥樣硬化中管腔生成的動態(tài)平衡及管腔功能，從而影響斑塊易損性，對臨床動脈粥樣硬化易損斑塊防治機制的探索和尋找新的治療靶點均具有十分重要的意義。

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