周相助 嚴(yán)逸男 劉明月 尚春雨 謝圣爽 吳章洪 華煒輝 林義章 鐘鳳林

摘 要 為明晰不同氮素形態(tài)對(duì)葉用萵苣生長(zhǎng)情況與總有機(jī)酸含量的影響，本研究對(duì)葉用萵苣總有機(jī)酸提取條件進(jìn)行優(yōu)化并獲得了最優(yōu)的提取條件，以研究不同氮素形態(tài)配比對(duì)葉用萵苣生長(zhǎng)情況及總有機(jī)酸積累的影響。結(jié)果表明，葉用萵苣總有機(jī)酸最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間45 min，提取溫度75 ℃，乙醇濃度75%，料液比1∶30，在此條件下提取得率最大，為0.18%。各因素對(duì)葉用萵苣總有機(jī)酸提取得率的影響程度為：料液比=乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間。不同氮素形態(tài)處理葉用萵苣生長(zhǎng)情況表明一定的銨硝配施更有利于葉用萵苣的生長(zhǎng)，其中以NO3-N∶NH4+-N=7∶3長(zhǎng)勢(shì)最好，全銨態(tài)氮生長(zhǎng)最差。不同氮素形態(tài)對(duì)總有機(jī)酸的影響結(jié)果為當(dāng)NO3-N∶NH4+-N=0∶10時(shí)，葉片和根系中分泌的總有機(jī)酸含量最高，NO3-N∶NH4+-N=0∶10時(shí)最低。本研究表明，一定濃度銨硝配施較全硝態(tài)氮或全銨態(tài)氮更有利于植物的生長(zhǎng)，銨態(tài)氮利于總有機(jī)酸的積累，但不利于植物生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞 葉用萵苣；總有機(jī)酸；氮素形態(tài)；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào) S31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To clarify the effect of different nitrogen forms on the growth of Lactuca sativa and the content of total organic acids， in this experiment， the conditions of extracting total organic acid from L. sativa L. were optimized and the optimum condition was obtained. The optimum conditions of extracting total organic acid in L. sativa L. were as follows： extraction time 45 min， extraction temperature 75 ℃， ethanol concentration 75%， and material liquid ratio 1∶30. Under the conditions， the extraction efficiency was 0.18%. The influence of each factor on the extraction rate of total organic acid was as follow： the material liquid ratio = ethanol concentration > extraction temperature > extraction time. The growth of L. sativa L. with different nitrogen morphological treatments showed that it was more conducive to the growth with certain ratio of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen. When NO3-N∶NH4+-N=7∶3， the growth was best； when the whole ammonium nitrogen was applied， the growth was worst. The effects of different nitrogen forms on total organic acids showed that when NO3-N∶NH4+-N=0∶10， the content of total organic acid secreted in the leaves and roots was the highest； when NO3-N∶NH4+-N=0∶10， the content was lowest. The results of the study showed that it was more beneficial to the growth of plant when certain ratio of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen was applied， rather than the whole ammonium nitrogen or the whole nitrate nitrogen. Ammonium nitrogen was beneficial to the accumulation of total organic acids， but it was not conducive to the growth of plant.

