張愛萍， 高瑞蘭， 尹利明， 羅梅宏， 成 志， 夏樂敏， 鄭智茵△

(1上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 上海 201999； 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 浙江 杭州 310006；3浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 浙江 杭州 310003)

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)簡(jiǎn)稱再障，是血液系統(tǒng)疾病中常見難治病之一。流行病學(xué)上,東南亞國(guó)家再障的發(fā)病率較發(fā)達(dá)國(guó)家明顯增加，歐洲國(guó)家再障的發(fā)病率為0.2/106，而在中國(guó)再障的發(fā)病率約為歐美的3倍[1]。目前再障的治療主要包括免疫抑制劑治療(如環(huán)孢素)、促進(jìn)造血治療(如雄激素)、造血干細(xì)胞移植等，但現(xiàn)實(shí)中造血干細(xì)胞移植受HLA匹配供者來源少、費(fèi)用昂貴等限制，而常用西藥免疫抑制劑和雄激素等常因諸多不良反應(yīng)而無法長(zhǎng)期使用。因此，尋求安全有效的新的治療方法和中藥新藥很有必要。

再障的發(fā)病機(jī)制涉及多種信號(hào)通路，其中細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號(hào)通路可能是涉及再障發(fā)生和發(fā)展比較重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本實(shí)驗(yàn)室前期采用雙向電泳質(zhì)譜分析法對(duì)再障小鼠骨髓有核細(xì)胞總蛋白分析后也發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A1的表達(dá)水平異常上升；膜聯(lián)蛋白A1是一種鈣依賴的磷脂結(jié)合多功能蛋白，可以調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的信號(hào)通路和MAPK/ERK信號(hào)通路，提示MAPK/ERK信號(hào)通路的異?？赡芘c再障的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。人參二醇組皂苷(pana-xadiol saponins，PDS)是本項(xiàng)目組自行從中藥人參中提取的有效成分，本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明PDS能夠有效地促進(jìn)再障模型小鼠骨髓造血功能恢復(fù)及刺激造血祖細(xì)胞增殖[2]。臨床上用PDS治療慢性再障的療效顯著，能夠部分代替雄激素[3]。此外，我們已報(bào)道PDS可能通過恢復(fù)再障模型小鼠T細(xì)胞比例失衡狀態(tài)而參與免疫調(diào)節(jié)[4]，但PDS對(duì)再障小鼠MAPK/ERK信號(hào)通路的誘導(dǎo)作用尚未見報(bào)道。本文通過觀察PDS對(duì)免疫介導(dǎo)型再障小鼠骨髓造血功能及脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響，探索其對(duì)再障小鼠骨髓細(xì)胞MAPK/ERK信號(hào)通路蛋白激酶及對(duì)脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，試圖驗(yàn)證PDS 治療再障的有效性及可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物

近交系BALB/c小鼠(H2d, MLSb)，雌雄兼用，8～10周齡，體重17～20 g,作為受者。DBA/2小鼠(H2d, MLSa)，8～10周齡，雌雄兼用，作為供者。以上動(dòng)物均購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(滬)2013-0016。

PDS干燥粉劑由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血研所提供，批號(hào)為20130316；陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)孢素A(ciclosporin A，CsA)由杭州中美華東制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)為H10960221。藥物均在臨用前用生理鹽水配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 主要試劑和儀器

TEMED和NC膜(Promega)；Western marker(Bio-Rad)；抗β-actin抗體(Signalway Antibody)；丙烯酰胺、N,N’-亞甲雙丙烯酰胺和Tris(Sangon)；抗MEK1/2、p-MEK1/2(Ser221)、ERK1/2和p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)單克隆抗體(CST)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(聯(lián)科公司)；ECL試劑盒(Biological Industries)；FITC標(biāo)記的抗鼠CD4抗體(CD4-FITC)、PE標(biāo)記的抗鼠CD25抗體(CD25-PE)、APC標(biāo)記的抗鼠Foxp3抗體(Foxp3-APC)以及相應(yīng)的同型陰性對(duì)照抗體(eBioscience)。PENTRA 80血液分析儀(ABX)；電泳儀、垂直電泳裝置、轉(zhuǎn)膜裝置和全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；流式細(xì)胞儀(BD)；顯微鏡及倒置顯微鏡(Olympus)。

