盧桃利，霍芳芳，翟中杰，張 蓓

(1.成都市第二人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610015；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710003；3.空軍軍醫(yī)大學(xué) 衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，陜西 西安 710003)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后炎性反應(yīng)在神經(jīng)修復(fù)中的作用一直備受爭議。而研究報(bào)道，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后損傷局部的巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞被激活為兩種不同的表型：促炎表型即經(jīng)典激活型(classically activated-M1)和抑炎表型(M2)即選擇激活表型(alternatively activated)。M1表型可以釋放大量促炎因子，具有神經(jīng)毒性作用；而M2表型可以促進(jìn)軸突生長及組織修復(fù)。因此促進(jìn)損傷局部的M1表型巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞向M2轉(zhuǎn)變有利于神經(jīng)損傷修復(fù)[1- 2]。

槲皮素(3,3,4,5,7-五羥基黃酮)屬黃酮類化合物，可以降低由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)刺激引起的小鼠小膠質(zhì)瘤細(xì)胞(BV2細(xì)胞)中誘導(dǎo)性一氧化碳合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞外信號調(diào)控激酶c-Jun、AKT、SRC、JAK-1及AP- 1的表達(dá)水平，具有較強(qiáng)的抗炎抗氧化作用[3- 4]。但其對巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響尚不明確，本研究采用脊髓鉗夾法建立小鼠脊髓損傷模型，探討槲皮素對損傷局部炎性微環(huán)境尤其是巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SPF級動(dòng)物：8周齡雌性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量15～20 g?？哲娷娽t(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號SCXK(軍)2012- 0007]。

1.1.2 試劑：槲皮素(Sigma公司)；anti-arginase1、anti-iNOS及anti-CD11b抗體(Abcam公司)；驢抗兔488、驢抗羊555和驢抗大鼠594熒光二抗(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理：將小鼠分為脊髓損傷組暴露 T9-T11 節(jié)段椎板，咬除 T10 節(jié)段椎板后分離硬脊膜，將力量為 50 g的動(dòng)脈夾置于T10兩側(cè)并持續(xù) 30 s，如此可有效破壞小鼠皮質(zhì)脊髓束，縫合肌肉層和皮膚。槲皮素治療組于術(shù)后給予槲皮素(50 mg/kg)，每12 h給藥1次。術(shù)后定時(shí)壓迫膀胱協(xié)助其排尿。

1.2.2 免疫熒光染色分析M1和M2細(xì)胞:對損傷脊髓節(jié)段OCT包埋后，行矢狀位連續(xù)冰凍切片(n=3/組)，經(jīng)0.3% Triton破膜及5% BSA封閉處理后，一抗孵育：Goat anti-Arginase-1(1∶100; M2 Marker)和Rat anti-iNOS(1∶100; M1 Marker)， 分別與Rabbit anti-CD11b(1∶200; 巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞Marker)進(jìn)行雙標(biāo)， 4 ℃冰箱過夜。PBS漂洗后，行Alex-flour 標(biāo)記：驢抗兔488、驢抗羊 555 和驢抗大鼠 594 熒光二抗(1∶1 000)室溫避光孵育2 h，PBS漂洗晾干后DAPI封片，即可進(jìn)行激光共聚焦熒光顯微鏡觀察和拍攝。通過計(jì)算iNOS+細(xì)胞數(shù)與CD11b+細(xì)胞數(shù)比例(iNOS/CD11b)代表損傷局部M1表型細(xì)胞的比例，同時(shí)，計(jì)算Arg1+細(xì)胞數(shù)與CD11b+細(xì)胞數(shù)比例代表M2表型細(xì)胞的比例。

1.2.3 Real-time PCR檢測炎性因子 mRNA 的表達(dá):取損傷中心至頭側(cè)和尾側(cè)各 1.5 mm，進(jìn)而通過Trizol法提取損傷節(jié)段總 RNA，檢測濃度后上游引物轉(zhuǎn)錄為cDNA后即可進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)合成: NOS2:上游引物:5′-TTTTGTTGTT CATCTCGGA-3′,下游引物: 5′-CAGGCAGTATCACT CATTG-3′; TNF-α：上游引物：5′-ACTTGGTGGTTTG CTACGAC-3′,下游引物:5′-CTTCCAGAACTCCAGG CGGT-3′; TGF-β:上游引物:5′-CGTAGATAACGAA CAGGA-3′,下游引物:5′-CAAAGCAGGAGACCAGG A-3′; IL- 10：上游引物:5′-CTTATTTTCACAGGGGAG-3′,下游引物: 5-AGGGTTACTTGGGTTGCC-3; GAPDH:上游引物:5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3′, 下游引物：5′-GTGGAAGTTGCTGT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s后4 ℃保存。

1.2.4 行為學(xué)檢測:根據(jù) BMS(Basso mouse scale)量表對術(shù)后小鼠的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評分。在損傷后1、3、7和14 d通過多個(gè)觀察者對每只實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行雙盲法評分。主要從關(guān)節(jié)活動(dòng)、后肢承重、步態(tài)等方面進(jìn)行評估。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 損傷局部巨噬細(xì)胞表型變化

SCI后損傷局部巨噬細(xì)胞M1(iNOS/CD11b)表型比例隨損傷時(shí)間逐漸增加，而M2(Arg1/CD11b)表型比例呈遞減趨勢，至損傷后期以M1表型為主(圖1，2)。槲皮素治療后能顯著降低M1表型細(xì)胞的比例(P<0.01)，同時(shí)提高了M2表型的比例(P<0.01)。對兩組損傷后各時(shí)間點(diǎn)的比較顯示，槲皮素治療組在損傷后3、7和14 d的M1表型比例均顯著低于SCI組(P<0.05)，同時(shí)M2表型比例均顯著高于SCI組(P<0.05)(表1，2)。

2.2 損傷局部炎性因子mRNA表達(dá)變化

槲皮素可以顯著降低促炎因子(TNF-α和NOS2)mRNA的表達(dá)(P<0.05)(表3)；同時(shí)明顯提高抑炎因子(TGF-β和IL- 10)mRNA的表達(dá)(P<0.05)(表4)。

表1 損傷節(jié)段各時(shí)間點(diǎn)M1表型巨噬細(xì)胞比例(iNOS/CD11b)

*P<0.01 compared with SCI group.

