羅宇霖, 方 丹， 劉鈺熙， 賀朝暉， 吳劍波△， 羅 茂△

(西南醫(yī)科大學(xué) 1藥物研究中心， 2臨床醫(yī)學(xué)系， 3藥學(xué)院藥理學(xué)系心血管藥理實驗室， 四川 瀘州 646000)

糖尿病前期(pre-diabetes mellitus， pre-DM)即糖調(diào)節(jié)受損(impaired glucose regulation，IGR)，包括空腹血糖調(diào)節(jié)受損(impaired fasting glucose，IFG)和糖耐量減退(impaired glucose tolerance，IGT)。糖尿病前期是發(fā)展為2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的過渡階段，也是血管病變的獨立高危因素[1]。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類內(nèi)源性的、非編碼小RNA，在人體生命活動中具有廣泛的調(diào)控功能[2]。研究表明，T2DM胰島素抵抗和糖代謝紊亂過程伴隨大量異常表達(dá)的miRNAs，其中miR-103與胰島素抵抗及糖代謝密切相關(guān)[3]。Trajkovski等[3]研究發(fā)現(xiàn)，T2DM肝病患者、ob/ob小鼠及肥胖小鼠肝臟中高水平miR-103與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)；Plé等[4]利用深度測序挖掘正常人血小板mi-RNAs，發(fā)現(xiàn)血小板內(nèi)富含miR-103，占測序所得mi-RNAs總量第3位，然而機理尚不清楚；最近研究揭示，循環(huán)miR-103及其靶標(biāo)分泌型卷曲相關(guān)蛋白4(secreted frizzled-related protein 4，SFRP4)是調(diào)節(jié)糖尿病胰島素信號傳導(dǎo)及炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，其中血清SFRP4可能是糖尿病超前診斷的標(biāo)志物[5]。

循環(huán)miRNAs作為一種非創(chuàng)傷性檢測標(biāo)志物，具有樣本易于采集、保存期長及檢測手段簡便等特點，臨床應(yīng)用價值顯著[6]。目前血漿/血清miRNAs在腫瘤和心血管病等疾病中的應(yīng)用研究已取得重要進(jìn)展，但糖尿病前期循環(huán)miRNAs疾病標(biāo)志物研究尚屬起步[6]。本課題組前期研究結(jié)果揭示，2型糖尿病前期患者血小板miR-103b可負(fù)調(diào)控體內(nèi)葡萄糖耐受及靶標(biāo)SFRP4 mRNA和蛋白表達(dá)水平，提示miR-103b是潛在的新型2型糖尿病前期診斷標(biāo)志物[7]。然而，miR-103b基因特征及其靶基因功能研究仍不清楚，并且，其它循環(huán)系統(tǒng)如血清中miR-103b是否也與2型糖尿病前期診斷密切相關(guān)，以及循環(huán)miR-103b表達(dá)變化與臨床意義，這些問題仍待進(jìn)一步深入探討。研究循環(huán)血清中miR-103b表達(dá)水平、臨床意義及其靶基因功能，將可為臨床尋求2型糖尿病早期診斷標(biāo)志物提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1材料 Mir-XTMmiRNA 第一鏈合成試劑盒和SYBR? RT-qPCR 試劑盒(Clontech)；PrimeScriptTMRT(Perfect Real Time)試劑盒和SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa)；TRIzols(Invitrogen)；無RNA酶水(天根生化科技有限公司)；無酶槍頭和EP管(Axygen)；無水乙醇、氯仿和異丙醇(成都科龍化工)；PCR引物由Invitrogen公司合成。5804R高速冷凍離心機(Eppendorf)；CFX96 Touch 實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；ND-1000微量紫外可見分光光度計(NanoDrop)； -80 ℃超低溫冰箱(Thermo)。

1.2樣本收集 根據(jù)2013年美國糖尿病協(xié)會糖尿病診療中對糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，從2015年9月～2016年5月于我院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科就診患者中選取pre-DM患者(pre-DM組)48例，男22例，女26例，平均年齡(62.21±10.30)歲；糖尿病無并發(fā)癥(noncomplicated diabetes mellitus，NCDM)患者(NCDM組)47例，男23例，女24例，平均年齡(60.46±11.14)歲；另于我院體檢者中選取健康志愿者(control組)50例，男25例，女25例，平均年齡(59.45±9.84)歲，各組年齡和性別差異比較無統(tǒng)計學(xué)顯著性。排除標(biāo)準(zhǔn)：無糖尿病家族病史；糖尿病合并心血管疾病、高血壓病或其它影響miRNA表達(dá)的慢性疾??；已服用糖尿病治療藥物6個月以上者；合并其它影響糖代謝疾病者，如甲狀腺功能亢進(jìn)、庫欣綜合征等；吸煙、酗酒者。以上標(biāo)本收集均通過西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并取得患者知情同意。