3 方法

3.1按照本研究所建立的方法[5]制備免疫介導(dǎo)的再障小鼠模型 將[60Co]-γ射線5.0 Gy (1 Gy/min，5 min)全身照射BALB/c小鼠5 min，照射后4 h 內(nèi)經(jīng)小鼠尾靜脈輸入DBA/2小鼠胸腺和淋巴結(jié)混合細(xì)胞懸液(濃度為5×109/L)0.2 mL。

3.2PDS治療后外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分6組，包括正常(normal)組，再障模型(AA)組，PDS低、中、高劑量治療組(PDS 20、40、80 mg·kg-1·d-1)，環(huán)孢素組(CsA, 50 mg·kg-1·d-1)陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。各組小鼠經(jīng)不同藥物連續(xù)灌胃治療14 h后，尾靜脈取血，用血液分析儀檢測(cè)各組小鼠的白細(xì)胞(white blood cells，WBC)、血紅蛋白(hemoglobin，Hb)和血小板(platelet，PLT)計(jì)數(shù)。

3.3骨髓病理切片的制作 取各組小鼠雙側(cè)股骨，置于苦味酸-多聚甲醛固定液中固定，稀鹽酸脫鈣，常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色，中性塑膠封片，顯微鏡下觀察骨髓造血組織增生情況。

3.4Western blot法檢測(cè)蛋白水平 收集各組小鼠骨髓細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白含量，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜(4 ℃、100 V電壓、70 min)，封閉1 h， I 抗孵育(兔抗鼠MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2抗體，均1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，加入II抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG，1∶3 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，ECL反應(yīng)，Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，并以小鼠肌動(dòng)蛋白β-actin條帶為內(nèi)參照進(jìn)行蛋白上樣量的校正，進(jìn)行半定量分析。

3.5免疫組織化學(xué)(SP法)實(shí)驗(yàn) 小鼠股骨經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋并切片，滅活內(nèi)源性酶，熱修復(fù)抗原，加入 I 抗(抗MEK1/2抗體，1∶100稀釋;抗p-MEK1/2抗體，1∶50稀釋；抗ERK1/2抗體，1∶200稀釋；抗p-ERK1/2抗體，1∶400稀釋)37 ℃孵育1 h，加入 II 抗(辣根過氧化物酶連接的抗兔IgG，1∶50稀釋)37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木蘇復(fù)染，光學(xué)顯微鏡下觀察，免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞將顯示為棕黃色胞質(zhì)濃染，細(xì)胞核不著色，陽(yáng)性細(xì)胞密度(positive cell density，PCD)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/陽(yáng)性細(xì)胞面積，提示蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

3.6流式細(xì)胞術(shù) 收集各組小鼠脾臟，制備脾臟單個(gè)細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞數(shù)20 000個(gè)/管，在FSC-SCC散點(diǎn)圖上選定T淋巴細(xì)胞群，以CD4和SSC設(shè)門選擇CD4+細(xì)胞分析CD25和Foxp3表達(dá)，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用CellQuest軟件分析各組小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)描述，多組間比較采用方差分析，有差異者進(jìn)一步兩兩比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PDS升高再障小鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)

與正常對(duì)照組比較，再障模型組小鼠外周血WBC、Hb和PLT計(jì)數(shù)均明顯減少(P<0.05)，符合再障的血象特點(diǎn)。與模型組比較，PDS低、中、高劑量治療組的WBC、Hb和PLT計(jì)數(shù)均明顯升高(P<0.05)；其中，PDS高劑量組的作用最明顯，WBC、Hb和PLT計(jì)數(shù)均顯著高于PDS中劑量組(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)孢素治療后外周血象也明顯高于再障模型組(P<0.05)，但其作用不如PDS高劑量組，見表1。

表1PDS治療后各組小鼠外周血象計(jì)數(shù)的比較

Table 1. Diffrent doses of PDS elevated the peripheral blood hemoglobin (Hb) concentration and cell counts in the AA mice (Mean±SD.n=10)

