吳坤鑫 武亞丹 張春微 劉志昕 王健華 余乃通 張秀春

摘 要 CRSPR/Cas9系統(tǒng)可對植物的內源基因進行有效定點編輯，為獲得基因缺失突變體提供了新的方向。本研究在雙鏈結合蛋白（dsRNA-binding protein，DRB）DRB3和DRB5兩個基因外顯子的保守序列設計2個靶點，并構建與tRNA串聯(lián)的雙靶點CRISPR/Cas9 表達載體。通過一次轉化，獲得了DRB3或DRB5單獨被編輯或同時被編輯的擬南芥突變體dcl2drb4轉基因T1代植株，為研究DRB3、DRB5是否參與DCL4介導的抗病毒RNA沉默通路奠定基礎。

關鍵詞 CRISPR/Cas9；基因編輯；擬南芥；雙鏈結合蛋白

中圖分類號 S436.67 文獻標識碼 A

Abstract The CRSPR/Cas9 system can directly edit endogenous genomic loci in plant， and provide a new opportunity to obtain knockout mutants. In this study， two guide RNAs were designed based on the conserve sequence of the exon between DRB3 and DRB5 gene in Arabidopsis thaliana. To achieve efficient editing capability of the CRISPR/ Cas9 system we developed a construct with double small guide RNA （gRNA） which tandemly arrayed with tRNA. The sequencing results showed the DRB3 or DRB5 gene in Arabidopsis dcl2drb4 double mutant was successfully edited individuallly or altogether in T1 generation. The result would pave the way on research whether the DRB3 or DRB5 gene involved in DCL4-initiated antiviral RNA silencing pathway which is independent of DRB4 protein.

Keywords CRISPR/Cas9； gene editing； Arabidopsis thaliana； dsRNA-binding protein

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.016

RNA沉默是真核生物中普遍存在的RNA誘導調節(jié)機制，在植物中不僅能調控其生長發(fā)育、對生物和非生物脅迫做出響應，在植物抵抗病毒的入侵方面同樣起著非常重要的作用[1]。雙鏈RNA或部分雙鏈的發(fā)夾結構被雙鏈RNA專一的核酸內切酶——Dicer或Dicer-like（簡稱DCL）剪切產生長度為20 nt左右的siRNA（small interference RNA），siRNA隨后與 Argonaute（AGO）蛋白結合形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），并指導AGO蛋白專一地識別降解與小RNA序列匹配的靶RNA，或者抑制靶RNA的翻譯， 或者介導基因組DNA或組蛋白的甲基化修飾，在轉錄水平、轉錄后水平或翻譯水平抑制靶標基因表達[1]。植物在進化過程中已形成由不同蛋白參與、功能不同但又相互重疊的多條RNA沉默途徑[2-3]。

DCL2和DCL4是抗RNA病毒沉默中的主要剪切蛋白，分別產生22 nt vsiRNA和21 nt vsiRNA。不過這2個Dicer發(fā)揮作用是有優(yōu)先級別的，DCL4在識別切割病毒dsRNA時優(yōu)先發(fā)揮作用，但是當DCL4被突變或者功能被抑制時，DCL2就會發(fā)揮主要作用產生vsiRNA[4-5]。研究發(fā)現，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中由DCL4介導的抗病毒RNA沉默至少有2條通路：一條需要DRB4的參與[6-8]，另一條不需要DRB4蛋白的參與[9]。越來越多的研究表明，植物抗病毒RNA沉默途徑中至少需要一個DRB蛋白的參與[10-11]。擬南芥基因組編碼7個DRBs——DRB1/HYL1、DRB2、DRB3、DRB4、DRB5、DRB7.1和DRB7.2，這些蛋白的N端都含有dsRNA-binding motifs（dsRBM）[12]。為單獨敲除或同時敲除的擬南芥dcl2drb4雙突變體中的DRB3或DRB5蛋白，以研究在沒有DRB4的情況下，DRB3或DRB5是否參與DCL4介導的抗病毒沉默通路，本研究在DRB3和DRB5兩個基因外顯子的保守序列設計兩個靶點，并構建與tRNA串聯(lián)的雙靶點CRISPR/Cas9表達載體，用于轉化擬南芥dcl2drb4雙突變體，通過一次轉化獲得了DRB3或DRB5單獨被編輯或同時被編輯的擬南芥突變體dcl2drb4 T1代轉基因植株。通過T2代后代分離，將獲得DRB3或DRB5基因功能單獨缺失或同時缺失的純合三突變體drb3dcl2drb4、drb5dcl2drb4、drb3/5dcl2drb4，為研究DRB3或DRB5是否參與DCL4介導的抗病毒RNA沉默通路奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株 CRISPR/Cas9載體pHSE401購自addgene（http：//www.addgene.org）[13]，片段合成、實驗所用引物（表1）和測序分析由華大基因科技有限公司完成。大腸桿菌 DH5α菌株和農桿菌GV3101由本實驗室保存。

