武佳玉，劉 松，王曉月

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005)

全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(genome-wide associa-tion study, GWAS)已經(jīng)鑒定了約1 000多個(gè)與癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)位點(diǎn)，其中有很多SNP位于非編碼區(qū)[1]。目前的研究表明，非編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)可以通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控活性，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[2]。然而，對(duì)于大部分非編碼區(qū)SNP位點(diǎn)在癌癥發(fā)生中的作用機(jī)制則尚不清楚，值得深入研究。

rs6858698是一個(gè)與慢性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的SNP位點(diǎn)[3]。該SNP位于鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶2D(calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ subunit delta,CAMK2D)基因上游，距離CAMK2D的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的長(zhǎng)度約有760個(gè)堿基對(duì)，位于DNA酶高敏感位點(diǎn)內(nèi)，并且具有增強(qiáng)子特異的組蛋白修飾信號(hào)，如組蛋白3賴氨酸27乙?；?H3K27ac)。DNA元件百科全書(shū)(encyclopedia of DNA elements, ENCODE)數(shù)據(jù)庫(kù)也顯示rs6858698位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的熱點(diǎn)位置[4]。鑒于rs6858698位點(diǎn)所在區(qū)域具有潛在的調(diào)控元件活性，本研究主要致力于探索rs6858698位點(diǎn)在調(diào)控基因表達(dá)方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人胚腎細(xì)胞系HEK293T購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司)；lentiCRISPRv2質(zhì)粒、lentiGuide-Puro質(zhì)粒、病毒包裝輔助質(zhì)粒psPAX2和PMD2.G(Addgene公司)；限制性內(nèi)切酶BsmBⅠ、Neon電轉(zhuǎn)試劑盒、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和嘌呤霉素(賽默飛世爾科技公司)；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、BglⅡ和Gibson組裝酶(NEB公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)；螢火蟲(chóng)熒光素酶質(zhì)粒(pGL4.23-SCP1)、海參熒光素酶質(zhì)粒(Tk)、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega公司)；Neofect轉(zhuǎn)染試劑(零客創(chuàng)智生物科技公司)；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 含rs6858698區(qū)域的報(bào)告基因載體的構(gòu)建：限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BglⅡ雙酶切pGL4.23-SCP1質(zhì)粒載體。同時(shí)以HEK293T基因組DNA為模板，擴(kuò)增rs6858698位點(diǎn)附近長(zhǎng)度約為500個(gè)堿基對(duì)的DNA序列。將PCR產(chǎn)物通過(guò)Gibson組裝連接到pGL4.23-SCP1質(zhì)粒SCP1啟動(dòng)子的上游，測(cè)序得到SNP位點(diǎn)的基因型。以測(cè)序成功的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行點(diǎn)突變PCR，構(gòu)建定點(diǎn)突變的質(zhì)?？寺　CR引物見(jiàn)表1

1.2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：按照1.5×105/孔將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞增殖至60%～80%匯合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)染20 ng海腎熒光素酶質(zhì)粒和500 ng pGL4.23-SCP1質(zhì)粒(rs6858698-C和rs6858698-G)，同時(shí)共轉(zhuǎn)20 ng海腎熒光素酶質(zhì)粒和500 ng pGL4.23-SCP1質(zhì)粒空載體作為陰性對(duì)照組。24 h后檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.3 點(diǎn)突變細(xì)胞株構(gòu)建：選取切割位置距離rs6858698位點(diǎn)最近的單鏈導(dǎo)向RNA(single guide RNA, sgRNA)，將其構(gòu)建到lentiCRISPRv2質(zhì)粒載體上。同源重組的DNA模板是一條長(zhǎng)度為127個(gè)堿基的單鏈寡核苷酸[5]。使用Neon電轉(zhuǎn)儀將4 μg構(gòu)建成功的lentiCRISPR-v2質(zhì)粒和1 μg模板DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞內(nèi)。48 h后加入嘌呤霉素至終濃度為1.5 μg/mL進(jìn)行篩選，分選細(xì)胞單克隆，測(cè)序鑒定。

