張永越， 曹文富, △， 田 晟， 吳 慶

(重慶醫(yī)科大學 1附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科， 2中醫(yī)藥學院， 重慶 400016)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種慢性腎臟病進展至慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)乃至終末期腎病(end-stage renal di-sease， ESRD)的主要病理基礎(chǔ)及共同轉(zhuǎn)歸。研究表明RIF起始于各種損傷引起的炎癥反應[1]，高遷移率族盒蛋白1(high mobility group box protein 1，HMGB1)是介導損傷性炎癥反應的主要因素。它通過信號級聯(lián)激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)[2]，繼而誘導單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與表達[3]，促進腎臟炎性損傷，最終導致腎間質(zhì)纖維化。研究還表明鋅指蛋白超家族成員Krüppel樣因子15(Krüppel-like factor 15，KLF15)具有抗纖維化作用，可調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[4]。目前對腎間質(zhì)纖維化的形成機制已有較深入的研究，但治療手段及療效仍較為有限。中藥多途徑、多靶點的特點在腎間質(zhì)纖維化的防治中具有一定優(yōu)勢，但中醫(yī)典籍中并無“腎纖維化”的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)及演變規(guī)律，類屬于“水腫”、“溺毒”、“癃閉”和“關(guān)格”等病癥，其病機主要為“氣虛、血瘀、痰凝及痰瘀互結(jié)”。本研究所用益氣化瘀化痰方(Yiqi Huayu Huatan decoction，YHHD)為曹文富教授治療慢性腎炎、腎病綜合征、IgA腎病、糖尿病腎病及腎功能不全的基礎(chǔ)方[5]。在前期研究和已知臨床療效的基礎(chǔ)上，本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)建立RIF大鼠模型，探討益氣化瘀化痰方改善腎間質(zhì)纖維化的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實驗動物 SPF級雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量180～220 g，購買并飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房，動物許可證號為SYXK(渝)2012-0001。

1.2藥品及試劑 中藥飲片黃芪、白術(shù)、川芎、姜黃、瓜蔞和海藻購于重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中藥房(由重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥研究室曹文富教授鑒定合格)；替米沙坦(telmisartan)購于重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院西藥房(國藥準字H20080222；批號為6160616)；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix購自TaKaRa；PCR引物由成都寶生生物公司合成；兔抗鼠KLF15和MCP1多克隆抗體購于Novus；兔抗鼠HMGB1單克隆抗體購于Abcam；兔抗鼠NF-κB多克隆抗體購于武漢塞維爾生物公司；HRP標記羊抗兔IgG和HRP標記羊抗鼠IgG及β-actin單克隆抗體購于EARTH；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和蛋白marker購于碧云天生物技術(shù)公司；小鼠SP試劑盒和DAB顯色液購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司；ECL化學發(fā)光液購于Affinity生物技術(shù)公司；大鼠胱抑素C(cystatin C，Cys-C)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和尿酸(uric acid，UA)檢測試劑盒(酶比色法)購自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器設(shè)備 低溫高速離心機(Sigma)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件、ELISAcalc 計算軟件、T100TMPCR儀和Thermo NanoDrop 2000超微量核酸蛋白測定儀(上?；蛴邢薰?；AL204 型電子天平(METTLER TOLEDO)；CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)、電泳儀及電泳槽(Bio-Rad)；BX53熒光正置顯微鏡及CellSens Standard圖像采集軟件(OLYMPUS)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；4 ℃冰箱和-80 ℃超低溫冰箱(Haier公司)。

2 方法

2.1UUO模型的建立 大鼠適應性喂養(yǎng)1周，禁食不禁水12 h后，用2%戊巴比妥鈉以2.5 mL/kg劑量腹腔注射。常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，于左肋緣下脊柱旁開1.5 cm處作2 cm左右切口，將左腎牽拉出切口，在腎蒂處脂肪內(nèi)沿左腎下極尋找輸尿管，齊左腎下極用4-0絲線結(jié)扎輸尿管，距結(jié)扎點0.7 cm處再次結(jié)扎，于兩結(jié)扎點間剪斷輸尿管，將左腎還納腹腔，依次縫合肌肉筋膜、皮膚，切口消毒。假手術(shù)組除不結(jié)扎剪斷輸尿管，其余操作相同。