Keywords Lactuca sativa L.； total organic acid； nitrogen form； optimization

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.010

葉用萵苣（Lactuca sativa L.）屬菊科萵苣屬植物，以嫩梢、嫩葉為產(chǎn)品器官，俗稱油麥菜。其葉片富含維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素C和P元素，含有相當(dāng)豐富的鐵鹽、鈣鹽和磷鹽，有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。葉用萵苣具有復(fù)種指數(shù)高、清潔無(wú)污染、病蟲(chóng)害少等優(yōu)點(diǎn)，是水培綠葉蔬菜中生產(chǎn)面積較大的一類(lèi)蔬菜[2]。另外，葉用萵苣屬于喜氮植物，特別是硝態(tài)氮，為提高其生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量，生產(chǎn)上大都采用大量施用氮肥來(lái)提高產(chǎn)量，該法雖短期內(nèi)能提高農(nóng)作物產(chǎn)量，但長(zhǎng)期施用不僅達(dá)不到增產(chǎn)的目的，反而會(huì)降低氮肥利用率、造成肥料浪費(fèi)、威脅人體健康[3]。植物吸收的氮素形態(tài)主要是NO3-N、NH4+-N，氮素形態(tài)對(duì)蔬菜的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)等都有較大影響[4-6]。氮素形態(tài)影響作物的氮素代謝、光合機(jī)構(gòu)、礦質(zhì)元素的吸收等。另外，氮素通過(guò)影響植物體內(nèi)的氮代謝從而對(duì)植物的有機(jī)酸代謝進(jìn)行調(diào)控，而有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)、礦質(zhì)元素的吸收等有著重要的作用，這些生理代謝最終會(huì)影響到植物的生長(zhǎng)形態(tài)和生物量。目前，王晉等[7-9]已對(duì)不同銨硝配比下葉用萵苣的光合特性、氮同化途徑以及相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了一系列研究，結(jié)果均在NO3-N∶NH4+-N=7∶3時(shí)各方面表現(xiàn)良好，但關(guān)于其生長(zhǎng)情況以及對(duì)總有機(jī)酸影響未研究。綜上所述，本試驗(yàn)研究不同氮素形態(tài)配比對(duì)葉用萵苣總有機(jī)酸、生長(zhǎng)情況的影響，旨在找出滿足葉用萵苣生長(zhǎng)較佳的氮素形態(tài)配比，期望能在指導(dǎo)農(nóng)業(yè)施肥、提高作物氮利用率、降低生產(chǎn)成本和環(huán)境污染等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為葉用萵苣品種‘全年油麥菜，于福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施溫室中種植。采用水培培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液配備借鑒華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的葉菜類(lèi)B營(yíng)養(yǎng)液配方[10]，設(shè)置5個(gè)不同氮素形態(tài)配比處理，其N(xiāo)O3-N∶NH4+-N分別為10∶0（T1）、7∶3（T2）、5∶5（T3）、3∶7（T4）、0∶10（T5）。葉用萵苣幼苗長(zhǎng)至2片真葉，移植于各處理的栽培管道，用對(duì)應(yīng)銨硝配比的營(yíng)養(yǎng)液栽培。移植后緩苗4 d，然后開(kāi)始每4 d取樣1次，分別記為0、4、8、12、16 d，共5次，用液氮充分冷凍后置于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)情況的測(cè)定 葉用萵苣移植緩苗4 d后，開(kāi)始第1次取樣，每隔4 d取樣一次，分別記為0、4、8、12、16 d，共5次，進(jìn)行形態(tài)學(xué)拍照，分別取地上部和地下部樣品烘干，進(jìn)行根系和地上部干重的測(cè)定，采用葉綠素計(jì)（SPAD-502 Plus浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司）測(cè)定其相對(duì)葉綠素含量，均做3次重復(fù)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及總有機(jī)酸含量的測(cè)定 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考陳琦等[11]的方法，在最大吸收波長(zhǎng)730 nm下分別測(cè)定不同濃度的沒(méi)食子酸的吸光值。以沒(méi)食子酸的含量C對(duì)吸光度A進(jìn)行回歸，得出回歸方程為：A=1.784 4C+0.000 3和相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。按回歸方程計(jì)算總有機(jī)酸的含量，計(jì)算公式如下：

總有機(jī)酸提取得率（mg/g）

其中，C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的總有機(jī)酸含量（mg），VT為提取液總體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，m為葉用萵苣鮮重，VS為測(cè)定時(shí)樣品提取液體積（mL）。

1.2.3 提取工藝單因素及正交試驗(yàn) 葉用萵苣葉片凍樣研磨后分別對(duì)提取時(shí)間、溫度、料液比、乙醇濃度4個(gè)單因素進(jìn)行優(yōu)化，各因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用DPS（7.05）軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用LSD法進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮素形態(tài)配比對(duì)葉用萵苣生長(zhǎng)影響

不同氮素形態(tài)配比對(duì)葉用萵苣生長(zhǎng)影響不同，由圖1可知，T1處理葉片較狹長(zhǎng)，T2隨著處理天數(shù)的增加，葉片數(shù)增加較快且品型端正，T5處理植株在整個(gè)處理期間生長(zhǎng)較其它處理緩

