包滿節(jié) 阿古拉 斯其宮 劉 慧

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 2014級博士研究生，北京 100029；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)2015級研究生，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是眼科常見的一種臨床表現(xiàn)，是眼科臨床中失明、致盲性疾病的主要病理過程。視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的病理生理過程較復(fù)雜，目前為止，其發(fā)生機(jī)制尚未得到徹底闡明，研究表明RIRI是由多種因素有關(guān)，如氧自由基損害、基因調(diào)控、鈣超載、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸作用等等，最終結(jié)局為細(xì)胞凋亡。本研究采用急性高眼壓法建立RIRI模型，探討蒙藥珍寶丸對視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響，為防治視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷性疾病提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 珍寶丸(Ⅰ號)(內(nèi)藥制字M1401081)由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院國家蒙藥制劑中心提供；復(fù)方托吡卡胺滴眼液(H20110093，參天制藥(中國)有限公司)購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥房；鹽酸丙美卡因滴眼液(H20160133，S.A.ALCON-COUVREUR N.V.)，購于內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院藥房；原花青素(葡萄籽提取物)批號：002-1503012-27，天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；用0.9%生理鹽水稀釋配制成10%水合氯醛，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司提供。

TUNEL試劑盒：In situ cell death detection kit, POD，產(chǎn)品編號：11684817910，美國Roche公司；4%多聚甲醛液：由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院病理科提供；無水乙醇：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司提供；伊紅染液和蘇木素染液：北京素萊寶科技有限公司提供。

1.2 動物 SD大鼠(280±20g)12只，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司動物中心提供[實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK-(軍)2012-0004]，動物一般狀態(tài)良好，皮毛光滑，進(jìn)食與活動均正常，外眼及眼底檢查均正常。

1.3 儀器 包埋機(jī)：Leica EG1160 德國；切片機(jī)：H93/RM2126 德國；顯微鏡：尼康顯微鏡ECLIPSE LV100POL / 50IPOL 日本；圖像采集系統(tǒng) Image Pro-Plus 6.0。

2 方法

2.1 用藥方法 隨機(jī)選取SD大鼠(280±20g)，分正常組、模型組、蒙藥組(珍寶丸)、中藥組(原花青素)，共4組，每組保證3只以上大鼠。將珍寶丸用開水浸泡、搗碎做混懸液備用。蒙藥組(0.54g/kg)和中藥組(0.81g/kg)1次/d，連續(xù)灌胃7d后，末次給藥6h后開始造模，次日處死大鼠。

2.2 大鼠模型的制作 選取各組大鼠稱體重，用 10% 水合氯醛0．35m L /100g 腹腔內(nèi)注射麻醉、固定，雙眼進(jìn)行造模，滴托吡卡胺滴眼液散瞳10min后滴鹽酸丙美卡因滴眼液眼表面麻醉，將連有無菌0．9%氯化鈉溶液輸液瓶的小兒頭皮針刺入大鼠眼前房，輸液瓶緩慢升高至150cm高度時大鼠眼內(nèi)即形成110mmHg，造成視網(wǎng)膜缺血，1h 之后又緩慢降低輸液瓶高度，降低眼壓，虹膜及球結(jié)膜顏色迅速恢復(fù)正常，大鼠視網(wǎng)膜呈橘紅色，說明缺血再灌注損傷模型成功建立。

2.3 組織取材 再灌注24h后用10%水合氯醛深度麻醉大鼠致死后，迅速摘取雙側(cè)眼球，切除眼前節(jié)，放入4%多聚甲醛液中固定，沖洗后常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，平行于視神經(jīng)矢狀軸連續(xù)切片，厚度為4μm。進(jìn)行HE染色和TUNEL檢測并觀察視網(wǎng)膜病理學(xué)變化和細(xì)胞凋亡。