GroupWBC(×109/L)Hb(g/L)PLT(×109/L)Normal6．36±0．11130．20±0．98410．63±0．83AA1．24±0．09?40．48±0．39?121．40±0．74?PDS(20mg·kg-1·d-1)1．51±0．07?#58．69±0．15?#177．19±0．83?#PDS(40mg·kg-1·d-1)3．32±0．06?#▲75．60±0．60?#▲242．45±0．68?#▲PDS(80mg·kg-1·d-1)3．94±0．80?#▲■96．28±11．27?#▲■344．20±25．62?#▲■CsA2．83±0．34?#▲■●60．60±47．10?#▲■●266．84±11．98?#▲■●

*P<0.05vsnormal group；#P<0.05vsAA group；▲P<0.05vsPDS (20 mg·kg-1·d-1) group；■P<0.05vsPDS (40 mg·kg-1·d-1) group；●P<0.05vsPDS (80 mg·kg-1·d-1) group.

2 PDS減輕再障小鼠骨髓抑制，促進(jìn)造血功能恢復(fù)

鏡下可見，正常組小鼠骨髓增生活躍，造血細(xì)胞量豐富，分布均勻，骨髓造血組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯的脂肪組織。再障模型組骨髓增生極度低下，造血細(xì)胞量明顯減少，出現(xiàn)大量空白區(qū)，被脂肪組織代替，造血細(xì)胞量顯著減少，符合再障的骨髓病理學(xué)特征。PDS低劑量組可見網(wǎng)狀造血組織增生，造血細(xì)胞數(shù)量較模型組逐漸增加，脂肪組織減少。PDS中、高劑量組可見骨髓增生程度明顯好轉(zhuǎn)，三系均有明顯增生，少量非造血組織及脂肪細(xì)胞，造血組織基本結(jié)構(gòu)明顯修復(fù)。環(huán)孢素治療組可見骨髓增生程度好轉(zhuǎn)，造血細(xì)胞數(shù)量均有少量回升，脂肪組織較模型組減少，見圖1。

3 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，再障模型組小鼠骨髓細(xì)胞MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平明顯下降，與正常小鼠組相比差異顯著(P<0.05)。各治療組與模型組比較，骨髓細(xì)胞MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平均有不同程度升高(P<0.05)，見圖2、表2。

Figure 1. PDS attenuated myelosuppression status in the AA mice (HE staining， ×200). A: normal group; B: AA group; C: PDS (20 mg·kg-1·d-1) group; D: PDS (40 mg·kg-1·d-1) group; E: PDS (80 mg·kg-1·d-1) group; F: CsA group.

圖1PDS治療后各組小鼠骨髓病理切片觀察

Figure 2. PDS up-regulated the protein levels of MEK1/2, p-MEK1/2, ERK1/2 and p-ERK1/2 in the bone marrow cells of AA mice determined by Western blot. A: normal group; B: AA group; C: PDS (20 mg·kg-1·d-1) group; D: PDS (40 mg·kg-1·d-1) group; E: PDS (80 mg·kg-1·d-1) group; F: CsA group.

圖2Westernblot檢測(cè)PDS對(duì)再障小鼠骨髓細(xì)胞MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平的影響

4 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組骨髓切片MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)均微弱，明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)。PDS中、高劑量組小鼠骨髓切片MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性強(qiáng)度均高于模型組(P<0.05)，其中PDS高劑量組的作用最明顯(P<0.05)，見圖3、表3。

5 PDS提高再障小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例

與正常對(duì)照組小鼠相比，再障模型組小鼠脾臟中CD4+細(xì)胞比例和CD4+CD25+Foxp3+/CD4+細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05)，符合再障免疫異常特點(diǎn)。與模型組比較，PDS低、中、高劑量治療組的脾臟中CD4+細(xì)胞比例和CD4+CD25+Foxp3+/CD4+細(xì)胞比例均明顯升高(P<0.05)；PDS高劑量組的作用最明顯，脾臟中CD4+細(xì)胞比例和CD4+CD25+Foxp3+/CD4+細(xì)胞比例顯著高于再障模型組(P<0.05)，其作用與陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)孢素相近，見表4。

表2Westernblot檢測(cè)PDS對(duì)再障小鼠骨髓細(xì)胞MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平的影響

Table 2. PDS up-regulated the protein levels of MEK1/2, p-MEK1/2, ERK1/2 and p-ERK1/2 in bone marrow cells of AA mice determined by Western blot (Mean±SD.n=5)

