卞曉翠，楊振麗，左春霞，周芳穎，劉玉琴*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 1.病理學(xué)系；2.細(xì)胞資源中心， 北京 100005)

在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，細(xì)胞系是進(jìn)行分子水平、細(xì)胞水平及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究重要實(shí)驗(yàn)材料。細(xì)胞系的交叉污染無疑會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可重復(fù)，甚至導(dǎo)致結(jié)論的錯(cuò)誤。2010年公布了360種被交叉污染或錯(cuò)誤認(rèn)定的人源細(xì)胞系，種間交叉污染占9%(33/360)[1]。細(xì)胞種屬鑒定是排除種間交叉污染的重要內(nèi)容，常見的檢測(cè)方法有染色體分析、同工酶分析、DNA條碼(DNA barcode)測(cè)序以及PCR法。早在2009年，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心(簡稱北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)針對(duì)常見的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，創(chuàng)建了PCR檢測(cè)細(xì)胞來源種屬的方法[2]。該方法操作簡單， 結(jié)果穩(wěn)定， 自創(chuàng)建來已經(jīng)累計(jì)檢測(cè)細(xì)胞系1 000余株次。同時(shí)，本單位作為國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)的依托單位，也將該方法推廣到其他細(xì)胞資源保藏中心，包括武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心和中國食品藥品檢定研究院等單位，還為生物醫(yī)藥企業(yè)的細(xì)胞質(zhì)控提供了服務(wù)。對(duì)于人源細(xì)胞交叉污染的情況，本中心已有報(bào)道，本文主要研究非人源細(xì)胞的情況。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

為160例非人源細(xì)胞，均由本中心于2008—2016年收集，中心入庫質(zhì)控或其他單位和實(shí)驗(yàn)室委托質(zhì)控的樣品。部分細(xì)胞目錄見表1。所有細(xì)胞在培養(yǎng)和傳代過程中收集細(xì)胞團(tuán)，-20 ℃保藏。

1.2 基因組DNA的提取

細(xì)胞基因組DNA的提取按照試劑盒(PureLink?Genomic DNA Mini Kit, K1820- 02, Invitrogen公司)說明書進(jìn)行，通過Nanodrop2000檢測(cè)提取DNA的濃度和質(zhì)量。

1.3 種屬鑒定

采用先前建立的PCR法進(jìn)行種屬鑒定，其敏感性、特異性及具體方法已報(bào)道。簡言之，針對(duì)人、小鼠、大鼠、中國倉鼠、敘利亞倉鼠、猴、牛、狗、豬及兔等10個(gè)種屬設(shè)計(jì)特異性的引物；將樣本基因組DNA分別用這10種引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察是否有特異性條帶出現(xiàn)，從而判斷樣品的來源種屬。PCR反應(yīng)同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，以去離子水作為陰性對(duì)照模板，分別以細(xì)胞系RD(人橫紋肌肉瘤細(xì)胞)、Hepa 1- 6(小鼠肝癌細(xì)胞)、PC- 12(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)、CHO(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、 MDBK (牛腎細(xì)胞)、MDCK(狗腎細(xì)胞)、VERO(非洲綠猴腎細(xì)胞)、LLC-PK1(豬腎細(xì)胞)、BHK- 21(敘利亞倉鼠腎細(xì)胞)和CCC-SMC- 1(兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞)作為相應(yīng)種屬的陽性對(duì)照模板。PCR程序?yàn)? 95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共26個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察拍照。

1.4 染色體分析

對(duì)本中心收集的PCR法鑒定種屬有誤的細(xì)胞，重新復(fù)蘇，通過染色體分析確定細(xì)胞的來源種屬。具體做法為：待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，加入終濃度為0.01 mg/L的秋水仙素，37 ℃孵育2 h；去除含秋水仙素的培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，使細(xì)胞變圓，脫離培養(yǎng)瓶壁，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化；1 000 r/min離心、收集細(xì)胞；棄上清，用5～10 mL的0.075 mol/L的氯化鉀溶液重懸細(xì)胞團(tuán)，37 ℃作用10～20 min；離心，棄上清，加入2～5 mL新鮮配制的固定液(甲醇∶冰醋酸3∶1混合)，混勻，室溫下固定5～10 min；重復(fù)固定細(xì)胞2～3次；離心，收集細(xì)胞，用少量新鮮固定液重懸；用吸管滴加懸液到干凈的載玻片上，使細(xì)胞懸液在載玻片上鋪展開來，室溫下自然干燥；用Giemsa染液染載玻片10～15 min；流水沖洗載玻片，空氣干燥。油鏡下觀察中期染色體并拍照和計(jì)數(shù)。