慢。在尖葉萵苣生長(zhǎng)前期，隨著銨態(tài)氮含量的增加，植株越綠，但是在生長(zhǎng)16 d時(shí)，T4出現(xiàn)邊緣黃化現(xiàn)象，而T5處理在12 d時(shí)植株就表現(xiàn)出缺綠變黃癥狀，在處理16 d時(shí)更是表現(xiàn)脈間失綠且在葉片內(nèi)部出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，且根系顏色暗黃，中毒現(xiàn)象較為明顯。結(jié)果表明，一定的銨硝配比利于尖葉萵苣的形態(tài)構(gòu)成、植株生長(zhǎng)，全硝態(tài)氮會(huì)導(dǎo)致植株地上部地下部生長(zhǎng)不均衡，地上部生長(zhǎng)細(xì)長(zhǎng)，根系稀疏；高濃度的銨態(tài)氮以及全銨態(tài)氮會(huì)抑制葉用萵苣的生長(zhǎng)，在植株生長(zhǎng)后期表現(xiàn)出缺綠癥狀，且會(huì)導(dǎo)致植株表現(xiàn)出中毒現(xiàn)象。

由圖2可知，從T1～T5處理，根系長(zhǎng)度逐漸變短，其中T1處理根系表現(xiàn)出長(zhǎng)而稀，T2根系表現(xiàn)為密而較長(zhǎng)，T3、T4、T5根系長(zhǎng)勢(shì)不自然，表現(xiàn)出稀而短且有瘤狀突起、輕觸易碎。在處理16 d時(shí)，隨著銨態(tài)氮比例的增加，根系顏色逐漸變黃，其中T1根系長(zhǎng)而白，T2、T3表現(xiàn)出較長(zhǎng)且密，而T4、T5根系顏色較黃且長(zhǎng)勢(shì)不自然，有明顯中毒現(xiàn)象。結(jié)果表明，硝態(tài)氮利于根系的伸長(zhǎng)，一定的銨硝配比利于根系密度的增加，而高濃度的銨態(tài)氮不利于根系伸長(zhǎng)且在生長(zhǎng)后期亦表現(xiàn)出銨中毒現(xiàn)象，從而影響到植物對(duì)水分和礦質(zhì)元素的吸收，進(jìn)而抑制植株地上部分的生長(zhǎng)。

由圖3（A、B、C）可知，隨著銨態(tài)氮含量的增加，葉用萵苣地上部干重和根系干重均呈先上升后下降的趨勢(shì)，其重量依次為T(mén)2>T3>T1>T4>T5，表明T2、T3更利于葉用萵苣生物量的積累。根冠比T1、T3、T4呈先下降后上升的趨勢(shì)，T2呈逐漸上升最后不變趨勢(shì)，T5大致呈逐漸上升的趨勢(shì)，表明T1、T3、T4、T5在生長(zhǎng)后期地上部地下部生長(zhǎng)不均衡，T2處理地上部、地下部生長(zhǎng)較為穩(wěn)定。結(jié)果表明，一定的銨硝配比較單一供硝態(tài)氮或銨態(tài)氮更利于葉用萵苣生物量的積累、平衡地上部和地下部生長(zhǎng)。由圖3-D可知，T1葉綠素含量呈先上升后下降趨勢(shì)，且T1總?cè)~綠素含量始終低于其它加銨態(tài)氮的處理，T2、T3、T4處理葉綠素含量始終保持上升的趨勢(shì)，但在16 d時(shí)，T5葉綠素含量逐漸下降，這可能是因?yàn)樵谏L(zhǎng)后期，植株根系銨中毒，阻礙了水分和礦質(zhì)元素的吸收，從而影響到葉綠素的合成。結(jié)果表明，一定的銨硝配比更利于植物葉綠素含量的積累。

2.2 葉用萵苣總有機(jī)酸提取單因素試驗(yàn)

