李海禹，孟哲，王琛，師強偉

（鄭州大學第一附屬醫(yī)院心內科，河南 鄭州 450000）

動脈管壁內的長期慢性炎癥反應是促進粥樣硬化的疾病發(fā)展過程的重要致病因素之一[1]。Toll受體家族（TLRs）是一組病原分子模式識別受體，與內毒素（LPS）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）和熱休克蛋白等內源性及外源性致炎物質結合，通過激活核轉錄因子（NF）-κB等核內轉錄因子上調單核細胞趨化蛋白（MCP）-1和腫瘤壞死因子（TNF）-α等多種炎癥因子的表達，從而促進炎癥反應過程。Toll受體4（TLR4）是被廣泛關注的TLRs成員之一，在調節(jié)天然免疫和觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應方面具有舉足輕重的作用[2]。研究表明[3]：抑制TLR4的過度激活可能是冠心病藥物治療的靶點。同時，槲皮素具有抗炎、抗腫瘤及抗氧化等多種生物活性作用。本實驗旨在觀察：槲皮素對抑制ox-LDL誘導的血管平滑肌的炎癥反應的細胞學機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

DMEM高糖培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；胎牛血清及real-time RT-PCR試劑盒（北京TransGen公司）；ox-LDL購于廣東頤圓生物有限公司；槲皮素、青霉素、二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）、鏈霉素和噻唑藍（MTT）（美國sigma公司）；MCP-1和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（美國R&D systems公司）；兔抗大鼠TLR4、髓樣分化因子88（Myd88）、NF-κB（p65）、anti-TLR4及β-actin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

分離8～10周SD大鼠胸主動脈，仔細剝離血管內膜及外膜，剪碎至1～2 mm3大小組織塊，使用貼壁法培養(yǎng)。將細胞置于含12%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，其中含有100 U/mL濃度的青霉素和100 μg/mL濃度的鏈霉素，然后放入37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中。待細胞融合至80%～90%時，用于以下實驗。

1.3 實驗分組

將細胞分為5組：A組（對照組）、B組（ox-LDL干預組）、C組（ox-LDL＋槲皮素50 μmol/L）、D組（ox-LDL＋ 槲 皮 素100 μmol/L） 和 E組（ox-LDL＋ 槲 皮 素200 μmol/L）。B～D組中ox-LDL的濃度均為100 μg/mL。

1.4 方法

1.4.1 將細胞按4×104/孔的密度接種于96孔板，按照前述細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h備用，①應用MTT比色法測定不同濃度槲皮素的細胞毒性時，改用2%低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后， 給予不同濃度槲皮素和ox-LDL（100 μg/mL）濃度干預24 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h，棄去上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，微微振蕩數(shù)次后，在全自動酶標儀上于570 nm處測定各組吸光值。②應用ELISA測定上清液中TNF-α和IL-1β的分泌時，換用無血清培養(yǎng)基孵育12 h。不同濃度槲皮素或anti-TLR4抗體及PDTC預處理1 h，再使用ox-LDL（100 μg/mL）刺激不同時間后，收集各組細胞上清液。依據(jù)操作說明，使用ELISA試劑盒測定MCP-1和TNF-α的分泌。使用自動酶聯(lián)免疫吸附儀在450 nm處讀取數(shù)值，繪制MCP-1和TNF-α的標準曲線，并依據(jù)此計算各實驗組結果。

