龐克堅(jiān) 翟 欣 唐 輝* 羅 蘭 王亞喬

(1.和田維吾爾藥業(yè)股份有限公司，新疆 和田 848200； 2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

西紅花苷是名貴中藥西紅花的有效成分，具有抗血小板聚集，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善心肌缺血，調(diào)血脂等多種作用[1-7]，其中2個(gè)主要成分西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ亦是目前西紅花質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。

羅補(bǔ)甫克比日丸是新疆維吾爾族特色藥之一，主要由丁香、西紅花、花椒、胡蘿卜子、肉桂、韭菜子等30 味藥材組成，具有溫補(bǔ)腦腎、益心填精的功效，主要用于陽痿、抑郁、早泄、滑精、體虛、消瘦、神經(jīng)衰弱的治療，屬部頒標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊收錄品種[8]。部頒標(biāo)準(zhǔn)僅采用理化鑒別試驗(yàn)來控制該制劑的質(zhì)量，并未對貴細(xì)藥材西紅花進(jìn)行質(zhì)量控制。制劑中西紅花的質(zhì)量與藥品療效密切相關(guān)，應(yīng)予以關(guān)注。為進(jìn)一步完善羅補(bǔ)甫克比日丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)對羅補(bǔ)甫克比日丸的西紅花藥材和制劑中的西紅花苷含量進(jìn)行測定，對全面客觀地評價(jià)羅補(bǔ)甫克比日丸藥品質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters Acquity超高效液相色譜儀(包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測器、Empower 色譜工作站)，KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(BT125D，德國賽多利斯公司)。

1.2 試藥 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ(批號：111588-201303、111589-201304中國食品藥品檢定研究院)，西紅花藥材(201611)、羅補(bǔ)甫克比日丸(批號：20170204、20170301、20170302) 由和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；乙腈為色譜純；水為雙蒸餾水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ色譜條件 采用 Waters HSS-C18 (100mm×2.1mm，1.8μm) 色譜柱，流動相:以乙腈(A)-水溶液(B) 為流動相，梯度洗脫(0～5 min，20% →40% A；5～5.5min，40%→20%A，5.5～6min，20% →20% A)，流速0.2 mL/min，檢測波長：440nm，柱溫為35 ℃，對照品進(jìn)樣體積1μL，西紅花藥材及供試品進(jìn)樣體積5μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌愤m量，分別加50%乙醇溶解，制成濃度分別為 0.543 mg/mL、0.603 mg/mL的對照品溶液。各取對照品溶液適量，加50%乙醇定容至5 mL容量瓶，制得西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ混合對照品濃度分別為54.30 μg/mL、60.30 μg/mL的混合對照品溶液。避光保存在4℃下備用。

2.2.2 西紅花藥材溶液的配制 取西紅花藥材約0.5 g，精密稱定，加50%乙醇于25 mL容量瓶中，超聲(功率500 W，頻率50 kHz)30 min，放至室溫，用50%乙醇補(bǔ)足至刻度，過濾，濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 供試品溶液的配制 取羅補(bǔ)甫克比日丸1.5 g，精密稱定，加50%乙醇于25 mL容量瓶中，超聲(功率500 W，頻率50 kHz)30 min，放至室溫，用50%乙醇補(bǔ)足至刻度，過濾，濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、西紅花藥材溶液和供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度>1.5；理論板數(shù)以西紅花苷-Ⅰ峰計(jì)不少于5000，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ保留時(shí)間分別為 4.683、5.463 min 。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對照品在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別取0.3、0.6、1.2、2.4、4.8和7.5 μL進(jìn)樣測定。以峰面積 Y 為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X (μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果 (n=6)

2.5 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ精密度試驗(yàn) 取同一混合對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ峰面積的RSD分別為0.61%、0.54%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品羅補(bǔ)甫克比日丸供試品溶液6份，每份1.5 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，記錄各色譜峰面積，結(jié)果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ峰面積的RSD分別為1.6% 和0.99%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.7 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ穩(wěn)定性試驗(yàn) 將制備的羅補(bǔ)甫克比日丸供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h內(nèi)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ12 h內(nèi)的峰面積的RSD分別為1.5和1.3%。

2.8 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測知西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ2種成分準(zhǔn)確含量的羅補(bǔ)甫克比日丸9份，每份約0.5 g，精密稱定，再分別精密加入相當(dāng)于含量80%、100%、120%的西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌啡芤?，按?.2.3”項(xiàng)方法分別制備得到低、中、高不同濃度的供試溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率和RSD值，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ平均加樣回收率( n=9) 分別為99.90%和100.1%，RSD 分別為1.6%和1.3%。結(jié)果表明該方法的加樣回收率良好。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3 含量測定

3.1 西紅花藥材含量測定 取西紅花藥材平行3份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算羅補(bǔ)甫克比日丸中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的含量，結(jié)果見表3。