1.1.2 植物材料 轉基因受體材料擬南芥雙突變體dcl2drb4[9]由美國俄亥俄州立大學瞿峰教授惠贈。置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為22～24 ℃，14 h光照。

1.1.3 酶與試劑 T4 DNA連接酶、TransTaq DNA Polymorase High Fidelity購自北京全式金生物技術有限公司，限制性內切酶BsaI、SmaI購自New England Biolabs，質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、2X Taq PCR Mastermix購自天根生化科技（北京）有限公司，其他試劑為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 靶位點設計從網站NCBI（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）上獲得擬南芥DRB3（GenBank登錄號NM_113606.4）和DRB5（GenBank登錄號NM_ 123472.2）基因序列。為獲得DRB3和DRB5同時被編輯的轉基因擬南芥，在兩個基因外顯子的保守序列尋找Cas9潛在靶向位點，根據靶位點的位置及GC含量，篩選DRB3基因序列124、262 bp處CCA和CCT后20 bp的反向互補序列作為2個靶向序列，分別命名為Target1、Target2（具體序列如圖1所示）。將該段序列在NCBI數據庫中進行比對，以排除非特異性靶位點。

1.2.2 雙靶點pHSE-DRB3/5載體的構建 為提高編輯效率，本研究構建了與tRNA串聯(lián)的雙靶點CRISPR/Cas9表達載體。首先人工合成含2個同時靶標DRB3和DRB5的靶位點的tRNA-gRNA表達盒，并在兩側添加BsaI酶切位點（圖1）。其次，片段合成后與克隆載體p18T連接，測序鑒定正確后使用限制性內切酶BsaI單酶切CRISPR/ Cas9載體pHSE401[13]及含人工合成tRNA-gRNA表達盒的質粒，分別回收大小片段。第三，回收片段經T4 DNA連接酶連接后用熱激法轉化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞，PCR檢測陽性菌落進一步用限制性內切酶SmaI酶切驗證及測序驗證。含雙靶點的CRSPR/Cas9雙元載體大小約為16.5 kb，如圖2所示。該載體設置左右邊界，從右邊界往左邊界依次排列由U6-26P 啟動子驅動的含2個DRB3/5靶位點的tRNA-gRNA表達盒、U6-26t終止子、35S啟動子驅動的zCas9基因、35S啟動子驅動的Hyg基因。

1.2.3 擬南芥的轉化及篩選 CRISPR/Cas9表達載體轉化農桿菌GV3101，經鑒定正確后采用花粉管通道法[14]轉化擬南芥雙突變體dcl2drb4。收集轉化后的擬南芥T1代種子，曬干、75%酒精表面消毒后，均勻撒在含潮霉素25 mg/L的MS培養(yǎng)基中進行抗性篩選。培養(yǎng)條件為22～24℃，16 h光照。

1.2.4 轉基因擬南芥突變體檢測 鑒定轉基因擬南芥：采用葉盤法快速提取植物基因組DNA，采用PCR擴增潮霉素磷酸轉移酶基因進行轉基因陽性植株鑒定。具體如下：①用1.5 mL離心管蓋取1管蓋大小的葉盤，加0.05 mol/L NaOH溶液180 μL；②95 ℃煮10 min，離心30 s后加入1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液20 μL，混勻后即可用作PCR模板。PCR體系：2×Taq PCR Mastermix 10 μL，Hyg-F/Hyg-R各0.5μL，DNA 模板4 μL，超純水補足至20 μL。PCR條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