1.4.2 將各組細胞以5×105/孔的密度接種于6孔板中，加入含血清培養(yǎng)基，待細胞密度達到80%～90%融合時備用。①應用實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）測定TLR4和Myd88 mRNA表達時改用無血清培養(yǎng)基孵育12 h。換用不同濃度槲皮素預處理1 h，再給與100 μg/mL的ox-LDL刺激6 h，按照說明書使用Trizol（北京Transgen公司）提取各組總RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，分光光度計在260 nm處檢測RNA的純度。按照逆轉錄試劑盒（北京Transgen公司）操作步驟，將各組mRNA反轉錄為cDNA。使用Bio-Rad IQ5熒光PCR儀自帶分析軟件對real-time PCR結果進行分析。②應用Western-blot檢測TLR4、Myd88和NF-κB（p65）蛋白表達時，改用無血清培養(yǎng)基孵育12 h。換用含不同濃度槲皮素無血清培養(yǎng)基孵育 1 h后，加入 ox-LDL（100 μg/mL）刺激 24 h。每孔使用200 μL RIPA裂解液提取蛋白。核內NF-κB（p65）蛋白使用核蛋白提取試劑盒提取。BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣品蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液并煮沸后，制作10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠進行電泳，半干轉膜儀轉膜。一抗?jié)?度 為 ：TLR4（1 ∶ 200）、Myd88（1 ∶ 400）、NF-κB（p65）（1∶ 500）和 β-actin（1∶ 2000）。以 β-actin作為內參照?；瘜W發(fā)光法檢測，圖像采集，Quantity one軟件進行圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同濃度槲皮素細胞毒性測定

使用MTT法對不同濃度槲皮素干預的各組細胞進行測定后，在0～200 μmol/L濃度范圍內，槲皮素均未顯示明顯的細胞毒性；僅給予細胞100 μg/mL ox-LDL孵育24 h后，也未出現(xiàn)明顯細胞毒性。因此，在后續(xù)的試驗中，選取50，100，200 μmol/L 3個濃度進行干預處理。結果如圖1所示。

2.2 槲皮素對ox-LDL誘導的血管平滑肌細胞（VSMCs）MCP-1和TNF-α分泌的影響

ELISA結果顯示：在給予細胞100 μg/mL ox-LDL刺激不同時間后，MCP-1和TNF-α的分泌明顯上升，最高可達：1027.45 pg/mL和651.74 pg/mL。使用槲皮素預處理1 h后，可以有效減少MCP-1和TNF-α的分泌，最低可達：448.27 pg/mL和258.16 pg/mL，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，如圖2所示。

2.3 槲皮素對ox-LDL誘導的VSMCs TLR4-Myd88-NF-κB（p65）信號通路的影響

Western-blot結果顯示：使用100 μg/mL ox-LDL對VSMCs刺激24 h后，TLR4、Myd88和核內NF-κB（p65）的表達明顯升高。槲皮素對細胞進行預處理1 h后，明顯抑制ox-LDL誘導的TLR4和Myd88的高表達及NF-κB（p65）的核轉位，并具有濃度依賴性。在mRNA水平上，槲皮素顯著降低TLR4和Myd88基因的轉錄水平。提示：槲皮素能夠有效的抑制TLR4信號通路的激活。結果如圖3所示。

2.4 抑制劑對ox-LDL誘導的VSMCs MCP-1和TNF-α分泌的影響

為了進一步明確槲皮素對ox-LDL誘導的VSMCs炎癥抑制作用是否部分依賴于TLR4信號通路，先使用anti-TLR4抗體和NF-κB（p65）特異性抑制劑PDTC對細胞進行預處理1 h，再給予ox-LDL刺激6 h或24 h。ELISA結 果 提 示 ：anti-TLR4抗 體 和PDTC均能夠顯著抑制ox-LDL誘導的MCP-1和TNF-α高表達，起到了與槲皮素相似的作用。以上結果提示：TLR4-Myd88-NF-κB（p65）信號通路的激活可能參與了ox-LDL誘導的VSMCs炎癥反應過程。結果如圖4所示。