2.2藥物制備 益氣化瘀化痰方各中藥飲片均按《中國藥典》(2015版)規(guī)定的臨床常用量使用，即黃芪30 g、白術(shù)10 g、川芎10 g、姜黃10 g、瓜蔞10 g和海藻10 g。各中藥飲片混合水提后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成含生藥2 kg/L的制劑，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｌ婷咨程怪苿┯蒙睇}水配成2 g/L的制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3分組及給藥 UUO術(shù)后將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、替米沙坦組及益氣化瘀化痰方低、中、高劑量(YHHD-low、YHHD-middle和YHHD-high)組，每組8只。根據(jù)《藥理實驗方法學》體表面積折算法計算大鼠用藥劑量，成人體重以70 kg算，大鼠等效劑量為成人6.3倍，由此算出大鼠替米沙坦和益氣化瘀化痰方的臨床等效劑量分別為3.6 mg/kg和7.2 g/kg。以臨床等效劑量的0.5倍、1倍及2倍設(shè)立益氣化瘀化痰方低(3.6 g/kg)、中(7.2 g/kg)和高(14.4 g/kg)劑量。術(shù)后各組大鼠予相應制劑灌胃，制劑間的體積差用生理鹽水補齊，模型組和假手術(shù)組予等體積生理鹽水灌胃。各組大鼠分籠喂養(yǎng)，實驗期間每日灌胃1次，連續(xù)用藥12周，自由飲水、進食相同的標準飼料。

2.4標本采集 灌胃12周并于末次灌胃后，禁食不禁水12 h，用2%戊巴比妥鈉以2.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，心臟取血，血清于-80 ℃保存，用于檢測血清胱抑素C和尿酸；取術(shù)側(cè)腎臟，部分腎組織放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，用于提取mRNA及蛋白，部分4%多聚甲醛固定。

2.5腎功能檢測 血清胱抑素C和尿酸檢測按試劑盒說明書操作。

2.6腎組織形態(tài)學觀察 腎組織固定后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3 μm厚切片；按試劑說明進行PAS染色和Masson染色后，脫水，透明，中性樹膠封片。

2.7膠原面積計算 400倍光鏡下，每張切片隨機選擇10個不重疊視野，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定其陽性(藍色)區(qū)域面積與該視野組織的總面積(去除腎小管管腔)，以二者百分比計算腎間質(zhì)膠原纖維沉積率。

2.8Real-time PCR TRIzol法提取總mRNA，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s條件下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴增條件為預變性 95 ℃ 30 s；95 ℃變性 5 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。采用real-time PCR相對定量方法(2-ΔΔCt法)進行分析。引物信息見表1。

2.9Western blot檢測蛋白表達 RIPA裂解液提取腎組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，用5×上樣緩沖液配平各蛋白樣品，上樣進行SDS-PAGE。根據(jù)蛋白marker位置切下目的蛋白所在的PAGE膠；將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加 I 抗，搖床4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫下 II 抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min?；瘜W發(fā)光成像儀中顯影。目的蛋白與內(nèi)參照β-actin吸光度值之比為該蛋白的相對表達量。

2.10免疫組化檢測MCP-1蛋白表達 采用SP法，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；枸櫞酸鈉微波加熱法修復抗原；3%過氧化氫孵育消除過氧化物酶活性；山羊血清封閉。滴加抗MCP-1抗體，濕盒4 ℃過夜；滴加生物素標記 II 抗孵育；滴加HRP標記的鏈霉卵白素工作液孵育；DAB避光顯色。蘇木素復染，自來水沖洗，脫水，透明，封片。400倍鏡下每張切片隨機選取10個不重疊視野，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，分別計算陽性區(qū)域積分吸光度(integrated absorbance，IA)及視野內(nèi)組織面積(area)，以平均吸光度(IA/area)作為該蛋白的相對表達量。

