桂福強(qiáng)， 羅 鴻， 劉 洪， 朱 樺， 張 矛， 趙 渝

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科， 重慶 400016)

下肢靜脈性潰瘍(venous leg ulcer，VLU)是慢性靜脈功能不全(chronic venous insufficiency, CVI)最嚴(yán)重的臨床分級(jí)，全球成人發(fā)病率約為1%。VLU一旦形成，便經(jīng)久不愈，不僅會(huì)嚴(yán)重影響患者工作和生活，而且還會(huì)給家庭帶來不小的醫(yī)療開銷[1]。CVI是下肢靜脈高壓導(dǎo)致的一系列綜合結(jié)果，包括靜脈瓣膜功能不全、深淺靜脈瓣膜功能障礙、靜脈返流或者阻塞[2]。早期CVI若不予以干預(yù)最終會(huì)導(dǎo)致皮膚微循環(huán)功能障礙，主要表現(xiàn)為炎癥因子浸潤(rùn)、真皮微血管纖維蛋白沉積和局部低氧，最終發(fā)展為VLU。目前有研究發(fā)現(xiàn)VLU周圍經(jīng)皮氧分壓可低至1.7～7.0 mmHg[3]，嚴(yán)重缺氧首先作用于皮膚微循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其凋亡和增殖之間的平衡發(fā)生紊亂，繼而出現(xiàn)皮膚潰瘍。

舒洛地特(sulodexide，SDX)是一種天然的糖胺聚糖，具有抗凝、抗炎和改善內(nèi)皮細(xì)胞功能等作用，現(xiàn)以已被廣泛應(yīng)用于治療包括靜脈血栓、靜脈曲張和靜脈性潰瘍等多種靜脈性疾病，且有系統(tǒng)評(píng)價(jià)稱SDX能有效提高VLU愈合率[4]。目前許多臨床研究表明SDX可以明顯降低靜脈性潰瘍周圍血管通透性、減少炎性因子分泌并加快靜脈性潰瘍的愈合，且在一些關(guān)于糖尿病腎病的研究中也報(bào)道了SDX對(duì)腎臟的保護(hù)作用[5]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。依據(jù)下肢靜脈性潰瘍的病理生理特點(diǎn)和舒洛地特對(duì)靜脈性潰瘍明確的治療效果，我們提出猜想：舒洛地特可有效降低低氧狀態(tài)下人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human dermal microvascular endothelial cells，HDMECs)的凋亡率。本研究通過不同濃度的SDX作用于低氧狀態(tài)下人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞，探討SDX對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響及分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要材料與設(shè)備

人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞株購(gòu)買于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；SDX由意大利阿爾法韋士曼(北京)制藥公司上海分公司提供；兔抗人Bax、Bcl-2、caspase-3和P53多克隆抗體購(gòu)于萬類生物有限公司；相應(yīng)引物購(gòu)于GeneCopoeia；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒及Western blot常規(guī)試劑均購(gòu)于碧云天生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)于東仁化學(xué)科技有限公司；caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于萬類生物有限公司；胎牛血清購(gòu)于PAN-Biotech GmbH；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)于Corning；TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green均購(gòu)于寶生物工程有限公司；三氣孵箱購(gòu)于Thermo。

2 方法

2.1細(xì)胞的培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 HDMECs用含10%胎中血清和1%青、鏈霉素混合液的 RPMI-1640培養(yǎng)液，置于21% O2、5% CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，用不含血清的培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)24 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組培養(yǎng)：(1)常氧對(duì)照(normoxia control，NC)組即用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于常氧孵箱；(2)低氧對(duì)照(hypoxia control，HC)組即將細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基后培養(yǎng)于1% O2、5% CO2、94% N2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)24 h；(3)不同濃度(0.25、0.5、1 LSU/mL)SDX組即細(xì)胞更換含不同濃度(0.25、0.5、1 LSU/mL)SDX的新鮮完全培養(yǎng)基后移至1% O2、5% CO2、94% N2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)24 h。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將HDMECs以每孔5×103接種至96孔板中，每個(gè)孔板中添加完全培養(yǎng)基，置于21% O2、5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中至細(xì)胞融合，然后換液加含不同濃度(0、0.25、0.5、1 LSU/mL)SDX的完全培養(yǎng)基各加100 μL，分別在5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)孵箱與1% O2、5% CO2、94% N2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)24 h后，每孔添加10 μL CCK-8試劑(每孔)反應(yīng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，根據(jù)不同處理濃度A值與對(duì)照組A值的比例計(jì)算HDMECs的細(xì)胞活力。

