杜月光， 陳偉燕， 姜雪爾， 潘 晶， 柴可夫

(浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院， 浙江 杭州 310053)

糖尿病肝臟病變是近年來引起重視的糖尿病(diabetes mellitus，DM)主要并發(fā)癥，2型糖尿病的主要致病基礎為胰島素抵抗造成的糖脂代謝紊亂，作為糖脂代謝重要靶器官的肝臟主要表現(xiàn)為非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)病變，包括脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等。研究表明，沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)與糖脂代謝關系密切，參與體內脂肪酸和葡萄糖的合成、代謝和輸出，在糖尿病肝損傷發(fā)病過程中起著重要作用[1-2]。糖腎方(Tangshenfang，TS)是主要用于治療糖尿病腎病的經驗方，前期在臨床及實驗研究中發(fā)現(xiàn)該方具有降脂、抗氧化、抗炎和改善血流變等作用[3-4]，通過文獻查閱顯示該方中所含多種中藥有效成分對NAFLD有防治作用[5-7]，但其對糖尿病肝損傷是否具有減輕作用，機制如何尚不明確？為此，本研究采用高脂高糖飲食結合低劑量鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導建立2型糖尿病大鼠模型，觀察糖腎方對糖尿病肝損傷的作用及其對肝組織中SIRT1和PGC-1α表達的影響以探討其防治機制，為本方在臨床上防治糖尿病肝損傷提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實驗動物及飼料 雄性清潔級SD大鼠48只，體質量在160～200 g之間，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號為SCXX(滬)：2008-0016。高糖高脂飼料配方為10.0%白砂糖、10.0%熟豬油、0.5%膽固醇、10.0%蛋黃粉及69.5%基礎飼料，由浙江醫(yī)科院制作成型及烘焙而成。

1.2實驗藥品 糖腎方由黃芪18 g、葛根15 g、靈芝15 g、女貞子15 g、丹參9 g和大黃6 g等藥物組成，購自浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院門診部，由浙江省中醫(yī)院藥劑室煎制成分別含生藥 1×103g/L、2×103g/L和4×103g/L的濃縮液，4 ℃冰箱密封保存。

1.3主要實驗試劑及儀器 STZ購自Sigma；抗PGC-1α 抗體和抗SIRT1 抗體購自Abcam；抗β-actin抗體購自Santa Cruz；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)ELTSA檢測試劑盒購自上海森雄生物有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司。高速冷凍離心機(型號5541R)為Eppendorf產品；日立7020全自動生化分析儀(型號0500790S)為HITACHI產品。

2 方法

2.1動物模型的復制 清潔級雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，在文獻[8]的基礎上略作修改復制動物模型: 采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)1月后聯(lián)合1% STZ (30 mg/kg) 尾靜脈注射，注射72 h后檢測空腹血糖(fas-ting blood glucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)BG≥11.2 mmol/L為2型糖尿病大鼠模型構建成功。

2.2分組及給藥 將成模大鼠隨機分成DM模型(DM)組和糖腎方低劑量(low-dose TS, TSLow)、中劑量(medium-dose TS,TSMed)、高劑量(high-dose TS,TSHi)組，同時設對照(control)組，每組8只。糖腎方低、中、高劑量組分別以糖腎方濃縮劑6.5 g·kg-1·d-1、13 g·kg-1·d-1和26 g·kg-1·d-1灌胃。每日給藥1次，連續(xù)12周。

2.3標本的采集 給藥12周后，各組大鼠末次給藥后禁食不禁水24 h，稱量體重。采用戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，行腹主動脈采血，4 ℃、4 000 r/min，離心10 min，收集血清，用于檢測生化指標、炎癥因子和胰島素含量。處死大鼠，取肝組織，部分固定于10%甲醛緩沖液中，用于病理形態(tài)檢測；部分快速冷凍于液氮中，然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫糜谙嚓P指標檢測。

2.4血清生化指標、炎癥因子及胰島素含量的測定 應用全自動生化分析儀測定FBG、甘油三酯(triglyce-ride， TG)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)等生化指標；血清TNF-α和IL-1含量檢測采用ELISA法，空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)含量采用放射免疫法，其步驟嚴格按照試劑說明書進行；由公式FBG×FINS/22.5計算穩(wěn)態(tài)模型評估法胰島素抵抗指數(homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)。