表1 Real-time PCR的引物序列

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。Levene檢驗判斷方差齊性，方差齊時組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗；方差不齊時采用獨立樣本Kruskal-Wallis檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 腎組織外觀

假手術(shù)組腎臟大小形態(tài)正常，呈暗紅色、質(zhì)軟；模型組左側(cè)腎臟明顯腫大，呈暗褐色，包膜緊張，切開后內(nèi)含褐色渾濁腎積水，腎盂腎盞擴張變形；YHHD中、高劑量組及替米沙坦組左側(cè)腎臟亦明顯腫大、呈暗褐色，但殘存皮質(zhì)較模型組厚。

2 腎組織形態(tài)學觀察

PAS和Masson染色結(jié)果顯示假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)正常，僅腎小球基膜、系膜區(qū)及小管周圍間質(zhì)區(qū)見少量膠原纖維呈線狀分布；模型組腎小球數(shù)量減少，腎小管嚴重萎縮，炎性細胞彌漫浸潤，腎間質(zhì)區(qū)及系膜區(qū)增寬伴大量膠原纖維沉積；各藥物干預組較模型組間質(zhì)纖維化程度有所減輕，其中YHHD中、高劑量組及替米沙坦組改善較明顯，見圖1、2。

3 YHHD對膠原纖維沉積率的影響

Masson染色后計算腎間質(zhì)膠原纖維沉積率。結(jié)果顯示，模型組膠原纖維沉積率明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；YHHD中、高劑量組及替米沙坦組明顯低于模型組(P<0.05)；YHHD低劑量組與模型組的差異無統(tǒng)計學顯著性，見表2。

Figure 1. The morphological changes of renal tissues in the rats of each group (PAS staining，×400). A: sham group； B:model group；C: telmisartan group； D: YHHD-low group； E: YHHD-middle group； F: YHHD-high group.

圖1各組大鼠腎組織腎組織形態(tài)變化

Figure 2. The collagen deposition in renal tissues of the rats in each group (Masson staining，×400). A: sham group； B: model group； C: telmisartan group； D: YHHD-low group； E: YHHD-middle group； F: YHHD-high group.

圖2各組大鼠腎組織膠原沉積情況

4 YHHD對血清胱抑素C和尿酸的影響

Cys-C是評價腎功能損害的靈敏標志物。本研究中模型組血清Cys-C較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)；YHHD低、中、高劑量組及替米沙坦組Cys-C較模型組均顯著下降(P<0.05)。各組間UA水平的差異無統(tǒng)計學顯著性，見表2。

表2各組大鼠血清Cys-C、UA和腎組織膠原纖維沉積率的比較

Table 2. Comparison of serum levels of Cys-C and UA, and the deposition rate of collagen fibers in renal tissues of the rats in each group (Mean±SD.n=8)

GroupCys?C(mg/L)UA(μmol/L)DepositionrateofcollagenfibersSham3．37±0．1128．27±9．070．044±0．010Model12．76±0．58#31．77±7．360．472±0．106#Telmisartan5．17±0．75?#30．80±2．880．232±0．128?#YHHD?low6．31±0．84?#29．82±5．000．387±0．129#YHHD?middle5．32±0．65?#30．02±8．280．275±0．103?#YHHD?high4．61±0．43?#31．77±9．330．207±0．100?#

#P<0.05vssham group；*P<0.05vsmodel group.

5 YHHD對腎間質(zhì)纖維化相關(guān)基因表達的影響

模型組中HMGB1、NF-κB、 IκB、MCP-1、IL-1β和TNF-α的mRNA表達較假手術(shù)組明顯上調(diào)(P<0.05)，藥物干預后上述基因表達較模型組均有不同程度下調(diào)，以YHHD高劑量組下調(diào)最明顯(P<0.05)。檢測細胞外基質(zhì)成分的基因表達發(fā)現(xiàn)，模型組的纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、I 型膠原(collagen type I ，Col I) 和IV型膠原(collagen type IV，Col IV)的mRNA表達較假手術(shù)組明顯上調(diào)(P<0.05)，藥物干預后，YHHD高劑量組下調(diào)最明顯(P<0.05)，其次為替米沙坦組。模型組及各藥物干預組抗纖維化因子KLF15的mRNA水平均較假手術(shù)組明顯下調(diào)(P<0.05)，但YHHD高劑量組較模型組有明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖3。