由圖4-A可知，隨著提取時(shí)間的增加，葉用萵苣總有機(jī)酸提取得率呈先上升后下降趨勢(shì)。提取得率在30 min達(dá)到最大值，為0.15 mg/g，其中30 min處理下的提取得率與45、60、75 min差異不顯著，但顯著高于15 min。結(jié)果表明，合理的提取時(shí)間有利于葉用萵苣總有機(jī)酸的浸出，提取時(shí)間過(guò)短或者過(guò)長(zhǎng)，反而會(huì)降低葉用萵苣總有機(jī)酸的提取得率。因此，提取時(shí)間為30 min最有利于葉用萵苣總有機(jī)酸含量的提取。由圖4-B可知，隨著提取溫度的遞增，提取得率在90 ℃達(dá)到最大值，為0.14 mg/g，100 ℃次之，為0.11 mg/g，45 ℃最低，為0.09 mg/g。結(jié)果表明，合理的提取溫度有利于葉用萵苣總有機(jī)酸的浸出，提取溫度過(guò)高或者過(guò)低，反而會(huì)降低葉用萵苣總有機(jī)酸的提取得率。因此，提取時(shí)間為90 ℃最有利于葉用萵苣總有機(jī)酸含量的提取。由圖4-C可知，隨著料液比的遞增，葉用萵苣總有機(jī)酸提取得率呈起伏變化的趨勢(shì)，提取得率在1∶20處達(dá)到較大值，為0.09 mg/g，1∶25處稍有下降，為0.08 mg/g，但在1∶30處達(dá)到最大值，為0.13 mg/g。其中1∶30處理下的提取得率與1∶10、1∶15、1∶20、1∶25差異均顯著，但是1∶20與1∶25差異不顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明，合理的料液比有利于葉用萵苣總有機(jī)酸的浸出，料液比過(guò)小會(huì)降低葉用萵苣總有機(jī)酸的提取得率?？紤]到最大提取得率的結(jié)果，料液比為1：30時(shí)最有利于葉用萵苣總有機(jī)酸含量的提取。由圖4-D可知，隨著乙醇濃度的遞增，葉用萵苣總有機(jī)酸提取得率呈持續(xù)上升的趨勢(shì)。提取得率在100%達(dá)到最大值，為0.16 mg/g；75%次之，為0.15 mg/g；純水最低，為0.047 mg/g；其中75%處理下的提取得率與100%差異不顯著，與0%、25%、50%差異均顯著。研究結(jié)果表明，合理的乙醇濃度有利于葉用萵苣總有機(jī)酸的浸出，乙醇濃度過(guò)低會(huì)降低葉用萵苣總有機(jī)酸的提取得率。從實(shí)際情況考慮，乙醇沸點(diǎn)較低易蒸騰揮發(fā)，并且乙醇濃度越高試驗(yàn)成本也會(huì)相應(yīng)增加，因此，乙醇濃度為75%時(shí)最有利于葉用萵苣總有機(jī)酸含量的提取。

2.3 葉用萵苣總有機(jī)酸提取正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，以提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、料液比4個(gè)因素作為參考指標(biāo)，采用4因素3水平的正交試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步分析，其正交試驗(yàn)因素水平如表2所示。

利用水提法進(jìn)行葉用萵苣總有機(jī)酸提取的正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，第四組即A2B1C2D3水平組合即提取時(shí)間45 min、提取溫度75 ℃、乙醇濃度75%、料液比1∶30提取得率最大，提取得率為0.18%。由極差R可知，各單因素對(duì)葉用萵苣總有機(jī)酸提取得率的影響程度為：料液比=乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間。本次正交試驗(yàn)是建立在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度以及料液比為4因素，再對(duì)各因素進(jìn)行3水平的操作進(jìn)而確定出9種組合。正交試驗(yàn)結(jié)果與4個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果存在不同，根據(jù)單因素結(jié)果可知提取條件分別為提取時(shí)間為30 min、提取溫度為90 ℃、乙醇濃度為75%、料液比為1∶30時(shí)提取得率最大。

2.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取0.5 g的葉用萵苣，按第2.3節(jié)提取方法進(jìn)行提取，精密加入沒(méi)食子酸對(duì)照品4 mg，重復(fù)6次按第1.2.2節(jié)進(jìn)行總有機(jī)酸含量的測(cè)定。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的回收率在96.000%～ 101.500%，RSD為1.96%，表明該方法對(duì)有效成分的影響符合要求（表4）。

2.5 不同氮素形態(tài)配比下葉用萵苣總有機(jī)酸含量

由圖5-A可知，不同氮素形態(tài)配比下葉用萵苣葉片不同時(shí)期總有機(jī)酸含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，且隨著NH4+-N含量的增加而增加，T1（NO3-N∶NH4+-N=10∶0）含量最低，T5（NO3-N∶NH4+-N=0∶10）含量最高，T3、T4、T5處理差異不顯著，與T1、T2存在顯著性差異；

由圖5-B可知，不同氮素形態(tài)配比下葉用萵苣根系不同時(shí)期總有機(jī)酸含量變化趨勢(shì)與地上部大致相似，均為T(mén)1處理含量最低，T5最高。結(jié)果表明NH4+更有利于葉用萵苣葉片和根系總有機(jī)酸的分泌。另外，總有機(jī)酸含量總是葉片高于根系，表明總有機(jī)酸的合成部位可能主要集中在葉片中。