表1 研究中使用的細(xì)胞系Table 1 List of the cell lines tested

2 結(jié)果

2.1 160例非人源細(xì)胞系概況

收集到的160例非人源細(xì)胞，涵蓋9個(gè)種屬，包括小鼠源細(xì)胞97種、大鼠源細(xì)胞27種、中國倉鼠細(xì)胞4種、敘利亞倉鼠細(xì)胞3種、猴源細(xì)胞10種、牛源細(xì)胞7種、兔源細(xì)胞5種、狗源細(xì)胞2種及豬源細(xì)胞5種(圖1)。

圖1 160例非人源細(xì)胞種屬公布Fig 1 Overview of the 160 non-human cell lines tested

2.2 非人源細(xì)胞系種間交叉污染的情況

在這160例非人源細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)154株非人源細(xì)胞經(jīng)種屬鑒定與預(yù)期一致，排除種間的交叉污染，部分細(xì)胞種屬鑒定的結(jié)果(圖2)。另外，有6種細(xì)胞存在種間交叉污染的情況，發(fā)生率為3.75%。這6種細(xì)胞包括H9C2(2- 1)-Luc2-TdT(熒光素酶-紅色熒光蛋白標(biāo)記的大鼠胚胎心肌細(xì)胞)、RGC- 5(大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)、Marc- 145(猴腎細(xì)胞)、AtT20(小鼠垂體瘤細(xì)胞)、ST(豬睪丸細(xì)胞)和IPEC-J2B(豬小腸上皮細(xì)胞)(表1)。H9C2(2- 1)-Luc2-TdT來源于大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2(2- 1)，但是不同于母系細(xì)胞單一的成肌細(xì)胞樣，該細(xì)胞在鏡下顯示出兩種明顯不同的形態(tài)——成肌細(xì)胞樣和上皮樣(圖2)。通過PCR種屬鑒定，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞是大鼠細(xì)胞和人源細(xì)胞的混合培養(yǎng)物(圖2)。后經(jīng)STR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)混入的人源細(xì)胞為SV40T轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞293T。在檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的6株種內(nèi)交叉污染的動(dòng)物細(xì)胞中，有3株是來自于同一個(gè)獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，包括Marc-145(猴腎細(xì)胞系)、IPEC-J2B(豬小腸上皮細(xì)胞)和ST(豬睪丸細(xì)胞)，這3種細(xì)胞經(jīng)鑒定分別為敘利亞倉鼠源細(xì)胞、人源細(xì)胞和猴源細(xì)胞(圖2)。其中IPEC-J2B后經(jīng)STR鑒定發(fā)現(xiàn)實(shí)為CW- 2細(xì)胞，一種人結(jié)腸癌細(xì)胞系。另外，小鼠垂體瘤細(xì)胞AtT20被鑒定為大鼠源細(xì)胞，大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC- 5經(jīng)鑒定為小鼠源細(xì)胞(表2)。

表2 種間交叉污染的非人源細(xì)胞系

2.3 染色體分析結(jié)果

在6例出現(xiàn)種間交叉污染的細(xì)胞中，僅小鼠垂體瘤細(xì)胞AtT20為本中心保藏細(xì)胞，其余5例均為其他實(shí)驗(yàn)室送檢細(xì)胞，送檢樣品為-20 ℃凍存的細(xì)胞團(tuán)，故無法進(jìn)行進(jìn)一步的染色體分析。為了確認(rèn)本中心原來保藏的AtT20的種屬，制備了該細(xì)胞的染色體鋪片。經(jīng)計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的染色體分布在65～71條，染色體形態(tài)不符合小鼠端著絲粒染色體的特征，為大鼠來源(圖4)。

3 討論

細(xì)胞系交叉污染是指一種細(xì)胞被另外一種不相關(guān)的細(xì)胞污染，20世紀(jì)50年代首次報(bào)道。但是，由于重視程度不夠，近些年細(xì)胞系交叉污染的現(xiàn)象仍然非常嚴(yán)重[3- 5]。細(xì)胞系交叉污染主要是操作者的問題。不同細(xì)胞共用培養(yǎng)基、同時(shí)操作多種細(xì)胞、錯(cuò)誤標(biāo)記或者標(biāo)記不清以及飼養(yǎng)層細(xì)胞或條件性培養(yǎng)基的使用都可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞系的交叉污染。有些交叉污染可能出現(xiàn)的比較早，即在細(xì)胞系建立的過程就出現(xiàn)了，比如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，其建系實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)胞就已經(jīng)被人膀胱癌細(xì)胞T24所污染[6]。有的交叉污染可能局限在某些實(shí)驗(yàn)室的， 建系的實(shí)驗(yàn)室或者大的保藏機(jī)構(gòu)仍能找到的正確的細(xì)胞。本研究中發(fā)現(xiàn)的6種錯(cuò)誤細(xì)胞均是這種情況。