2 方法

2.1血液標(biāo)本的收集和處理 使用內(nèi)含促凝劑的真空采血管對所有滿足以上條件的受試者在清晨進(jìn)行空腹采集靜脈血5 mL，室溫靜置60 min，待血液自然凝集后，立即將上層血清分裝于1.5 mL EP管保存于-80 ℃冰箱待用。

2.2血清總RNA的提取 145 例標(biāo)本各取500 μL的血清，按TRIzols試劑盒說明書提供的方法提取總RNA?？俁NA溶于40 μL的無RNA 酶水，使用NanoDrop 1000檢測總RNA的濃度，采用A260/A280判斷所提取RNA的質(zhì)量。

2.3血清中miR-103b的檢測 應(yīng)用試劑盒制備cDNA模板。分別以U6為內(nèi)參照檢測miR-103b的表達(dá)水平。應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq II進(jìn)行real-time PCR檢測。miR-103b的上游引物序列為5’-ACACTCCAGCTGGGTCATAGCCCTGTACAATG-3’，下游引物序列為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。引物擴增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性10 s， 50 ℃～ 60 ℃復(fù)性20 s， 72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)； 72 ℃延伸3 min， 60 ℃到95 ℃繪制熔解曲線。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算miR-103b的表達(dá)量，每個樣品重復(fù)3次。

2.4靶基因的預(yù)測及生物信息學(xué)分析 應(yīng)用在線軟件miRBase(http://www. mirbase.org/)獲得miR-103b的染色體定位和物種保守性等基本信息，采用MEME 4.11.2(http://meme.nbcr.net/)軟件對其保守性進(jìn)行分析。結(jié)合miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)、TargetScan 7.1(http://www.target scan.org/) 和PicTar(http://www.pictar.org/)中的靶基因預(yù)測結(jié)果，分析其中交集結(jié)果并提交miTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)與已證實的靶基因形成靶基因集合，用于后續(xù)分析。并通過DAVID基因注釋軟件數(shù)據(jù)庫對靶基因集合的功能進(jìn)行富集分析。利用KEGG數(shù)據(jù)庫中Pathway子數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.j/kegg/pathway.html)對hsa-miR-103b的靶基因進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。年齡和生化指標(biāo)等數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。miR-103b在pre-DM中的診斷價值采用受試者工作特征(receiver-operating characteristic， ROC)曲線來描述。

結(jié) 果

1 各組人群基線資料的比較

各組間性別、年齡和體質(zhì)指數(shù)(body mass index， BMI)經(jīng)比較無顯著差異(P>0.05)。生化測定結(jié)果顯示，control組、pre-DM組和NCDM組間的空腹血糖(fasting plasma glucose， FPG)、餐后2 h血糖(2 h postprandial plasma glucose， 2hPG)、總膽固醇(total cholesterol， TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C)和糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并呈梯度升高，而高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C)在3組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見表1。

表1 各組人群基線資料比較

*P<0. 05vscontrol group;#P<0. 05vspre-DM group.

2 miR-103的基因定位及保守性分析

由miRbase數(shù)據(jù)庫獲得的序列信息可知，miR-103家族在包括人在內(nèi)的10個物種(人、猩猩、野豬、小鼠、褐家鼠、斑馬魚、安樂蜥、鴨嘴獸、大棕蝠和海七鰓鰻)中具有高度的保守性，采用MEME 4.11.2(http://meme.nbcr.net/)對其保守性與進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明，miR-103在不同生物中的保守性極高，例如在猩猩、野豬、小鼠、褐家鼠、海七鰓鰻、斑馬魚和鴨嘴獸7個物種間序列均相同，見圖1；大棕蝠miR-103序列的前22個堿基與前7個物種相同。hsa-miR-103b定位于人染色體5q34，miR-103在不同物種中的高度保守性，提示其在生物體內(nèi)可能具有重要的生物學(xué)功能，見表2。

3 血清中miR-103b含量的測定

運用real-time PCR檢測control組、pre-DM組和NCDM組血清中miR-103b的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與control組相比，pre-DM組和NCDM組循環(huán)血清中miR-103b的水平呈下降趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與pre-DM組相比，NCDM組血清中miR-103b表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)，表明miR-103b血清水平下降可能與糖尿病的發(fā)生發(fā)展病變進(jìn)程相關(guān)，見圖2。

Figure 1. The conservation analysis of miR-103 in different species by MEME 4.11.2.