表2 損傷節(jié)段各時(shí)間點(diǎn)M2表型巨噬細(xì)胞比例(Arg1/CD11b)

*P<0.05,**P<0.01 compared with SCI group.

2.3 神經(jīng)功能損傷修復(fù)檢測

各組小鼠整體上處理效應(yīng)(P<0.01)和時(shí)間效應(yīng)(P<0.001)，處理因素與時(shí)間因素存在交互作用(P<0.001)，槲皮素治療組在損傷后7和14 d后BMS評分均顯著高于SCI組(P<0.05)(表5)。

表3 損傷局部促炎因子TNF-α和NOS2 mRNA表達(dá)水平Table 3 mRNA expression of pro-inflammatory factors TNF-α and NOS2 in lesion n=3)

*P<0.05,**P<0.01 compared with SCI group.

表4 損傷局部抑炎因子TGF-β和IL- 10 mRNA表達(dá)水平Table 4 mRNA expression of anti-inflammatory factors TGF-β and IL- 10 in lesion n=3)

*P<0.05，**P<0.01 compared with SCI group.

圖1 脊髓損傷后第7天SCI組和槲皮素治療組損傷節(jié)段免疫熒光染色

圖2 脊髓損傷后第7天SCI組和槲皮素治療組損傷節(jié)段免疫熒光染色

group1day3days7days14daysSCI1.30±0.821.70±0.62 3.11±1.20 3.73±1.25quercetin1.00±0.811.90±0.88 4.62±1.43* 7.17±1.45**

*P<0.05，**P<0.01 compared with SCI group.

3 討論

脊髓損傷后的局部炎性反應(yīng)像一把雙刃劍備受爭議。一方面損傷局部的炎性細(xì)胞快速吞噬清理壞死組織，有助于軸突再生及功能修復(fù)；而過度激活的炎性反應(yīng)又加重軸突的回縮、脫髓鞘及神經(jīng)元凋亡[5- 6]。巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞是損傷局部炎性反應(yīng)的主要參與者。根據(jù)損傷微環(huán)境的不同，巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞可以被迅速激活為M1或M2兩種表型。其中LPS和IFN-γ可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)變，此種表型具有較強(qiáng)的抗原提呈作用，能產(chǎn)生大量促炎因子，如TNF-α、IL- 1b、IL- 6、IL- 12、IL- 23、NO和ROS等，對細(xì)胞內(nèi)的病原微生物具有較強(qiáng)的殺傷作用。而IL- 4和IL- 13可以激活巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)變，進(jìn)而產(chǎn)生IL- 4、IL- 5和IL- 10等大量抑炎因子，促進(jìn)組織修復(fù)[7- 10]。

槲皮素是一種黃酮類的抗炎、抗氧化劑，能有效抑制iNOS的活性，促進(jìn)Nrf- 2信號通路的激活[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脊髓損傷后第3天，損傷局部M1表型細(xì)胞與M2表型細(xì)胞比值(M1/M2)大體一致，而損傷7 d后， M2表型陽性細(xì)胞明顯減少，致M1/M2比值迅速增加；而腹腔注射槲皮素，可以顯著增加損傷局部M2表型細(xì)胞的比例，同時(shí)明顯改善損傷局部炎性反應(yīng)微環(huán)境，包括降低促炎因子IL- 1b、IL- 6和iNOS的表達(dá)及提高抑炎因子IL- 4和IL- 10 的表達(dá)。表明槲皮素對巨噬細(xì)胞表型的調(diào)控可能是其發(fā)揮抗炎作用的重要機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)槲皮素可以促進(jìn)脊髓損傷小鼠運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)，而這可能與巨噬細(xì)胞表型由M1向M2轉(zhuǎn)變有關(guān)。通過向SCI小鼠損傷局部注射腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)后發(fā)現(xiàn)，BDNF可以促進(jìn)巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞由M1向M2表型轉(zhuǎn)變，并促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[12]。而向SCI小鼠移植間充質(zhì)干細(xì)胞后，改善了損傷局部炎性反應(yīng)微環(huán)境，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型向M2轉(zhuǎn)變，同時(shí)促進(jìn)了軸突再生及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[13]。但需要注意的是，槲皮素可以通過激活NA+-K+-2Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NKCC1)而增加胞質(zhì)內(nèi)Cl-濃度，進(jìn)而刺激微管蛋白的聚合，促進(jìn)神經(jīng)突觸的生長[14]。由此可見，槲皮素可以通過多重機(jī)制促進(jìn)損傷后的神經(jīng)修復(fù)。

綜上所述，本研究表明腹腔注射槲皮素可以促進(jìn)損傷局部巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞表型由M1向M2轉(zhuǎn)變，同時(shí)改善損傷局部炎性反應(yīng)微環(huán)境及運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)，但具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討研究。

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