3 討論

NO3-N、NH4+-N是植物生長(zhǎng)發(fā)育可利用的兩種主要氮素形態(tài)，它們對(duì)植物的生長(zhǎng)有著不同的生理代謝[12]。Fan等[13]和Tang等[14]研究表明，NO3-N、NH4+-N、酰胺態(tài)氮及銨硝配施可在一定程度上促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)根長(zhǎng)、增加莖分蘗數(shù)以及促進(jìn)干物質(zhì)的積累。越來(lái)越多的研究表明，供應(yīng)混合的氮源比供應(yīng)單一NH4+-N或NO3-N更有利于植物的生長(zhǎng)，單供NH4+-N植物多表現(xiàn)為葉面積較小、葉比重較大、根冠比變小、根系變短、側(cè)根減小、顏色加深，且較高濃度的NH4+-N會(huì)產(chǎn)生銨鹽毒害現(xiàn)象，表現(xiàn)為葉片邊緣壞死、葉片枯黃褪綠[15]。Zhang等[16]的研究表明，NO3-N會(huì)增加側(cè)根的長(zhǎng)度及數(shù)量，而Celisarámburo等[17]的研究卻認(rèn)為NO3-N會(huì)抑制主根的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，NO3-N利于根系的伸長(zhǎng)，一定的銨硝配比有利于根系密度的增加以及總?cè)~綠素的積累，而高濃度的NH4+-N不利于根系伸長(zhǎng)，在生長(zhǎng)后期表現(xiàn)出銨中毒現(xiàn)象，植株矮小且葉片出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)，與Zhang等[16]的結(jié)果較一致，而與Celisarámburo等[17]的結(jié)果相反，可能與所研究的植物種類(lèi)或研究條件不同有關(guān)。

本研究中，水提法提取葉用萵苣總有機(jī)酸的最佳工藝條件為：提取時(shí)間45 min、溫度75 ℃、乙醇濃度75%、料液比1∶30時(shí)提取得率最大，為0.18%。各單因素對(duì)葉用萵苣總有機(jī)酸提取得率的影響程度為：料液比=乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間。目前，總有機(jī)酸含量的測(cè)定方法大都采用電位滴定法[18]、HPLC法[19]，也有極少研究采用紫外分光光度法[20]。本研究?jī)?yōu)化的葉用萵苣總有機(jī)酸的最佳提取工藝具有用時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、提取效率較高等優(yōu)點(diǎn)，采用該優(yōu)化條件提取不同氮素形態(tài)中葉用萵苣總有機(jī)酸，結(jié)果表明，NO3-N∶NH4+-N=0∶10時(shí)葉片和根系分泌的總有機(jī)酸含量最高，NO3-N∶NH4+-N=10∶0時(shí)最低。綜上結(jié)果表明，NH4+-N利于總有機(jī)酸的分泌，但不利于植物的生長(zhǎng)；而關(guān)于氮素是否通過(guò)影響植物體內(nèi)的氮代謝從而對(duì)植物的有機(jī)酸代謝進(jìn)行調(diào)控，李燦雯等[21]和王樹(shù)起等[22]研究均認(rèn)為是氮素影響了總有機(jī)酸的積累，從而影響到植物對(duì)K+、Ca2+的吸收，最終抑制植物的生長(zhǎng)。然而，科學(xué)施用氮肥，受氮肥種類(lèi)、配比及栽培方式等方面的影響，本研究仍需開(kāi)展氮肥對(duì)作物礦質(zhì)元素的吸收、氮代謝與有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)的相關(guān)性、反施有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)并觀察其對(duì)作物生長(zhǎng)的直接作用等方面的研究。

綜上研究表明，NO3-N有利于根系的伸長(zhǎng)，一定的銨硝配比（NO3-N∶NH4+-N=7∶3）有利于根系密度的增加，而高濃度的NH4+-N不利于根系伸長(zhǎng)。根據(jù)本課題組以往對(duì)不同銨硝配比下尖葉萵苣的光合特性、氮同化途徑以及相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)的研究結(jié)果表明，在NO3-N∶NH4+-N=7∶3時(shí)各方面表現(xiàn)良好，結(jié)合本研究對(duì)其生長(zhǎng)情況的研究結(jié)果，推薦NO3-N∶NH4+-N=7∶3作為葉用萵苣生長(zhǎng)的最佳氮素配比。

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