靶位點突變效果檢測：在2個靶序列上下游200 bp左右分別設計1對正向引物和反向引物（drb3-LP/ drb3-RP、DRB5-134F/DRB5-609R），用于擴增包含靶序列在內的目的片段（引物具體信息如表1所示）。用上述方法提取的植物基因組DNA為模板，用相應的特異性引物PCR擴增目的片段，擴增條件同上。將PCR產物進行直接測序分析。在靶位點附近出現套峰的樣品進行TA克隆，隨機選取3～5個單克隆測序，最終通過序列比對確定突變基因型。

2 結果與分析

2.1 CRSPR/Cas9基因編輯載體構建

DRB3和DRB5均包括3個外顯子，為獲得DRB3和DRB5同時被編輯的轉基因擬南芥，在兩個基因外顯子的保守序列篩選設計的2個靶位點，具體序列見圖2。Target1分別位于DRB3和DRB5 CDS序列的124 bp和138 bp處，Target2分別位于DRB3和DRB5 CDS序列的262 bp和216 bp處。

人工合成包括2個靶位點的tRNA-gRNA表達盒，序列如圖1所示。經測序驗證正確后通過T4 DNA連接酶組裝至pHSE401載體中。首先用引物U6-26p-F和U6-26t-R進行菌落PCR檢測，擴增出大于500 bp且小于750 bp的預期片段，結果如圖3A（泳道2）所示，說明pHSE401載體已組裝有目的片段。PCR陽性單克隆擴大培養(yǎng)提取質粒，進一步用限制性內切酶SmaI酶切驗證，切出大于3 000 bp且小于5 000 bp的目的片段（圖3B泳道2），表明含2個靶位點的tRNA-gRNA表達盒正確地組裝到了pHSE401載體上。引物U6-26p-F和U6-26t-R雙向測序結果表明，插入片段與設計的序列匹配一致（圖2），說明DRB3基因雙靶點的CRSPR/Cas9雙元載體pHSE401- DRB3/5構建成功，適合用于后續(xù)的由農桿菌介導的擬南芥遺傳轉化中，為獲得DRB3和DRB5同時被編輯的轉基因擬南芥奠定基礎。

2.2 轉基因陽性植株的獲得

用帶有表達載體pHSE401-Hyl1的農桿菌GV3101轉化擬南芥雙突變體dcl2drb4，T1代抗性苗首先用HYG-F/HYG-R（表 1）鑒定是否成功整合T-DNA區(qū)。結果表明，所檢測的38株抗性苗均為轉基因陽性植株。部分結果如圖4所示。

2.3 含tRNA的CRSPR/Cas9載體能有效編輯擬南芥基因組

為了驗證構建的CRSPR/Cas9基因編輯載體能否有效對預設靶位點進行編輯，分別用drb3- LP/drb3-RP、DRB5-134F/DRB5-609R擴增轉基因T1代植株的DRB3和DRB5基因靶序列兩側序列并進行測序分析。測序結果顯示，38株抗性苗中有29株在靶位點附近出現套峰，說明可能發(fā)生了基因編輯。其中，有8株僅DRB3擴增產物出現套峰，7株僅DRB5擴增產物出現套峰，14株DRB3和DRB5擴增產物同時出現套峰。隨機選取僅DRB3擴增產物出現套峰的第5號、第18號植株，僅DRB5擴增產物出現套峰的第2號、第13號植株以及DRB3和DRB5擴增產物同時出現套峰的第6號植株，將PCR擴增產物進行TA克隆，每個產物隨機選取3～6個單克隆測序分析。測序結果表明，6株樣品均發(fā)生了突變，具體如圖5所示。第5號植株的DRB3的2個靶位點均發(fā)生突變，其余植株不論是DRB3還是DRB5均只在靶位點2附近發(fā)生突變。