6 YHHD對腎組織HMGB1、NF-κB和KLF15蛋白表達的影響

模型組的HMGB1和NF-κB的蛋白表達較假手術(shù)組明顯上調(diào)(P<0.05)，KLF15的蛋白表達較假手術(shù)組明顯下調(diào)(P<0.05)；YHHD中、高劑量組及替米沙坦組的HMGB1和NF-κB表達較模型組明顯下調(diào)(P<0.05)，YHHD高劑量組及替米沙坦組的KLF15表達較模型組明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖4、表3。

7 免疫組化檢測腎組織MCP-1蛋白的表達

假手術(shù)組MCP-1僅微量表達于腎小管上皮細胞；模型組MCP-1大量表達于腎小球內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞及間質(zhì)區(qū)，在纖維化和炎細胞浸潤區(qū)表達明顯增強；YHHD高劑量組和替米沙坦組MCP-1少量表達于間質(zhì)區(qū)；YHHD低、中劑量組MCP-1表達區(qū)域與模型組大致相同，但表達量和強度均低于模型組，見圖5。統(tǒng)計結(jié)果顯示，模型組的MCP-1表達明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，YHHD高劑量組和替米沙坦組MCP-1表達明顯低于模型組(P<0.05)，而YHHD低、中劑量組MCP-1表達水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，見表3。

Figure 3. The expression of fibrosis-related genes in renal tissues of the rats in each group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vssham group；*P<0.05vsmodel group.

圖3各組大鼠腎組織纖維化相關(guān)基因的表達

Figure 4. The protein expression of HMGB1, NF-κB and KLF15 in renal tissues of the rats in each group.

圖4各組大鼠腎組織HMGB1、NF-κB和KLF15蛋白的表達

討 論

腎纖維化包括RIF和腎小球硬化。RIF程度與腎功能受損程度具有高度相關(guān)性，決定慢性腎臟病的預后[6]。本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立腎間質(zhì)纖維化模型，該模型是觀察RIF的經(jīng)典模型，在研究中被廣泛應用[7]。

本研究所用益氣化瘀化痰方中黃芪為“益氣補中要藥”，白術(shù)為“益氣健脾要藥”；川芎為“血中之氣藥”，姜黃“主心腹結(jié)積，下氣，破血，消癰腫”；海藻“主破散結(jié)氣，癰腫癥瘕堅氣”，瓜蔞“滌痰結(jié)，止消渴，利大腸消癰腫瘡毒”。益氣藥黃芪、白術(shù)與化痰藥瓜蔞、海藻配伍，能協(xié)同發(fā)揮益氣健脾、化痰散結(jié)作用，再與化瘀藥川芎、姜黃配伍，共奏益氣化瘀化痰之效。益氣扶正使津液正常輸布、血脈通利，杜絕痰濁與瘀血的生成；化瘀化痰促進已成之“痰凝、瘀血”消散，諸藥合用以期改善腎間質(zhì)纖維化“痰濁凝聚、痰瘀互結(jié)”的病理狀態(tài)，在一定程度上恢復腎組織結(jié)構(gòu)及功能。已有研究表明上述中藥或其有效成分可通過多種途徑調(diào)節(jié)參與纖維化進程的關(guān)鍵因子，發(fā)揮抗纖維化作用[8-11]。

Figure 5. The protein expression of MCP-1 in renal tissues of the rats in each group (immunohistochemical staining，×400). A: sham group； B: model group； C: telmisartan group； D: YHHD-low group； E: YHHD-middle group； F: YHHD-high group.