圖2 槲皮素抑制ox-LDL誘導的VSMCs MCP-1和TNF-α的分泌

圖3 槲皮素抑制ox-LDL誘導的VSMCs TLR4-Myd88-NF-κB (p65)信號通路的激活

圖4 抑制劑減少ox-LDL誘導的VSMCs MCP-1和TNF-α的分泌

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)病理性的炎癥反應通過加速泡沫細胞堆積、VSMCs凋亡及纖維帽降解等方式，不僅增加斑塊的形成速度，同時也使已存在的穩(wěn)定性斑塊向易損性斑塊轉變，極大地影響著疾病的轉歸[4]。氧化應激是斑塊內部炎癥反應的重要特征之一。在斑塊形成的初始階段，低密度脂蛋白（LDL）首先聚集于斑塊中央部位，隨后經過一系列復雜的氧化修飾過程最終成為氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）[5]。Ox-LDL通過刺激巨噬細胞、內皮細胞和VSMCs釋放多種炎癥因子和趨化因子，促進了斑塊的形成和失穩(wěn)[6]。因此，ox-LDL被認為是一個強有力的致炎因子。

當與內毒素（LPS）、ox-LDL和AngII等內源性及外源性配體結合后，TLR4通過自身活化，將細胞外信號經由Myd88傳導，進而引發(fā)NF-κB（p65）核轉位，誘發(fā)靶向炎癥因子轉錄水平升高[7]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)：ox-LDL能夠誘導VSMCs的炎癥因子過分泌，同時伴隨TLR4、Myd88表達升高及NF-κB（p65）核轉位增加，表明ox-LDL誘導的VSMCs炎癥反應可能依賴于TLR4介導的炎癥通路的激活。槲皮素能夠有效抑制ox-LDL誘導的VSMCs MCP-1和TNF-α過分泌，并具有濃度和時間依賴性，顯示出較強的抗炎作用[8]。同時，槲皮素可減少TLR4、Myd88的表達及NF-κB核轉位，抑制TLR4介導的炎癥通路的激活[9]。在使用anti-TLR4抗體及PDTC對TLR4和NF-κB進行特異性抑制后，也可以起到與槲皮素相似的抗炎作用。

以上結果提示：槲皮素可以有效地抑制ox-LDL誘導的VSMCs炎癥反應，其抗炎作用可能依賴于對TLR4介導的炎癥通路的調節(jié)。這為槲皮素用于粥樣硬化性疾病的治療提供了一定的分子學基礎。

參考文獻

[1] 徐斌.TOII樣受體4介導氧化型低密度脂蛋白致動脈粥樣硬化的機制研究[D].徐州醫(yī)學院,2010.

[2] 顏彩霞.低密度脂蛋白與動脈粥樣硬化相關性分析[J].當代醫(yī)學,2012,18(29):35-36.

[3] 王楊,關雪,俞曉晨,等.Toll樣受體4對氧化型低密度脂蛋白誘導巨噬細胞凋亡的影響及其機制研究[J].中華微生物學和免疫學雜志,2014,34(5):343-348.

[4] 徐斌,張延斌,許旭光,等.TLR4/MAPKs信號通路在ox-LDL誘導的血管平滑肌細胞分泌MCP-1中的作用[J].中國病理生理雜志,2010,26(5):848-852.

[5] 榮溪.槲皮素對OX-LDL誘導人臍靜脈血管平滑肌細胞MMP-2和MMP-9表達的影響[D].瀘州醫(yī)學院;西南醫(yī)科大學,2014.

[6] 許玲玲,周嘉輝,陳麗文,等.槲皮素對高糖誘導血管平滑肌細胞增殖的抑制作用[J].實用醫(yī)學雜志,2012,28(4):567-569.

[7] 張志琴,朱雙雪.槲皮素的藥理活性與臨床應用研究進展[J].藥學研究,2013,32(7):400-403.

[8] 閆淑霞,李鮮,孫崇德,等.槲皮素及其糖苷衍生物降糖降脂活性研究進展[J].中國中藥雜志,2015,40(23):4560-4567.

[9] 蔡謙謙,周紅,張貴婷,等.oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗體復合物促進臍靜脈內皮細胞遷移及炎癥因子表達[J].細胞與分子免疫學雜志,2017,33(7):865-869.