圖1不同物種miR-103的保守性分析

表2 不同物種miR-103的序列同源性分析

The detailed information of miR-103 family in different species. All the data was obtained from miRbase.

Figure 2. The serum level of miR-103b in the 3 groups. Mean±SD.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vspre-DM group.

圖2Real-timePCR檢測各組血清中miRNA-103b的表達(dá)

4 miR-103b靶基因預(yù)測及功能分析

通過TargetScan、miRanda和PicTar三大靶基因預(yù)測軟件對miR-103b進(jìn)行靶基因預(yù)測，分別為2 327、8 945和737個，取三者預(yù)測數(shù)據(jù)的交集，合計預(yù)測靶基因與已在miTarbase數(shù)據(jù)庫中驗證的靶基因共53個，見表3。通過進(jìn)一步應(yīng)用DAVID 數(shù)據(jù)庫和GO數(shù)據(jù)庫對靶基因功能進(jìn)行富集分析, 結(jié)果顯示，從分子功能看, miR-103b的靶基因能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄以及通過與PIP3結(jié)合激活下游信號通路；從生物學(xué)過程看，miR-103b的靶基因主要參與蛋白質(zhì)氨基酸的磷酸化、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控及DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；參與細(xì)胞周期、細(xì)胞生長增殖和細(xì)胞凋亡；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則富集于MAPK信號通路、Ras信號通路、Wnt信號通路和胰島素信號通路；另外還涉及細(xì)胞周期過程和脂肪酸代謝過程中的通路，見表4。以上數(shù)據(jù)庫分析提示miR-103b可能參與糖尿病早期糖脂代謝異常、胰島素抵抗和隨后糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展等過程相關(guān)靶基因的調(diào)控。

5 miR-103b對糖尿病前期的診斷價值

通過ROC曲線分析miR-103b對pre-DM患者診斷的準(zhǔn)確性，用循環(huán)血清中miR-103b的相對定量值(臨界值為1.633)進(jìn)行糖尿病前期診斷時的靈敏度為89.8%，特異度為73.5%，曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.877 (95% CI 0.809～0.944)，見圖3。一般認(rèn)為0.7

表3 預(yù)測的has-miR-103b靶基因

表4 hsa-miR-103b 預(yù)測靶基因DAVID富集分析

Figure 3. ROC curve analysis for discrimination between the cases of pre-DM group (n=48) and control group (n=50).

圖3ROC曲線評價血清miR-103b對糖尿病前期的診斷價值

討 論

糖尿病是因胰島素抵抗或者胰島素敏感性降低引起的以高血糖為特征的慢性代謝性紊亂疾病[1]。2型糖尿病占全部糖尿病病例的90%。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會統(tǒng)計，至2013年，全球有3.82億人患有糖尿病，并將在2035年增長至5.92億人[8]。近期研究報道，以前糖尿病標(biāo)準(zhǔn)化的評估方式如FPG、OGTT和HbA1c不僅存在一定的局限性還可能漏診許多DM病例，事實上，在糖耐量受損患者確診為糖尿病前，已經(jīng)出現(xiàn)了異常的病理狀態(tài)如胰島素抵抗，胰島B細(xì)胞受損甚至已累及其它重要的器官，如眼和腎[8]。研究顯示，糖尿病患者產(chǎn)生的胰島細(xì)胞和胰島素靶組織中miRNA會發(fā)生病理性地改變，可特異、敏感、穩(wěn)定地反映在循環(huán)中，甚至在DM患者尚未出現(xiàn)明顯臨床癥狀前，循環(huán)miRNA可能就已出現(xiàn)異常改變，提示循環(huán)miRNA有望作為DM早期診斷的特異性生物學(xué)標(biāo)志物[9]。