2.4 HE染色 石蠟切片脫蠟至水，蘇木素液染色6min，雙蒸餾水沖洗兩次，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗，梯度酒精脫水；伊紅染色，體積分?jǐn)?shù)95%酒精分色；無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.5 TUNEL檢測 使用美國Roche公司生產(chǎn)的TUNEL試劑盒進(jìn)行檢測細(xì)胞凋亡，顯微鏡下見細(xì)胞凋亡位于細(xì)胞核，呈黃色或棕褐色。每眼每張免疫組化切片于200倍視野拍3張區(qū)域不同視野照片，應(yīng)用Image pro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值為該眼陽性細(xì)胞數(shù)。凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%記為凋亡指數(shù)(apoptosis index ,AI)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPPS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，組間進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果以(±s)表示，不符合則采用多個獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗，用中位數(shù)(p25，p75)表示。

3 結(jié)果

3.1 HE染色結(jié)果 HE染色顯示正常組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，各層細(xì)胞排列緊密(ZC♀400倍)；模型組大鼠缺血再灌注損傷24h后視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，視網(wǎng)膜全層水腫，細(xì)胞排列明顯疏松、紊亂，細(xì)胞數(shù)量減少(MX♀400倍)；蒙藥組和中藥組，缺血再灌注損傷后24h，視網(wǎng)膜全層水腫，程度較模型組減輕，各層細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞排列疏松、紊亂、比模型組較規(guī)整，視網(wǎng)膜較厚(MZ♀400倍、ZY♀400倍)。結(jié)果如圖1

3.2 TUNEL染色 陽性細(xì)胞為黃色或棕褐色，分布于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。正常大鼠視網(wǎng)膜未見凋亡細(xì)胞(400倍); 模型組再灌注24h后，即可見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡明顯,與正常組相比，模型組凋亡細(xì)胞陽性率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P=0.004(400倍)；治療組再灌注24h后，與模型組相比，蒙藥組凋亡細(xì)胞陽性率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P=0.01(400倍)；與模型組相比，蒙藥組凋亡細(xì)胞陽性率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P=0.02(400倍)；治療組間無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表1和圖2。

表1 各組凋亡細(xì)胞陽性率比較 (P25,P75)

注：a：與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；b:與蒙藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

4 討論

細(xì)胞凋亡這一概念于1972年首次由英國病理學(xué)家Kerr[1]等提出，隨之國內(nèi)外越來越多的學(xué)者開始致力于細(xì)胞凋亡的深刻研究中。細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱為細(xì)胞程序性死亡，可引起形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，發(fā)生在細(xì)胞，可導(dǎo)致其死亡[2]。研究證實，細(xì)胞凋亡是視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要形式。本實驗運(yùn)用高眼壓模型引起視網(wǎng)膜缺血再灌注24h后，用TUNEL檢測方法檢測凋亡細(xì)胞，可以觀察到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞核呈黃色或棕褐色，表明神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞計數(shù)減少，證實神經(jīng)節(jié)細(xì)胞因凋亡而減少。故此，本實驗高眼壓引起視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型建立成功。

珍寶丸又名額爾敦-烏日勒，由珍珠、麝香、牛黃等29味天然藥物組合而成的其功能和療效猶如珍寶故此命名為珍寶丸。主治黑白脈病、薩病、痛風(fēng)、風(fēng)濕、麻風(fēng)病、黃水病、腎熱、腎脈震傷、陳熱擴(kuò)散于脈道筋脈抽搐、關(guān)節(jié)屈曲攣縮等癥[3]?，F(xiàn)代藥理實驗證實：本方具有擴(kuò)張毛細(xì)血管、改善微循環(huán)、降低血液黏度、改善血液流變性、抑制血小板凝聚、抗血栓、恢復(fù)神經(jīng)損傷、清除氧自由基等作用[3]。此外，研究表明珍寶丸對家兔和大鼠高眼壓引起視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[4-6]。

我們在大鼠RIRI模型中運(yùn)用病理切片和TUNEL檢測方法檢測了視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注24h后視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，視網(wǎng)膜變薄。細(xì)胞凋亡明顯，凋亡細(xì)胞為黃色或棕褐色，分布于細(xì)胞核。珍寶丸治療組的視網(wǎng)膜各層細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，排列整齊，細(xì)胞凋亡明顯降低與中藥組基本一致。因此，珍寶丸能夠抑制其細(xì)胞凋亡的發(fā)生，可以明顯減輕組織損傷，對視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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