李 娜，劉雅琴，張秀冰，李美欣，袁紅霞，邱振宇*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系, 遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染性疾病科，遼寧 錦州 121001)

巨噬細(xì)胞(macrophage，Mφ)是膿毒癥中機(jī)體的第一道防線[1]。Mφ上的Toll樣受體- 4(toll- like receptors- 4，TLR4)為脂多糖(LPS)刺激的主要受體[2]，可通過(guò)一系列反應(yīng)激活核因子 (nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)通路[3]。近年發(fā)現(xiàn)鞘氨醇激酶1(sphingosine-1-phosphate，SPHK1)參與其中的多個(gè)環(huán)節(jié)，并起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[4]。故目前認(rèn)為TLR4及SPHK1可能是膿毒癥休克和多器官功能衰竭等疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子。

某些喹諾酮類(quinolones，QNs)具有免疫調(diào)節(jié)活性[5]。莫西沙星(moxifloxacin，MXF)為四代喹諾酮，目前認(rèn)為其對(duì)免疫系統(tǒng)有激活與抑制的雙向調(diào)節(jié)作用[6]，而對(duì)其在巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響研究較少。

故本實(shí)驗(yàn)擬采用不同濃度MXF對(duì)LPS刺激下的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行作用，觀察其對(duì)TLR4、SPHK1、NF-κBmRNA和蛋白的表達(dá)水平，及細(xì)胞上清液TNF-α和IL- 1的分泌水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)昆明小鼠，雄性，6～8 周齡，體質(zhì)量(18 ± 0.5) g，錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(遼)2014- 0004]。每只小鼠籠中放喂3只，實(shí)驗(yàn)前饑餓3 d。

1.1.2 主要試劑：1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；TLR4和NF-κB p65(博奧森生物有限公司)；SPHK1(Abgent公司)；鹽酸莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)品(拜耳公司)；Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、高純總RNA快速提取試劑盒(BioTeke公司)；RNase固相清除劑(北京天恩澤基因科技有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；TNF-α和IL- 1ELISA試劑盒(云克隆生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞的分離與純化及培養(yǎng)：按參考文獻(xiàn)[7]報(bào)道的方法，提取、分離培養(yǎng)及純化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，再加入RPMI1640 完全培養(yǎng)基置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。施加處理因素。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法：實(shí)驗(yàn)分6組：A組：對(duì)照組；B組：500 ng/mL LPS 處理組；C、D、E及F組：分別用8、16、32、64 mg/L MXF 干預(yù)組。

將細(xì)胞接種于6孔板中和鋪有細(xì)胞爬片的12孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞量均為2×105個(gè)。將各組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。收集6孔板中各組細(xì)胞進(jìn)行基因和蛋白的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。12孔板中各組細(xì)胞4%多聚甲醛固定20 min，免疫熒光相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)TLR4、SPHK1、NF-κB p65的mRNA表達(dá)：方法按說(shuō)明書處理，引物信息如表1。

以參照基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量，即Livak法，表達(dá)比率=2-△△Ct?！鳌鰿t=(實(shí)驗(yàn)組目的基因CT-內(nèi)參CT)-(對(duì)照組目的基因CT-內(nèi)參CT)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)TLR4、SPHK1的蛋白水平：具體操作按說(shuō)明書，各組巨噬細(xì)胞在LPS刺激后24 h收上清。

1.2.5 ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL- 1的表達(dá)：具體操作按說(shuō)明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 引物設(shè)計(jì)序列Table 1 Primer sequence

F.forword; R.reverse.

2 結(jié)果

2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

接種小鼠腹腔細(xì)胞4 h后巨噬細(xì)胞貼壁。分別于4、8、12和24 h后倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞主要為圓形或橢圓形，折光度好。應(yīng)用LPS刺激24 h即可見(jiàn)很多細(xì)胞出現(xiàn)明顯的偽足或變?yōu)樗笮?圖1，2)。

圖1 正常培養(yǎng)巨噬細(xì)胞Fig 1 Normal culture macrophages (×100)

圖2 LPS刺激24 h巨噬細(xì)胞Fig 2 Macrophage induced by LPS for 24 h ours(×100)

2.2 Real-time PCR檢測(cè)TLR4、SPHK1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)

正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)TLR4、SPHK1和NF-κB mRNA的量均較低，LPS刺激后TLR4、SPHK1、NF-κB mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.001)。和LPS組比較16 mg/L MXF干預(yù)組上述指標(biāo)明顯回降(P<0.001)， 而32和64 mg/L MXF組上述指標(biāo)較LPS組進(jìn)一步升高(P<0.001；P<0.05)(圖3)。