GroupMEK1/2/β?actinp?MEK1/2/β?actinERK1/2/β?actinp?ERK1/2/β?actinNormal0．41±0．020．83±0．040．70±0．080．47±0．04AA0．55±0．02?0．61±0．03?0．16±0．03?0．64±0．04?PDS(20mg·kg-1·d-1)0．77±0．03?#0．84±0．03#0．54±0．05#0．72±0．03?#PDS(40mg·kg-1·d-1)0．81±0．02?#▲0．87±0．03#0．44±0．06?#▲0．72±0．03?#PDS(80mg·kg-1·d-1)0．84±0．03?#▲0．75±0．03?#▲■0．65±0．05#▲■0．78±0．02?#CsA0．73±0．02?#▲■●0．48±0．01?#▲■●0．92±0．04?#▲■●0．57±0．06?#▲■●

*P<0.05vsnormal group；#P<0.05vsAA group；▲P<0.05vsPDS (20 mg·kg-1·d-1) group；■P<0.05vsPDS (40 mg·kg-1·d-1) group；●P<0.05vsPDS (80 mg·kg-1·d-1) group.

Figure 3. PDS up-regulated the protein levels of MEK1/2, p-MEK1/2, ERK1/2 and p-ERK1/2 in the bone marrow of AA mice tested by immunohistochemistry (×400). 1: normal group; 2: AA group; 3: PDS (20 mg·kg-1·d-1) group; 4: PDS (40 mg·kg-1·d-1) group; 5: PDS (80 mg·kg-1·d-1) group; 6: CsA group； A: MEK1/2; B: p-MEK1/2; C: ERK1/2; D: p-ERK1/2.

圖3免疫組織化學(xué)法觀察PDS上調(diào)再障小鼠骨髓MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白水平

表3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PDS上調(diào)再障小鼠骨髓MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白水平

Table 3. PDS up-regulated the protein levels of MEK1/2, p-MEK1/2, ERK1/2 and p-ERK1/2 in the bone marrow of AA mice tested by immunohistochemistry (cells/0.01 mm2. Mean±SD.n=5)

GroupMEK1/2p?MEK1/2ERK1/2p?ERK1/2Normal18．06±0．7114．54±0．7518．78±0．4117．84±0．56AA9．84±0．84?8．74±0．65?12．18±0．75?12．78±0．57?PDS(20mg·kg-1·d-1)10．56±0．65?9．14±0．56?12．84±1．03?13．96±1．10?#PDS(40mg·kg-1·d-1)14．92±0．48?#▲12．52±0．61?#▲14．54±0．69?#▲15．10±0．93?#PDS(80mg·kg-1·d-1)19．02±0．69?#▲■15．06±1．40#▲■18．66±0．59#▲■18．36±0．47#▲■CsA13．80±0．68?#▲■●14．70±0．60#▲■14．10±1．12?#▲●15．16±0．76?#●

*P<0.05vsnormal group；#P<0.05vsAA group；▲P<0.05vsPDS (20 mg·kg-1·d-1) group；■P<0.05vsPDS (40 mg·kg-1·d-1) group；●P<0.05vsPDS (80 mg·kg-1·d-1) group.

討 論

MAPK是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶，可被諸多細(xì)胞外刺激信號(hào)，如炎癥因子和細(xì)菌復(fù)合物等以磷酸化方式激活，將胞外的刺激信號(hào)傳遞至胞核內(nèi)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、黏附及凋亡等[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，尤其與再障的發(fā)病密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)施海濤等[7]和吳雷等[8]研究表明，慢性AA患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MEK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組下降，CAA患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)p-P38和p-JNK蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組上升。由此可見，MAPK信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)水平異常與再障的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系。

表4PDS提高再障小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例

Table 4. Different doses of PDS increased the proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells of the spleen in the AA mice (%. Mean±SD.n=10)

GroupCD4+cellproportionCD4+CD25+Foxp3+/CD4+cellproportionNormal68．14±1．078．45±0．45AA16．63±1．14?3．55±0．17?PDS(20mg·kg-1·d-1)21．56±0．95?#4．68±0．19?#PDS(40mg·kg-1·d-1)34．02±1．34?#▲5．85±0．52?#▲PDS(80mg·kg-1·d-1)55．52±1．10?#▲■6．33±0．30?#▲■CsA56．52±0．79?#▲■6．53±0．19?#▲■

*P<0.05vsnormal group；#P<0.05vsAA group；▲P<0.05vsPDS (20 mg·kg-1·d-1) group；■P<0.05vsPDS (40 mg·kg-1·d-1) group；●P<0.05vsPDS (80 mg·kg-1·d-1) group.

CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是一組具有抑制自身免疫反應(yīng)、阻止損傷性免疫病理發(fā)生和維持機(jī)體免疫平衡作用的T細(xì)胞，近年來研究表明，其在再生障礙性貧血發(fā)病中起重要作用。Solomon等[17]研究證實(shí)再障患者Treg細(xì)胞顯著低于正常人群，提示Treg細(xì)胞缺乏與再障發(fā)病密切相關(guān)。

人參二醇組皂苷可顯著刺激人和小鼠骨髓多種造血祖細(xì)胞的增殖,有效改善再障小鼠外周血象，并通過調(diào)節(jié)脾臟中Treg細(xì)胞比例變化而參與免疫功能調(diào)節(jié)。我們已報(bào)道PDS治療慢性再障的臨床研究，結(jié)果顯示療效良好，具有改善骨髓抑制，加快骨髓造血功能恢復(fù)，升高外周血白細(xì)胞及血小板數(shù)，促進(jìn)骨髓粒系和巨核系造血祖細(xì)胞增殖作用[18]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建免疫介導(dǎo)的再障小鼠模型，研究PDS治療再障，促進(jìn)骨髓造血功能的恢復(fù)是否涉及MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的變化。通過免疫組化及Western blot法檢測(cè)再障小鼠骨髓組織和細(xì)胞MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白激酶的表達(dá)水平。結(jié)果提示再障小鼠骨髓組織和細(xì)胞MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)均低于正常小鼠組，且有顯著差異；各治療組小鼠骨髓細(xì)胞組織和細(xì)胞MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平較模型組有不同程度地上升，其中PDS中、高劑量治療組與再障模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示再障的發(fā)生可能與MEK1/2、ERK1/2蛋白激酶低表達(dá)及其磷酸化水平下降有關(guān)。由此我們推測(cè)，MEK1/2及p-MEK1/2蛋白下調(diào)后可能導(dǎo)致ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平降低，使信號(hào)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞核的過程出現(xiàn)障礙，其下游轉(zhuǎn)錄因子如AP-1、NF-κB、c-Jun、c-Fos等作用減弱,使造血干/祖細(xì)胞的增殖、分化能力下降，對(duì)抗造血干/祖細(xì)胞凋亡作用減弱，從而引發(fā)了再障的發(fā)生。采用不同劑量PDS治療再障模型小鼠14 d后，骨髓組織和細(xì)胞MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平均有不同程度地上升，以PDS高劑量組最為顯著。由此推測(cè)，PDS可能通過誘導(dǎo)上調(diào)骨髓造血組織和細(xì)胞MAPK/ERK信號(hào)通路的多種蛋白激酶，加快骨髓造血功能恢復(fù)，刺激造血干/祖細(xì)胞增殖和分化，從而升高外周血象，這可能是PDS促進(jìn)再障造血功能恢復(fù)的作用機(jī)制之一。另外本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，PDS能夠提高再障模型小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，提示PDS可能對(duì)再障模型小鼠的免疫功能有一定的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述, MAPK/ERK信號(hào)通路在再障發(fā)病中起重要作用, 尤其是在造血干細(xì)胞增殖分化與凋亡方面起重要作用。因此，對(duì)MAPK/ERK信號(hào)通路進(jìn)行深入研究有利于探討再障的發(fā)病機(jī)制并為優(yōu)化治療提供新的思路和方法。

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如今，隨著新課程改革的逐漸深入，要求高中數(shù)學(xué)課堂可以更加地突出學(xué)生的主體位置，因此探究式教學(xué)的引入是勢(shì)在必行的.探究式教學(xué)的顯著特點(diǎn)是教學(xué)對(duì)象面向全體學(xué)生，借助問題來延伸和擴(kuò)展教學(xué)內(nèi)容，通過不斷激勵(lì)學(xué)生最終提升學(xué)生的綜合水平.筆者將結(jié)合多年的教學(xué)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)其應(yīng)用策略進(jìn)行闡述.

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