1.2.4 RNA-seq樣品制備及高通量測(cè)序：將野生型細(xì)胞(rs6858698-G)和突變型細(xì)胞(rs6858698-C)分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組有3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞增殖至80 %匯合后，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。由諾禾致源公司進(jìn)行后續(xù)建庫(kù)及全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證RNA-seq的分析結(jié)果：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，取3 μg RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系為1 μL cDNA，1 μL上下游引物混合物，5 μL預(yù)混液和3 μL無(wú)核酸酶的水?；蛳鄬?duì)表達(dá)量使用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量。引物序列見(jiàn)表3

1.2.6 CRISPR干擾實(shí)驗(yàn):利用在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)sgRNA序列(http://cistrome.org/SSC/)(表2)[6]，將sgRNA構(gòu)建到lentiGuide-Puro載體上，包裝病毒，感染穩(wěn)定表達(dá)dCas9-KRAB的細(xì)胞株[7]。48 h后加嘌呤霉素進(jìn)行抗生素篩選，5 d后用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.3.1 差異表達(dá)基因的篩選：使用HISAT2、Stringtie、Ballgown套件流程分析RNA-seq的測(cè)序結(jié)果[8]，差異表達(dá)基因定義為Qvalue < 0.05，且表達(dá)倍數(shù)差異不低于1.5倍的基因。

1.3.2 GO功能顯著性富集分析：將差異表達(dá)基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)(http:www.geneontology.org/)的各個(gè)生物學(xué)過(guò)程條目映射，計(jì)算每個(gè)條目?jī)?nèi)的基因數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 rs6858698位點(diǎn)所在的DNA片段的調(diào)控活性

rs6858698-G DNA片段和rs6858698-C DNA片段均具有較強(qiáng)的增強(qiáng)子活性(P<0.05)，其中rs6858698-C DNA片段所具有的增強(qiáng)子活性明顯高于rs6858698-G DNA片段所具有的增強(qiáng)子活性，約有1.69倍(圖1)。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers used for PCR

表2 sgRNA靶點(diǎn)以及寡核苷酸序列Table 2 Oligos sequences of sgRNAs for knockin and CRISPRi

表3 RT-PCR引物序列Table 3 Primers used for RT-PCR

*P<0.001 comparing control group圖1 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)rs6858698位點(diǎn)的功能Fig 1 Dual-luciferase reporter assay was performed to detect the function of n=3)

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯

野生型HEK293T細(xì)胞基因組DNA測(cè)序顯示rs6858698位點(diǎn)的基因型為GG，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯后，成功將該位點(diǎn)的基因型由GG變?yōu)镃C(圖2)。

2.3 RNA-seq分析鑒別差異表達(dá)基因

根據(jù)差異表達(dá)倍數(shù)大于1.5和q值小于0.05，在野生型(rs6858698-G)和突變型(rs6858698-C)的HEK293T細(xì)胞中共篩選出140個(gè)差異表達(dá)基因。其中上調(diào)的差異表達(dá)基因有53個(gè)，下調(diào)的差異表達(dá)基因有87個(gè)。上調(diào)和下調(diào)的部分差異表達(dá)基因(表4，5)。GO生物學(xué)過(guò)程富集分析顯示參與的生物學(xué)過(guò)程主要涉及蛋白質(zhì)異二聚化活性、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、 鈣黏蛋白結(jié)合、 泛素樣蛋白結(jié)合酶結(jié)合、泛素蛋白結(jié)合酶結(jié)合、組蛋白結(jié)合、染色質(zhì)DNA結(jié)合、組蛋白去乙?；附Y(jié)合、未折疊蛋白結(jié)合、核小體結(jié)合、核小體DNA結(jié)合、蛋白激酶活化劑活性和核定位序列結(jié)合(P<0.05)(圖3)。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因的結(jié)果

選取了鋅指蛋白595(zinc finger protein 595, ZNF595)、硒代半胱氨酸合成酶(selencysteine synthase，SEPSECS)、羰基還原酶(carbonyl reductase 4，CBR4)、甲基固醇單加氧酶1(methylsterol monooxygenase 1，MSMO1)和鏈非編碼RNA 02506 (long non-coding RNA 02506，LINC02506)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，基因表達(dá)結(jié)果與RNA-seq分析結(jié)果一致，且均有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。