2.3Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡根據(jù)試劑盒說明書操作，主要過程將細(xì)胞按以上分組方式培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，500 μL反應(yīng)緩沖液垂懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混合后于室溫避光靜置10 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 530 nm,計(jì)算各時(shí)相細(xì)胞百分比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性測(cè)定 按以上分組方式培養(yǎng)細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞并用PBS洗滌1次，用裂解液冰浴裂解15 min，4 ℃條件下12 000×g離心15 min，采用Bradford法檢測(cè)上清液中蛋白濃度。在96孔板中將10 μL蛋白上清液、80 μL反應(yīng)緩沖液和10 μL caspase-3底物混合并在37 ℃條件下孵育2 h。利用多功能酶標(biāo)儀于405 nm處讀取A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并以各組吸光度與常氧對(duì)照組吸光度相比計(jì)算相對(duì)的caspase-3活性。

2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 按以上分組方式培養(yǎng)細(xì)胞后收集各組細(xì)胞用RIPA裂解液裂解后靜置30 min，然后4 ℃、12 000×g離心15 min取上清液即為總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度并配平。SDS-PAGE約2 h，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶-TBST室溫封閉1.5 h，加入 I 抗4 ℃過夜。經(jīng) II 抗室溫孵育1.5 h和洗膜后將膜置于顯影儀使用ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。以目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH條帶光吸光度之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6Real-time PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 按以上分組方式培養(yǎng)細(xì)胞后收集各組細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA，測(cè)RNA濃度，取1 μL RNA按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，測(cè)DNA濃度。進(jìn)而通過特異性引物(表1)對(duì)HDMECs中的P53、Bax、Bcl-2和內(nèi)參照GAPDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增。10 μL PCR反應(yīng)體系包括：1 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物、5 μL SYBR Green、3 μL DEPC水和1 μL上、下游混合引物。在CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，共40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后繪制熔解曲線。每次擴(kuò)增均設(shè)置GAPDH內(nèi)參照，用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。

表1 引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用Studentt檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(在此基礎(chǔ)上的組間兩兩比較采用SNK-q法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SDX對(duì)常氧及低氧狀態(tài)下的HDMECs存活率的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常氧狀態(tài)下，各組HDMECs存活率沒有明顯差異；與常氧不加藥組細(xì)胞對(duì)比，低氧不加藥組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)；低氧狀態(tài)下，與低氧對(duì)照組比較，SDX處理組HDMECs的存活率存在明顯差異，且隨濃度增加存活率增加(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The effect of SDX on the viability of HDMECs under normoxic and hypoxic condition. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHC group；△P<0.05vs0.25 LSU/mL SDX group；▲P<0.05vs0.5 LSU/mL SDX group.

圖1常氧及低氧狀態(tài)下SDX對(duì)HDMECs活力的影響

2 SDX對(duì)低氧狀態(tài)下HDMECs凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組相比，低氧對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05)。與低氧對(duì)照組相比，SDX處理組細(xì)胞凋亡率顯著降低，并隨著濃度增高細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effect of SDX on the apoptotic rate of HDMECs under hypoxic condition. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHC group；△P<0.05vs0.25 LSU/mL SDX group；▲P<0.05vs0.5 LSU/mL SDX group.

圖2SDX對(duì)低氧狀態(tài)下HDMECs凋亡率的影響

3 SDX對(duì)低氧狀態(tài)下HDMECs內(nèi)caspase-3活性的影響

Caspase-3活性試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組比較，低氧對(duì)照組caspase-3活性顯著升高(P<0.05)；與低氧對(duì)照組相比，SDX各處理組caspase-3活性明顯降低，且隨濃度增加caspase-3活性呈降低趨勢(shì)(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The effects of SDX on the activity of caspase-3 in the HDMECs under hypoxic condition. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHC group；△P<0.05vs0.25 LSU/mL SDX group；▲P<0.05vs0.5 LSU/mL SDX group.