由結(jié)果表明，西紅花中西紅花苷的總量符合標(biāo)準(zhǔn)要求[9](>10%)。

表3 西紅花藥材含量測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果(mg/g n=3)

3.2 羅補(bǔ)甫克比日丸制劑含量測定 取3批樣品，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算羅補(bǔ)甫克比日丸中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的含量，結(jié)果見表4。

由結(jié)果表明，3份樣品西紅花苷含量相對較穩(wěn)定。

表4 樣品含量測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果(μg/丸 n=3)

4 討論

4.1 檢測波長的選擇 取西紅花苷對照品儲備液(0.543 mg/mL、0.603 mg/mL)適量，用50%乙醇溶解并稀釋成18.10 μg/mL、20.10 μg/mL溶液，用紫外可見分光光度計(jì)于 200～600nm 處進(jìn)行掃描，從其紫外圖譜中可見其在440nm 處有最大吸收，與有關(guān)參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道的440 nm 一致，故選擇440 nm 為檢測波長。

4.2 提取溶劑的選擇 分別比較甲醇、50% 甲醇、乙醇、50%乙醇的提取效率，結(jié)果顯示50%乙醇提取效率最高，因此最終選擇50%乙醇作為提取溶劑。

4.3 流動相的選擇 在選擇流動相時(shí)，我們首先參照2015版中國藥典的色譜條件，甲醇-水(45:55)為流動相，但此條件下西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ出峰峰形不理想，分離度較差。在綜合了有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10-14]的基礎(chǔ)上，經(jīng)過多次摸索，最終擬定了乙腈和水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，所得峰形良好，分離度高。

5 結(jié)論

通過測定西紅花藥材中西紅花苷的含量，表明，企業(yè)在制劑生產(chǎn)中的藥材質(zhì)量是有保證的。測定的羅補(bǔ)甫克比日丸中西紅花苷的含量也符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)所建立的超高效液相色譜分析方法與條件能較好地測定西紅花和羅補(bǔ)甫克比日丸中西紅花苷的含量。本實(shí)驗(yàn)方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且采用的超高效液相色譜法相較高效液相色譜方法靈敏度高、分析時(shí)間短。能夠?yàn)榻⒏涌茖W(xué)規(guī)范的羅補(bǔ)甫克比日丸質(zhì)量評價(jià)和控制方法提供參考。

[1]馬世平, 劉保林, 周素娣, 等. 西紅花總苷的藥理學(xué)研究Ⅱ?qū)ρ?、血小板聚集及血栓形成的影響[J]. 中草藥, 1999, 3(3): 196.

[2]THUSHARARM, HEMSHEKHAR M, SANTHOSH MS, et al. Crocin, a dietary additive protects platelets from oxidative stress-induced apoptosis and inhibits platelet aggregation[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 373(1-2): 77.

[3]何書英, 錢之玉. 西紅花苷對氧化性低密度脂蛋白致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]. 中國新藥雜志, 2005, 14(2): 169.

[4]緒廣林, 錢之玉. 西紅花苷對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用研究[J]. 中草藥, 2002, 33(5): 439.

[5]杜鵬, 錢之玉, 沈祥春, 等. 西紅花苷對大鼠心肌損傷的影響[J]. 中國新藥雜志, 2005, 14(12): 1423.

[6]錢之玉. 西紅花苷調(diào)血脂作用的實(shí)驗(yàn)和臨床研究[J]. 中國執(zhí)業(yè)藥師, 2009, 6(2): 6.

[7]緒廣林, 余書勤, 龔祝南, 等. 西紅花苷對大鼠實(shí)驗(yàn)性高脂血癥的影響及其機(jī)制研究[J].中國中藥雜志, 2005, 30(5): 369.

[8]中國藥典委員會. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(維吾爾藥分冊)[M]. 烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社, 1998: 155.

[9]國家藥典委員會.中國藥典一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:129-130.

[10]李順旭, 楊大堅(jiān), 李榮東, 等. 高效液相色譜梯度洗脫法測定不同中國產(chǎn)西紅花藥材中西紅花苷Ⅰ、Ⅱ的含量[J]. 中南藥學(xué),2010,(12): 886-889.

[11] 張留記, 劉欽松, 屠萬倩, 等. RP-HPLC法同時(shí)測定不同產(chǎn)地梔子中梔子苷、西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量[J]. 中國藥房, 2011, 3(07):630-632.

[12] 梁華正, 丁武輝, 袁東香, 等. 梔子中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的高效液相色譜法測定[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2012, 5(10): 2386-2388.

[13] 馬慧萍, 李蘭茹, 董志臣, 等. HPLC法測定紅花益氣養(yǎng)血膠囊中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 7(06): 512-514.

[14] 李木子,王京輝,蔡程科,等. 梔子飲片質(zhì)量分析研究[J]. 藥物分析雜志,2014,(06):1025-1032.