2.5肝組織SOD活性和MDA含量的檢測 稱取肝臟組織10 g，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9比例加入0.9% NaCl溶液，冰水浴機械勻漿，勻漿液離心后取上清液，采用考馬斯亮藍法定量蛋白，分別采用羥胺法和TBA法檢測SOD活性和MDA含量，具體步驟和計算方法按照說明書進行。

2.6肝組織病理變化的觀察 肝臟組織常規(guī)固定脫水、透明、包埋、切片，分別行HE染色和Masson染色，光鏡下觀察肝臟病理形態(tài)學改變和纖維化程度。

2.7Western blot檢測SIRT1和PGC-1α的蛋白表達 取適量肝組織，提取總蛋白，用考馬斯亮藍法進行蛋白濃度測定。取60 μg總蛋白，加等量樣品處理液，100 ℃煮沸5 min，行SDS-PAGE，電泳完畢后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。將膜用含5%脫脂牛奶的TBST 封閉1 h后，分別加入Ⅰ抗(SIRT1稀釋度1∶5 000；PGC-1α稀釋度 1∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜，然后用Ⅱ抗(稀釋度1∶5 000)室溫孵育1 h，顯色，拍片晾干，掃描，采用BandScan 5.0軟件進行條帶的光密度分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行數據處理和統(tǒng)計分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間計量資料的比較采用單因素方差分析，對各組均數間兩兩比較采用Bonferroni 校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠血清生化指標及胰島素抵抗指數的比較

與對照組比較，DM模型組大鼠FBG、TG、FINS和HOMA-IR明顯升高(P<0.01)，肝功能指標ALT和AST升高(P<0.05)；與DM模型組比較，糖腎方高劑量組FBG水平下降明顯(P<0.05)，TS各劑量組TG、FINS、HOMA-IR、AST和ALT水平均明顯下降(P<0.05),見表1、2。

表1各組大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR水平的變化

Table 1. The serum levels of FBG, FINS and HOMA-IR in each group (Mean±SD.n=8)

GroupFBG(mmol/L)FINS(mU/L)HOMA?IRControl9．25±0．9844．47±4．9919．13±2．50DM27．83±0．06??70．95±6．81??98．94±9．14??TSLow26．84±0．8061．00±3．62##75．16±6．11##TSMed26．90±0．7061．37±3．34##72．61±3．95##TSHi25．20±0．20#53．23±6．08##57．74±7．57##

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group.

表2各組大鼠血清中TG、AST和ALT水平的變化

Table 2. The serum levels of TG、AST and ALT (Mean±SD.n=8)

GroupTG(mmol/L)AST(U/L)ALT(U/L)Control0．22±0．06127．5±22．044．8±4．2DM3．56±0．84??174．8±98．6?199．5±95．3?TSLow2．37±0．98#113．1±40．3#128．5±32．9#TSMed2．11±0．74##107．6±24．8#130．1±20．1#TSHi1．77±0．75##100．7±37．1#128．4±40．0#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group.

2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)改變

HE染色結果顯示，對照組大鼠肝小葉結構清晰，細胞呈多邊形，大小形態(tài)一致；DM模型組大鼠肝細胞脂肪變明顯，可見局灶性壞死及炎細胞浸潤。Masson 染色結果顯示，對照組肝組織內血管壁、竇周間隙可見少量膠原纖維；DM模型組可見竇周間隙以及門管區(qū)、小葉間纖維增生明顯。經糖腎方干預后，大部分肝細胞內脂滴明顯減少甚至消失，炎細胞浸潤明顯減少，膠原纖維均減少，其中糖腎方高劑量組減少最明顯，見圖1、2。

Figure 1. The pathological changes of hepatic tissues (HE staining,×400). The blue arrow indicates the adipose degeneration, and the green arrow indicates the infiltration of inflammatory cells.

圖1各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)的HE染色結果

Figure 2. The pathological changes of hepatic tissues (Masson staining,×400).