研究顯示，miRNA能調(diào)節(jié)多種代謝途徑包括胰島素分泌、葡萄糖穩(wěn)態(tài)以及糖脂代謝[10-14]。本研究提示正常個體、pre-DM患者和DM患者有各自特異性的miRNA表達(dá)譜。hsa-miR-103作為microRNA家族中重要的一員，位于人染色體5q34，本文通過生物信息分析miR-103b的堿基序列在各物種間具有高度的保守性在生物體內(nèi)具有重要的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)miR-103不僅在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、白血病、胰腺癌和膀胱癌等多種腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用，且在糖脂代謝和糖尿病的病理進(jìn)程等方面有著潛在的作用[15]。Trajkovski等[3]研究顯示DM2肝病患者、ob/ob小鼠及肥胖小鼠肝臟中高水平miR-103與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)沉默肥胖糖尿病小鼠miR-103/107的表達(dá)，導(dǎo)致小窩蛋白1的表達(dá)上調(diào)，從而使肝臟葡萄糖輸出減少，改善胰島素敏感性。本研究組前期研究[7]顯示2型糖尿病前期患者血小板miR-103b可負(fù)調(diào)控體內(nèi)葡萄糖耐受及靶標(biāo)SFRP4 mRNA和蛋白表達(dá)水平，提示miR-103b可成為診斷早期糖尿病的臨床標(biāo)記物。綜上所述，miR-103可作為糖尿病肥胖及胰島素信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究在pre-DM組和DM組中均檢測到miR-103表達(dá)，而與對照組相較，pre-DM組與NCDM組循環(huán)血清中miR-103b表達(dá)呈明顯下降趨勢，NCDM組血清中miR-103b較control組顯著降低，提示miR-103b表達(dá)下降是糖尿病發(fā)生發(fā)展的對抗因素，從而進(jìn)一步證實miR-103b可能參與糖代謝。為驗證miR-103b的診斷價值，本研究進(jìn)一步運用SPSS 16.0對miR-103b診斷能力作ROC曲線進(jìn)行評價。ROC曲線顯示，miR-103b在pre-DM組診斷價值較高，其AUC達(dá)到0.877。結(jié)果提示循環(huán)血清中miR-103b對pre-DM患者具有較高的診斷價值，是診斷糖尿病前期靈敏性和特異性較好的臨床標(biāo)志物。

胰島素抵抗作為糖尿病的始動因素，而研究證實miR-103在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演重要角色[3]。目前，已有大量研究發(fā)現(xiàn)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)與胰島素抵抗密切相關(guān)[16-18]。本文通過對hsa-miR-103b的靶基因進(jìn)行功能富集分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-103b的靶基因主要富集于MAPK 信號通路、Wnt信號通路、Insulin信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等信號通路,另外還涉及細(xì)胞周期過程、脂肪酸代謝過程的通路中。pre-DM患者與T2DM患者通常會代償性地增強胰島B細(xì)胞分泌胰島素的效力，隨著病情的發(fā)展，胰島B細(xì)胞破壞后誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而激活MAPK信號通路，MAPK信號通路激活后促進(jìn)外周胰島素抵抗，抑制胰島素的合成與分泌、促進(jìn)胰島細(xì)胞的凋亡。Wnt信號通路是調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育和分化的關(guān)鍵通路之一。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路不僅能夠抑制機體脂肪細(xì)胞的生成，還能調(diào)節(jié)胰島B細(xì)胞的形態(tài)和功能[19]，結(jié)合本研究組前期研究成果，我們推測miR-103b可抑制FRP中SFRP4表達(dá)，影響細(xì)胞周期素(cyclin)等下游靶標(biāo)的表達(dá)，從而調(diào)控胰島細(xì)胞的生長與增殖。InsR/IRS/AKT作為傳統(tǒng)的胰島素信號傳遞通路，其下游靶基因的活化及InsR與其它分子或基因間的相互作用都會影響糖脂代謝與胰島素的敏感性。綜上所述，miR-103b通過調(diào)控這些通路中靶基因的表達(dá), 進(jìn)而影響到細(xì)胞的增殖和凋亡, 改變細(xì)胞對胰島素的敏感性。

綜合上述研究結(jié)果提示，循環(huán)血清中miR-103b表達(dá)水平降低有可能成為前期糖尿病和糖尿病病理性進(jìn)展的一個重要的生物標(biāo)志物，對糖尿病發(fā)作的早期診斷和預(yù)防有一定的指示作用，至于血清中miR-103b表達(dá)差異在疾病發(fā)生中的具體調(diào)控機制有待進(jìn)一步研究。有理由相信，隨著miRNAs 在糖尿病研究領(lǐng)域的廣泛深入，血清miRNAs應(yīng)用于診斷早期糖尿病可提高對其的診治水平，改善預(yù)后。

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