圖3SDX對(duì)低氧狀態(tài)下HDMECs內(nèi)caspase-3活性的影響

4 SDX對(duì)低氧狀態(tài)下HDMECs凋亡相關(guān)分子mRNA的表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組相比， 低氧對(duì)照組促凋亡因子P53、Bax和caspase-3表達(dá)均有明顯上升(P<0.05)，抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)明顯下降(P<0.05)；與低氧對(duì)照組相比，SDX處理組促凋亡因子P53、Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)均有顯著下降，而凋亡抑制因子Bcl-2有明顯上升(P<0.05)，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性，見圖4。

Figure 4. The effects of SDX on the mRNA expression of apoptosis-related factors in the HDMECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHC group；△P<0.05vs0.25 LSU/mL SDX group；▲P<0.05vs0.5 LSU/mL SDX group.

圖4SDX對(duì)HDMECs凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

5 SDX對(duì)低氧狀態(tài)HDMECs凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響

與real-time PCR的結(jié)果相似，Western blot結(jié)果顯示，低氧對(duì)照組較常氧對(duì)照組比較，P53、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2明顯下調(diào)(P<0.05)；與低氧對(duì)照組相比，各SDX處理組P53、 Bax和caspase-3蛋白表達(dá)均有顯著下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2有明顯上調(diào)(P<0.05)，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性，見圖5。

Figure 5. The effects of SDX on the expression of apoptotsis-related proteins in the HDMECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHC group；△P<0.05vs0.25 LSU/mL SDX group；▲P<0.05vs0.5 LSU/mL SDX group.

圖5SDX對(duì)各組HDMECs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

討 論

長(zhǎng)期靜脈血液回流不暢導(dǎo)致血流淤滯和靜脈高壓，進(jìn)而出現(xiàn)皮膚血管微循環(huán)白細(xì)胞介導(dǎo)炎性反應(yīng)、血小板黏附、毛細(xì)血管周圍纖維囊形成、大分子物質(zhì)堆積于局部組織等，導(dǎo)致組織缺氧和血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡，最終形成潰瘍[6-7]。許多靜脈性潰瘍的臨床研究已證實(shí)，靜脈性潰瘍患者其潰瘍周圍都存在不同程度的缺氧[8-9]，且在老年性靜脈性潰瘍患者中潰瘍周圍組織經(jīng)皮氧分壓低至1.7～7.0 mmHg[3]，如此程度的缺氧與許多由動(dòng)脈缺血性低氧(包括動(dòng)脈粥樣硬化性下肢缺血和糖尿病病足下肢缺血)程度相似。目前對(duì)動(dòng)脈缺血性低氧損害血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外機(jī)制研究較多，而靜脈性潰瘍的體外低氧細(xì)胞損害的研究卻很少，以致缺少統(tǒng)一的體外細(xì)胞模型。體外細(xì)胞低氧培養(yǎng)模型有使用CoCl2處理細(xì)胞的化學(xué)低氧模型和通過三氣培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)細(xì)胞的物理低氧模型。這兩種低氧模型各有利弊，但不少學(xué)者因?yàn)閾?dān)心CoCl2可能會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)其它某些蛋白會(huì)產(chǎn)生影響而采用物理模型。雖然目前尚沒有成熟的靜脈性潰瘍體外細(xì)胞低氧培養(yǎng)模型，但已有缺血再灌注的缺氧/復(fù)氧模型、動(dòng)脈缺血的低氧-無糖模型以及糖尿病病足的低氧-高糖模型做參考，依據(jù)靜脈性潰瘍?nèi)毖醭潭认嗨频膭?dòng)脈缺血性低氧的體外低氧模型而采用1% O2濃度培養(yǎng)細(xì)胞24 h較多[10-11]，所以本研究在低氧程度上參考動(dòng)脈體外研究模型采用1% O2氧濃度培養(yǎng)HDMECs 24 h以模擬靜脈性潰瘍局部嚴(yán)重缺氧情況。通過體外培養(yǎng)細(xì)胞并使用SDX干預(yù)后探索其治療靜脈性潰瘍的潛在機(jī)制。