3 討論

CRSPR/Cas9是一種高效且簡便的基因定點編輯技術。用RNA替代組裝蛋白，實現與靶基因的特異性識別與結合[15]，使得該技術具有合成簡單、周期短、操作靈活、效率高等優(yōu)點，給基因工程帶來技術性的革命，在眾多植物基因編輯中已經得到了成功應用，如擬南芥[13]、甜橙[16]、水稻[17]、玉米[18]、小麥[19]、大豆[20]等。Xie等[17]報道植物內源性的tRNA加工系統(tǒng)在體內能將人工合成的串聯(lián)tRNA-gRNA高效、精確地加工成含靶點序列的gRNA并指導Cas9蛋白多重編輯染色體靶點，利用該技術編輯水稻基因的效率能高達100%。本研究利用人工合成的串聯(lián)tRNA- gRNA表達盒，構建同時靶向擬南芥DRB3和DRB5基因的雙靶點CRISPR/Cas9表達載體，轉化擬南芥dcl2drb4雙突變體。38株T1代轉基因植株PCR產物測序分析發(fā)現，有29株植株DRB3或DRB5 PCR產物測序出現套峰或DRB3和DRB5 PCR產物測序同時出現套峰。對其中5株進行PCR產物單克隆測序，發(fā)現這些出現套峰的植株DRB3或DRB5基因已被編輯或兩者均被編輯，并且產生多種突變方式，與Xie等[17]報道一致。由于T1靶基因的突變可以遺傳給T2，到了T2目標性狀會出現分離現象[21-22]，因此通過T2代后代分離將獲得DRB3或DRB5基因功能單獨缺失或同時缺失的純合三突變體drb3dcl2drb4、drb5dcl2-drb4、drb3/5dcl2drb4。從而利用CRISPR/Cas9技術在基因家族中保守序列設計靶位點，只需通過一次轉化就可能獲得基因家族中單個或兩個以上基因同時被編輯的轉基因植株，提高了獲得基因缺失突變體的效率。

雙鏈RNA結合蛋白（dsRNA-binding proteins， DRB）是 RNA沉默信號途徑中的關鍵蛋白：DRB與DCL相互作用能促進siRNA的產生或輔助siRNA進入AGO蛋白形成RISC [2-3]。HYL1參與DCL1介導的miRNA產生通路[23-24]，在植物miRNA形成過程中，DCL1與HYL1相互作用對pri-miRNA的有效及精確加工發(fā)揮重要作用[25]。DRB2在植物頂端分生組織調節(jié)miRNA的生成或穩(wěn)定性方面起重要作用，而DRB3和DRB5可能在miRNA生成的下游步驟輔助DRB2的作用[26-27]。擬南芥drb4突變體感染TCV弱毒株后，病毒復制量明顯增加，說明DRB4參與DCL4介導的抗病毒RNA沉默，但是vsiRNA減少并不明顯[28-29]。利用模式植物擬南芥以及沉默抑制子功能減弱的病毒突變體為研究材料，發(fā)現在缺少DRB4的情況下，dcl2drb4雙突變體感染CPB-CC-PDS仍能產生21-nt vsiRNAs，發(fā)生白化現象，說明DCL4產生的部分21-nt vsiRNAs是不需要DRB4參與的。由于研究表明抗病毒RNA沉默途徑中至少需要一個DRB蛋白的參與[2-3]，因此沒有DRB4的時候可能是其他雙鏈結合蛋白彌補了DRB4的功能[9]。本研究利用CRISPR/Cas9技術在在DRB3和DRB5兩個基因外顯子的保守序列中設計2個靶向位點，構建同時靶向擬南芥DRB3和DRB5基因的雙靶點CRISPR/Cas9表達載體，通過一次轉化獲得了DRB3或DRB5單獨被編輯或同時被編輯的擬南芥突變體dcl2drb4。通過T2代后代分離，將獲得DRB3或DRB5基因功能單獨缺失或同時缺失的純合突變體，為研究DRB3或DRB5是否參與DCL4介導的抗病毒RNA沉默通路奠定了基礎。

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