圖5各組大鼠腎組織MCP-1蛋白的表達

表3各組大鼠腎組織HMGB1、NF-κB、KLF15及MCP-1蛋白的表達

Table 3. The protein expression of HMGB1, NF-κB, KLF15 and MCP-1 in renal tissues of the rats in each group (Mean±SD.n=8)

GroupHMGB1NF?κBKLF15MCP?1Sham1．930±0．3880．366±0．0503．833±0．2600．003±0．002Model4．056±0．518#1．096±0．102#1．870±0．325#0．270±0．202#Telmisartan2．440±0．299?#0．457±0．134?#2．462±0．584?#0．013±0．006?YHHD?low4．030±0．505#1．034±0．085#1．828±0．380#0．068±0．025#YHHD?middle3．399±0．509?#0．831±0．121?#2．348±0．378#0．043±0．022#YHHD?high1．291±0．255?#0．357±0．078?2．643±0．265?#0．009±0．006?

*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vssham group.

Cys-C是評價腎功能損害的敏感指標[12]。本研究中模型組Cys-C明顯升高，PAS及Masson染色顯示腎小管萎縮，炎性細胞浸潤，間質(zhì)大量膠原纖維沉積，纖維化明顯。藥物干預后，各組Cys-C均較模型組明顯下降，腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化較模型組明顯減輕，以YHHD高劑量組改善最為明顯。

腎間質(zhì)纖維化始于各種病因引起的腎組織損傷，持續(xù)存在的損傷使炎癥反應失去控制，引發(fā)病理性修復，繼而導致腎間質(zhì)纖維化[13]。UUO引起的炎癥反應由機械損傷所致，損傷相關(guān)分子模式(da-mage-associated molecular patterns，DAMPs)是促成這種非感染性炎癥的主要因素。HMGB1是存在于真核細胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，也是近年來研究較多的內(nèi)源性DAMP[14]。組織損傷、細胞壞死或固有免疫細胞被激活時，釋放到細胞外的HMGB1成為一種“內(nèi)源性危險信號”，與單核巨噬細胞和樹突狀細胞等天然免疫細胞表面的模式識別受體結(jié)合[15]，通過受體胞內(nèi)區(qū)的髓樣分化因子88，激活I(lǐng)L-1受體連接的蛋白激酶和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，繼而激活I(lǐng)κB激酶IKK，使NF-κB的抑制因子IκB降解，NF-κB得以轉(zhuǎn)位入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能。NF-κB對多種參與炎癥過程的酶類、細胞因子以及細胞黏附分子的表達都起到重要調(diào)節(jié)作用，可引起其下游MCP-1、IL-1β和TNF-α等炎癥介質(zhì)的過度表達[16]。MCP-1為CC亞家族趨化因子，對單核巨噬細胞在內(nèi)的多種炎細胞具有趨化和激活作用，而浸潤的巨噬細胞數(shù)與腎間質(zhì)纖維化程度成正比[17]。此外，過度表達的IL-1β和TNF-α又可刺激單核巨噬細胞釋放HMGB1，活化NF-κB，致炎癥信號不斷放大，造成炎癥失控遷延，進一步加重腎組織損傷[18-19]。

KLF15主要在腎臟的系膜細胞區(qū)和腎間質(zhì)區(qū)表達，具有調(diào)控分化，增殖，凋亡和纖維化等作用[20]。研究表明KLF15可與NF-κB的p65亞基競爭結(jié)合乙?；D(zhuǎn)移酶p300，抑制p300依賴的p65乙?；?p65乙酰化是NF-κB發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性的重要翻譯后修飾方式)，從而減少NF-κB下游炎癥介質(zhì)合成，發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用[4]。