2.5 rs6858698區(qū)域與差異表達(dá)基因之間的調(diào)控關(guān)系

利用CRISPR干擾實(shí)驗(yàn)(CRISPR interference，CRISPRi)抑制rs6858698區(qū)域的調(diào)控活性后，發(fā)現(xiàn)ZNF595、SEPSECS、CBR4、焦磷酸酶2(pyrophosphatase 2，PPA2)的基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01)(圖5)。

3 討論

本研究表明rs6858698位點(diǎn)具有等位基因特異性的調(diào)控活性。通過(guò)CRISPR系統(tǒng)所介導(dǎo)的基因組編輯，在293T細(xì)胞內(nèi)定點(diǎn)突變了rs6858698位點(diǎn)的基因型。RNA-seq測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)不同等位基因所介導(dǎo)的調(diào)控活性差異，可以影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1 (transforming growth factor beta 1, TGFB1)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)、原癌基因c-JUN(proto-oncogene c-Jun, JUN)、早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白(early growth response protein2，EGR-2)等與慢性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因的表達(dá)。

圖2 rs6858698位點(diǎn)基因組編輯成功后的測(cè)序鑒定結(jié)果Fig 2 Sanger sequencing results of rs6858698-containing region in rs6858698-G and rs6858698-C cells

genefoldchangeP-valQ-valFGF135.540.00070.0261ELFN1-AS13.910.00050.0240OAZ23.840.00030.0196HSPA83.790.00120.0317MAGEA23.590.00330.0478DNAJB13.000.00060.0249FOXO42.400.00110.0302APOBEC3A2.240.00190.0365MSMO11.870.00160.0345CDKN1A1.770.00200.0379ZNF5951.750.00070.0268TGFB11.590.00150.0330CBX61.570.00130.0321

表5 差異表達(dá)下調(diào)部分已知基因列表Table 5 List of down-regulation part of the known genes

圖3 GO富集分析結(jié)果Fig 3 GO enrichment analysis results

根據(jù)Oncomine網(wǎng)站的臨床樣本數(shù)據(jù)分析可知，VEGFA、JUN、CDKN1A、EGR2、CBR4、PPA2、SEPSECS等基因在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者和正常人之間也存在顯著的表達(dá)差異[9 -10]。其中VEGFA是一種重要的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，可以明顯影響VEGF在細(xì)胞中的含量， 對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病患者的預(yù)后具有指導(dǎo)意義[11]。所以，本研究中所分析出的差異表達(dá)基因?qū)μ骄縭s6858698位點(diǎn)影響慢性淋巴細(xì)胞白血病易感性的分子機(jī)制具有一定的指示作用。

Expression of SEPSECS, ZNF595, CBR4, MSMO1 and LINC02506 in rs6858698-C cells were down-regulated compared with rs6858698-G cells; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compare with rs6858698-G group圖4 實(shí)時(shí)定量PCR鑒定的結(jié)果Fig 4 Validation of gene expression changes by real-time quantitative PCR(RT-qPCR)

全基因組和全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，慢性淋巴細(xì)胞白血病患者的基因組DNA內(nèi)存在較少的基因突變及拷貝數(shù)變異，基因的異常表達(dá)主要是由于表觀基因組異常所導(dǎo)致[12]。而在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)GO功能富集分析顯示，差異表達(dá)基因也主要富集在染色質(zhì)構(gòu)象、組蛋白修飾等與表觀修飾相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。這也再次提示表觀基因組異常在慢性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，也從一定程度上解釋了rs6858698位點(diǎn)與慢性淋巴白血病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建定點(diǎn)突變的細(xì)胞株，分析了白血病易感位點(diǎn)rs6858698的不同基因型對(duì)基因表達(dá)的影響，初步鑒定了受到rs6858698位點(diǎn)調(diào)控的基因，為進(jìn)一步研究rs6858698影響慢性淋巴細(xì)胞白血病易感性的分子機(jī)制提供了線索。

ZNF595,PPA2,SEPSECSandCBR4 in sgRNA1 and sgRNA2 groups were down-regulated compared with sgRNA(NT) group;*P<0.01,**P<0.001 compared with sgRNA(NT) group

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