圖2各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)的Masson染色結果

3 各組大鼠肝臟組織SOD活性和MDA含量的比較

與對照組比較，DM模型組大鼠肝組織勻漿中SOD活性顯著降低，而MDA含量明顯升高(P<0.01)；與DM模型組比較，給藥12周后，糖腎方各治療組肝組織勻漿中SOD活性均有一定程度的升高，其中高劑量組升高最明顯(P<0.05)，而MDA含量均明顯降低(P<0.01)，見表3。

表3大鼠肝組織勻漿SOD活性和MDA含量的變化

Table 3. The changes of the activity of SOD and the content of MDA in the liver tissues (Mean±SD.n=8)

GroupSOD(U/mgprotein)MDA(nmoL/mgprotein)Control81．49±10．610．41±0．05DM51．10±3．13??1．28±0．22??TSLow61．64±5．880．47±0．02##TSMed61．24±3．120．45±0．12##TSHi65．70±5．62#0．44±0．08##

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group.

4 各組大鼠血清炎癥因子IL-1和TNF-α的變化

與對照組比較，DM模型組血清IL-1和TNF-α升高(P<0.05)。與DM模型組比較，糖腎方各治療組IL-1降低明顯(P<0.01)；TNF-α在糖腎方低、中劑量組降低明顯(P<0.05)，見圖3。

5 各組大鼠肝組織SIRT1和PGC-1α蛋白的表達

與對照組比較，DM模型組大鼠肝組織的SIRT1和PGC-1α蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與DM模型組相比，糖腎方各劑量組SIRT1和PGC-1α的蛋白表達均明顯升高(P<0.01)，見圖4。

Figure 3. The serum contents of IL-1 and TNF-α in each group. Mean±SD.n=6 .*P<0.05,**P<0.01 control group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group.

圖3各組大鼠血清炎癥因子IL-1和TNF-α的含量

討 論

近年來全球糖尿病發(fā)病率和致死率不斷升高，糖尿病性肝損傷已經成為糖尿病患者的主要并發(fā)癥和死亡原因之一。目前對糖尿病肝損傷的干預主要在降糖的基礎上，通過生活方式干預來降低體重，從而降低代謝性疾病的危險因素來實現(xiàn)的。

祖國醫(yī)學認為糖尿病并發(fā)癥的基本病機為瘀濁互阻，氣陰兩虛。消渴日久，治不得法，傷陰耗氣，痰瘀互結于肝絡可致糖尿病肝病[9]。根據辨證論治，中醫(yī)藥對2型糖尿病及其并發(fā)癥的防治具有獨特的優(yōu)勢和特色。糖腎方是柴可夫教授通過臨床實踐證實能有效治療糖尿病腎病的經驗方，方中以黃芪、葛根益氣生津為主，黃芪善益氣扶正、鼓邪外出，葛根性甘、辛涼，能解熱生津。靈芝味甘苦、性平，歸心、肺、肝、脾經，可養(yǎng)心安神、理氣化瘀、滋肝健脾；女貞子滋腎水、補肝陰、清虛熱；大黃酒治活血化瘀之力較強，與丹參合用推動血行，消除體內痰濁及瘀血停滯。諸藥配伍，藥性趨于平和，有共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡、化瘀祛痰之功。前期動物實驗研究結果顯示，TS對2型糖尿病大鼠模型具有較好的降糖、降脂、抗炎和改善血流變等功效，對糖尿病腎臟功能有保護作用[3-4]。根據“肝腎同源”中醫(yī)理論，推測糖腎方對糖尿病肝臟損傷也有一定的減輕作用。現(xiàn)代藥理學研究表明，糖腎方中所含多種中藥有效成分均具有降低糖尿病患者空腹血糖和餐后血糖，增加胰島素敏感性，調節(jié)肝臟脂質代謝，預防及治療糖尿病肝損傷的藥理作用[5-7]。為此，本研究觀察糖腎方對2型糖尿病大鼠的肝臟結構、功能的影響并探討其保護機制。

Figure 4. The protein expression of SIRT1 and PGC-1α in each group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDM group.