本研究中模型組HMGB1表達較假手術(shù)組顯著上調(diào)，而HMGB1由損傷細胞及固有免疫細胞釋放，提示UUO后的輸尿管梗阻導致腎組織持續(xù)損傷及免疫細胞激活。藥物干預后各組HMGB1表達均有下調(diào)，以YHHD高劑量組下調(diào)最明顯。釋放到胞外的HMGB1可通過各級信號級聯(lián)激活NF-κB，控制其下游MCP-1、IL-1β及TNF-α等多種炎癥介質(zhì)的表達。本研究中模型組NF-κB表達較假手術(shù)組明顯上調(diào)，各藥物干預后NF-κB表達顯著下調(diào)，同樣以YHHD高劑量組下調(diào)最明顯。相應的，模型組MCP-1、IL-1β及TNF-α 較假手術(shù)組明顯上調(diào)，藥物干預后，仍以YHHD高劑量組下調(diào)最明顯。以上結(jié)果提示單側(cè)輸尿管結(jié)扎后存在炎癥信號級聯(lián)激活，炎癥因子及趨化因子表達顯著上調(diào)，腎組織發(fā)生了明顯的炎癥反應。而益氣化瘀化痰方能下調(diào)上述各因子的表達，減輕UUO腎組織的炎癥反應。其機制可能與減少損傷細胞及免疫細胞釋放HMGB1，抑制NF-κB激活有關(guān)。IκB為NF-κB的抑制蛋白，無胞外信號刺激時，與NF-κB的P50/P65亞基結(jié)合形成三聚體非活性形式[21]。但本研究中IκB的表達與NF-κB一致，即模型組二者表達明顯上調(diào)，YHHD高劑量組表達明顯下調(diào)。因此我們推測NF-κB與IκB的表達存在對應關(guān)系，YHHD干預并不能直接影響IκB的表達。

KLF15最初在心肌肥厚、心肌纖維化中被研究得較多，它能減輕心肌間質(zhì)纖維化、抑制心肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)變[22]。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)在UUO和5/6 腎切除大鼠模型中，KLF 15表達均出現(xiàn)明顯下降，Klf15-/-小鼠也更容易出現(xiàn)心、腎纖維化[23-24]。以上研究均提示KLF15參與并調(diào)控纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本研究中模型組及各藥物干預組的KLF15 表達較假手術(shù)組顯著降低，與報道一致。藥物干預后，YHHD高劑量組的KLF15 表達則較模型組明顯上調(diào)。

細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分是構(gòu)成組織、器官結(jié)構(gòu)的基本框架，其在病理性修復中異常增多、過度沉積是纖維化的主要表現(xiàn)。ECM成分中的Col I為間質(zhì)性或纖維性膠原，含量較高；Col Ⅳ為非纖維性或無定型膠原，主要存在于基底膜及腎間質(zhì)[25]；FN可結(jié)合纖維素、膠原及細胞受體，在ECM 的產(chǎn)生、沉積中發(fā)揮重要作用[26]。本研究中模型組腎組織Col I、Col Ⅳ及FN較假手術(shù)組顯著上調(diào)，提示ECM 成分大量合成，與Masson染色顯示的纖維沉積相符。藥物干預后，各組Col I、Col Ⅳ及FN 表達均有不同程度下調(diào)，其中YHHD高劑量組下調(diào)最明顯，提示益氣化瘀化痰方能減少ECM 合成，減輕腎間質(zhì)纖維化。

隨著研究進展，人們逐漸認識到中藥在治療腫瘤、心血管病及器官纖維化等復雜疾病中的優(yōu)勢。RIF的發(fā)生發(fā)展不僅僅是單個靶點改變，常涉及多個靶點失衡、多條信號通路的交互作用[27]。近年來，針對多途徑、多靶點的復方藥物研究成為腎纖維化治療中的研究對象[6]。本研究證實所選用的益氣化瘀化痰方呈劑量依賴性地下調(diào)炎癥相關(guān)的HMGB1、NF-κB、MCP-1、IL-1β、TNF-α 表達，上調(diào)抗纖維化因子KLF15 的表達，從而減少ECM 成分Col I、Col Ⅳ及FN 的合成，減輕腎間質(zhì)纖維化、改善腎功能，且益氣化瘀化痰方高劑量組上述作用略優(yōu)于替米沙坦。其具體機制一方面可能是通過減少HMGB1的釋放以抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位；另一方面是通過上調(diào)KLF15表達以競爭抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。這2種方式均能減少NF-κB及其下游炎癥因子、趨化因子等炎性介質(zhì)的表達，抑制腎間質(zhì)炎癥反應，從而減輕腎間質(zhì)纖維化。

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