T.test sample; P.cell lines of corresponding species used as positive control separately; P1.RD (human rhabdomyosarcoma cell line); P2.Hepa 1-6 (mouse hepatocarcinoma cell line); P3.PC- 12 (rat phaeochromocytoma cell line); P4.CHO (Chinese hamster ovary cells); P5.MDBK(bovine kidney cell line); P6.MDCK(dog kidney cell line); P7.VERO(African green monkey kidney cell line); P8.LLC-PK1(pig kidney cell line); P9.BHK- 21(Syrian hamster kidney cell line); P10.CCC-SMC- 1(rabbit aortic smooth muscle cells); M.DNA marker

圖210個(gè)種屬細(xì)胞的PCR檢測(cè)電泳圖
Fig2GelelectrophoresisofthePCRproductsfrom10species

但是，一份針對(duì)483名細(xì)胞使用人員的調(diào)查結(jié)果顯示，35%的人使用細(xì)胞時(shí)是從其他實(shí)驗(yàn)室獲得的，而非正規(guī)的細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)，且受試者中近一半不會(huì)對(duì)拿到的細(xì)胞進(jìn)行身份認(rèn)證[7]。這就使得那些局限在某些實(shí)驗(yàn)室的錯(cuò)誤細(xì)胞得到了推廣。

A.two distinct morphology was found in the microscopic view of H9C2(2- 1)-Luc2-TdT; B.the microscopic view of normal H9C2(2- 1); C.by PCR-based species identification, H9C2(2- 1)-Luc2-TdT was cross-contaminated with human cells; D,E.by PCR-based species identification, Mac- 145 and IPEC-J2B were identified as cells of Syrian hamster and human origin, respectively

圖3種間交叉污染的非人源細(xì)胞系

Fig3Interspeciescross-contaminationofnon-humancells

Rat chromosomes were found in the metaphase spreads of AtT20(mouse pituitary cells)圖4 AtT20細(xì)胞中期染色體形態(tài)Fig 4 Chromosome morphology in the metaphase spreads of AtT20(×1 000)

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)是人源細(xì)胞身份認(rèn)證的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)負(fù)責(zé)人同步撰文，告知研究用細(xì)胞的質(zhì)量要求[9]。本中心通過STR對(duì)進(jìn)行細(xì)胞身份鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合種屬鑒定可以提高細(xì)胞交叉污染的檢出率。國內(nèi)常用的482例人腫瘤細(xì)胞中，20.5%(99/482)為錯(cuò)誤細(xì)胞系，其中14.5%為種內(nèi)交叉污染，4.4%為種間交叉污染，另有1.7%的細(xì)胞實(shí)為兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)物[10]。非人源細(xì)胞交叉污染的比例低于人源細(xì)胞的污染比例。國際細(xì)胞系認(rèn)證委員會(huì)(International Cell Line Authentication Committee，ICLAC)最新公布的數(shù)據(jù)中，有488例實(shí)驗(yàn)細(xì)胞被交叉污染或錯(cuò)誤認(rèn)定，其中非人源細(xì)胞占4.9%(24/488)(http://iclac.org/databases/cross-contaminations/)。低污染比例與非人源細(xì)胞的使用較少有關(guān)。

通過種屬鑒定和人源細(xì)胞的STR分析，細(xì)胞的身份可以得到初步的驗(yàn)證。但是仍需要開發(fā)更多的技術(shù)來完善，比如小鼠、大鼠等常見動(dòng)物細(xì)胞的STR分析，用于排除種內(nèi)的交叉污染[11]。另外，通過高通量RNA測(cè)序的方法，發(fā)現(xiàn)多種鼻咽癌細(xì)胞如CNE- 1和CNE- 2等是被Hela細(xì)胞與另外一種未知的細(xì)胞融合而產(chǎn)生的錯(cuò)誤細(xì)胞[12]。細(xì)胞身份認(rèn)證仍有大量的工作需要完成。但是，對(duì)于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的使用者來說，從正規(guī)途徑獲取細(xì)胞和嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作是避免細(xì)胞交叉污染的有效方法。

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