圖4各組大鼠肝組織SIRT1和PGC-1α蛋白的表達

糖尿病性肝損傷，表現(xiàn)為肝臟內彌漫的脂肪變性且伴有炎細胞浸潤及纖維組織增生，屬于非酒精性脂肪性肝病范疇，進一步可引起肝硬化和肝癌。本研究采用高脂高糖飲食結合低劑量STZ誘導建立2型糖尿病大鼠模型，結果顯示模型組大鼠血清AST和ALT明顯升高，并出現(xiàn)肝細胞明顯脂肪變、炎細胞浸潤、局灶性壞死、膠原纖維增生等形態(tài)學變化，提示存在NAFLD。而糖腎方各治療組大鼠血清AST和ALT含量明顯降低；肝細胞脂肪變性明顯改善，炎細胞浸潤和局灶性壞死明顯減少，膠原纖維減少，提示糖腎方對糖尿病大鼠肝功能有保護作用。

現(xiàn)代研究認為[10]，NAFLD的發(fā)病機制為二次打擊學說：“首次打擊”主要是胰島素抵抗引起脂質在肝臟蓄積，第二次打擊是氧化應激及脂質過氧化，不僅可以直接損傷肝細胞，誘導炎癥細胞浸潤，還能激活肝星形細胞促進膠原纖維合成，導致纖維化甚至肝硬化。本研究結果顯示，DM模型組血清FINS和胰島素抵抗指數升高，肝組織SOD活性降低、MDA升高，血清致炎因子TNF-α和IL-1水平升高，這表明糖尿病大鼠存在胰島素抵抗、炎癥反應以及肝臟氧化應激。糖腎方治療可降低空腹血糖和甘油三酯、FINS和HOMA-IR，明顯降低肝組織勻漿MDA含量，提高SOD活力，降低致炎因子IL-1和TNF-α的分泌，提示糖腎方能有效調節(jié)糖脂代謝紊亂，改善胰島素抵抗和抑制氧化應激以及炎癥反應從而起到保護肝臟作用。

SIRT1又稱“長壽基因”，是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白/非組蛋白去乙酰化酶，可使FOXO、PGC-1α、PPAR-γ和NF-κB等核轉錄因子去乙?；?，從而調節(jié)糖異生、糖酵解和脂肪β氧化，改善胰島素敏感性、線粒體損傷和炎癥等作用[11]。研究資料顯示限制熱量攝入可通過增加SIRT1的表達，改善胰島素抵抗進而減輕氧化應激達到治療NAFLD 的效果[12]。新近研究發(fā)現(xiàn)，肝內的SIRT1在脂肪代謝尤其脂肪酸氧化中是關鍵的調節(jié)因子，肝特異性SIRT1的減少，導致脂肪酸過氧化，進而引起炎癥反應和肝硬化[13]。另外研究顯示DM患者機體內SIRT1基因和蛋白表達降低，SIRT1的激動劑白藜蘆醇能上調SIRT1表達，在提高胰島素敏感性、降糖、促進脂質分解和修復線粒體損傷中發(fā)揮作用[14]。

PGC-1α是一種核轉錄共激活因子，能與許多不同的轉錄因子結合，在不同組織中發(fā)揮不同的功能。眾多研究表明[2]，在糖脂代謝過程中PGC-1α與胰島素抵抗、肌肉組織中葡萄糖攝取、肝糖原異生和脂肪酸代謝關系密切，并且通過影響線粒體呼吸的關鍵酶在能量代謝中起重要作用，而這些目前已經被公認是參與NAFLD的發(fā)生機制。研究發(fā)現(xiàn)[15]糖尿病患者PGC-1α基因表達是減少的，從而導致線粒體基因轉錄的減少，繼而引起氧化磷酸化減低，脂質氧化減少，肝臟脂質堆積，而導致脂肪肝的產生。

體內外實驗證明激活SIRT1 能改變PGC-1α的表達。糖尿病模型db/db小鼠口服SIRT1 抑制劑尼克酰胺后, PGC-1α乙?；@著增加, 而口服SIRT1 激活劑白藜蘆醇則能夠激活PGC-1α，并激活下游效應因子雌激素相關受體1α-甾醇調節(jié)元件結合蛋白1，降低游離脂肪酸以及三酰甘油含量[16]。Feige 等[17]報道SIRT1 對PGC-1α的激活可促進細胞對脂肪的氧化從而增加細胞能量消耗。