大量研究表明低氧可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一系列的細(xì)胞間相互級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括：細(xì)胞有氧代謝障礙、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、炎癥因子釋放和細(xì)胞凋亡等，而在靜脈性潰瘍中嚴(yán)重低氧長(zhǎng)時(shí)間作用微血管內(nèi)皮細(xì)胞的最終結(jié)局是細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡，由多種分子間的相互作用控制，負(fù)責(zé)清除體內(nèi)不需要的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡通過外部的細(xì)胞死亡信號(hào)觸發(fā)。不同的蛋白家族如caspase家族、Bcl-2家族、TNF受體家族和P53都直接或間接參與細(xì)胞的凋亡[12]。p53是第一個(gè)被證實(shí)的腫瘤抑制基因，在各種應(yīng)激情況下(包括低氧、癌基因激活、DNA損傷和核苷酸缺失等)調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞衰老的過程[13-14]。在低氧條件的刺激下，促凋亡因子P53表達(dá)增加，并介導(dǎo)下游多種細(xì)胞凋亡相關(guān)因子包括Bcl-2家族、IGF-BP3、P53誘導(dǎo)基因(PIGs)等的表達(dá)。本研究中發(fā)現(xiàn)，與常氧狀態(tài)比較，低氧狀態(tài)下HDMECs的P53表達(dá)明顯升高。在低氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的過程中，線粒體性細(xì)胞凋亡扮演著重要的角色，P53通過對(duì)Bcl-2家族的介導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控線粒體性細(xì)胞凋亡。通常認(rèn)為Bcl-2家族成員中促凋亡蛋白Bax與抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)比例以及二者形成的二聚體決定細(xì)胞的存活和凋亡[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與常氧對(duì)照，低氧狀態(tài)下HDMECs中Bax/Bcl-2比例增高，且流式結(jié)果顯示凋亡率明顯增加。在普遍細(xì)胞凋亡過程中， caspase是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的主要酶類，負(fù)責(zé)選擇性的切割某些蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中caspase-3是核心蛋白酶，裂解蛋白質(zhì)后通過正反饋調(diào)節(jié)，產(chǎn)生caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。在本研究結(jié)果中可看出低氧情況下HDMECs表達(dá)caspase-3明顯增高，且活性也明顯增高。

舒洛地特是屬于糖胺聚糖類物質(zhì)，具有很高的血管壁趨向性，在多項(xiàng)臨床研究中表明它具有抗凝、抗炎和改善內(nèi)皮細(xì)胞功能等作用[17-20]。低氧狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞間糖胺聚糖含量減少時(shí)，它提供有效的糖胺聚糖以維持內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，改善糖胺聚糖代謝平衡，提高血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，有助于細(xì)胞膜抵抗外界炎癥因子以及氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，從而降低細(xì)胞的凋亡[21]。本研究的CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，常氧下SDX對(duì)HDMECs無毒性作用，低氧下隨SDX濃度增高HDMECs存活率明顯增加。同時(shí)在分子和基因?qū)用?，SDX能有效降低低氧狀態(tài)下HDMEsC的凋亡率、降低促凋亡因子P53、Bax和caspase-3蛋白和mRNA表達(dá)，提高抗凋亡因子Bcl-2的蛋白和mRNA表達(dá)。在2項(xiàng)動(dòng)脈性缺血的基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，SDX在濃度為0.125～0.5 LSU/mL和0.5 LSU/mL時(shí)，可以減少低氧下血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性因子釋放，有抗細(xì)胞衰老和抗細(xì)胞凋亡的作用[22-23]。可見SDX對(duì)低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞存在顯著的抗凋亡作用并呈現(xiàn)濃度依賴性，且其抗凋亡機(jī)制可能與線粒體凋亡通路(P53-Bax/Bcl-2-caspase-3)相關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)了低氧導(dǎo)致的HDMECs凋亡與凋亡通路P53-Bax/Bcl-2-caspase-3相關(guān)，并首次提出舒洛地特對(duì)其有抑制作用，且抑制效果呈濃度依賴性，此結(jié)果為舒洛地特治療靜脈性潰瘍的分子機(jī)制提供了依據(jù)。未來將更深入地研究舒洛地特降低血管內(nèi)皮的低氧損傷深層機(jī)制及其作用靶點(diǎn)，以期發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)或降低血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧損傷更有效的治療方式。

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