本研究結果提示糖腎方可能通過促進SIRT1和PGC-1α蛋白的表達，及SIRT1對PGC-1α的去乙?；{節(jié)，進而調節(jié)肝臟糖脂質代謝紊亂，改善胰島素抵抗、氧化應激和炎癥反應，而發(fā)揮對肝臟的保護作用。SIRT1和PGC-1α可能是糖腎方發(fā)揮藥理作用的重要靶點。

[參考文獻]

[1] Nassir F, Ibdah JA.Sirtuins and nonalcoholic fatty liver disease[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(46):10084-10092.

[2] 方詩蓉， 傅玉才， 周小輝. PGC-1α與非酒精性脂肪肝病關系的研究進展[J]. 國際消化病雜志, 2009, 29(6):390-392.

[3] 柴可夫， 吳喜喜， 杜月光， 等. 糖腎顆粒對糖尿病大鼠腎臟NF-κB和MCP-1表達的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2016, 31(8):3290-3293.

[4] 杜月光， 顧晶晶， 柴可夫. 糖腎方對糖尿病腎病大鼠血液流變學及內皮細胞功能的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(11):2079-2082

[5] 郭建利， 張睦清， 韓 雪， 等. 丹參不同組分防治大鼠非酒精性脂肪肝模型作用機制的研究[J]. 河北中醫(yī)藥學報, 2012, 27(1):8-9．

[6] 韓會民，王樹國. 葛根素治療非胰島素依賴型糖尿病患者胰島素抵抗的研究[ J].中國中西醫(yī)結合急救雜志, 2006, 3(13):117-119.

[7] 趙 巖， 徐 瑩， 查 琳， 等. 女貞子提取物降血糖及抗氧化活性的研究[J]. 藥物評價研究, 2016, 39(3):382-387.

[8] 李 霜， 王圓圓， 劉麗榮， 等. 黏著斑激酶在2型糖尿病大鼠腎組織中的表達變化及意義[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(8):1400-1405．

[9] 周 飛， 王 茜， 鄭春梅， 等. 益氣養(yǎng)陰活血化瘀法治療糖尿病肝病[J]. 四川中醫(yī), 2013, 31(2):45-46.

[10] Day CP. Non-alcoholic fatty liver disease: a massive problem[J]. Clic Med, 2011, 11(2):176-178.

[11] Finkel T, Deng CX, Mostoslavsky R. Recent progress in the biologyand physiology of sirtuins[J]. Nature, 2009, 460(7255):587-591.

[12] 陳璐璐， 鄧向群， 李凝旭. 熱卡限制對非酒精性脂肪肝病大鼠肝臟SIRT1表達的影響[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2007, 87( 20):1434-1437.

[13] Kim KE, Kim H, Heo RW, et al. Myeloid-specific SIRT1 deletion aggravates hepatic inflammation and steatosis in high-fat diet-fed mice[J]. Korean J Physiol Pharmacol, 2015, 19(5):451-460.

[14] Heeb?ll S, Thomsen KL, Pedersen SB, et al. Effects of resveratrol in experimental and clinical non-alcoholic fatty liver disease[J]. World J Hepatol, 2014, 6(4):188-198.

[15] Koo S H, Satoh H, Herzig S, et al. PGC-1 promotes insulin resistance in liver through PPAR-alpha-dependent induction of TRB-3[J]. Nat Med, 2004, 10(5):530-534.

[16] Kim MY, Lim JH, Youn HH, et al. Resveratrol prevents renal lipotoxicity and inhibits mesangial cell glucotoxicity in a manner dependent on the AMPK-SIRT1-PGC1α axis indb/dbmice [J]. Diabetologia, 2013, 56(1): 204-217.

[17] Feige JN, Lagouge M, Canto C, et al. Specific SIRT1 activation mimics low energy levels and protects against diet induced metabolic disorders by enhancing fat oxidation [J].Cell Metab, 2008, 8(5): 347-358.