2.3 Western blot法檢測(cè)不同濃度MXF作用后LPS刺激下巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4、SPHK1和NF-κB的表達(dá)

與對(duì)照組相比，LPS組及MXF+LPS組巨噬細(xì)胞TLR4、SHPK1、NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.0001)。和LPS組比較MXF 8、16 mg/L組的TLR4、SHPK1蛋白表達(dá)顯著降低(分別為P<0.01，P<0.0001)，和LPS組比較MXF 8、16 mg/L的NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01，P<0.001)，MXF 64 mg/L組NF-κB蛋白表達(dá)高于LPS組(P<0.01)。MXF 16 mg/L組對(duì)3種蛋白表達(dá)的抑制最明顯，與其他MXF組比較有顯著性差異(P<0.001，P<0.01)。

2.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子

與對(duì)照組相比，LPS組及C、D、E、F組巨噬細(xì)胞TNF-α、IL- 1分泌明顯增加(P<0.001)。和LPS組比較MXF 16 mg/L的TNF-α、IL- 1分泌顯著受抑制(P<0.01)。

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的重要執(zhí)行者， 在機(jī)體抗感染中處于第一道防線。巨噬細(xì)胞表面TLR4 是主要的 LPS 識(shí)別受體[8]。TLR4激活后通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終使NF-κB 等活化。SPHK是一種鞘磷脂代謝酶，其中SPHK1及其產(chǎn)物S1P廣泛涉炎性介質(zhì)反應(yīng)及免疫細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外的LPS和細(xì)菌脂蛋白(bacterial lipoproteins，BLP)顯著上調(diào)SPHK1的表達(dá)[4]。SPHK1通過(guò)第二信使S1P的作用，參與TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑，活化3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)/AKT和NF-κB等信號(hào)傳導(dǎo)[9- 10]，NF-κB 激活后啟動(dòng)免疫和炎性反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致炎性過(guò)程升級(jí)失控表達(dá)大量炎性因子如 TNF-α、IL- 1、IL- 6、IL- 8及黏附分子等[11]，參與內(nèi)毒素血癥、休克和多器官功能性衰竭的發(fā)生[12- 13]。

*P<0.000 1 compared with control group；◆P<0.05，▲P<0.001，#P<0.0001 compared with LPS group圖3 各組TLR4、SPHK1、NF-κB mRNA的表達(dá)Fig 3 TLR4, SPHK1, NF-kappa B mRNA

groupTLR4 SHPK1 NF-κB control0.42±0.020.32±0.010.29±0.02LPS1.77±0.11*1.12±0.05*1.02±0.06*8mgMXF+LPS1.21±0.11*▲0.88±0.03*▲0.83±0.01*▲16mgMXF+LPS0.75±0.03*▲0.87±0.02*▲0.57±0.03*▲32mgMXF+LPS1.28±0.09*▲1.08±0.03*0.90±0.07*64mgMXF+LPS1.81±0.17*1.50±0.04*▲1.31±0.09*▲

*P<0.000 1 compared with control group；▲P<0.01 compared with LPS group.

A.control; B.LPS; C.MKF 8 mg/L; D.MXF 16 mg/L; E.MXF 32 mg/L; F.MXF 64 mg/L圖4 各組TLR4、SHPK1和NF-κB蛋白的表達(dá)Fig 4 Protein expression of TLR4， SHPK1，NF-κB

groupTNF-αIL-1control20.9±7.6#29.0±9.6#LPS398.0±15.0*168.9±8.6*8mgMXF+LPS329.2±23.3*#121.3±7.3*#16mgMXF+LPS160.8±25.0*#78.8±10.5*#32mgMXF+LPS423.1±37.1*173.2±12.7*64mgMXF+LPS509.8±21.3*#220.3±9.6*#

*P<0.000 1 compared with control group；#BHP<0.01 compared with LPS group.

理論上推斷QNs類抗菌藥作用于轉(zhuǎn)錄因子的方式是藥物可能直接作用于細(xì)胞膜、細(xì)胞受體或真核細(xì)胞的核或各種傳導(dǎo)通路中的激酶。研究表明，QNs可以提高致死性脂多糖所造的嚴(yán)重膿毒癥模型小鼠的生存率。藥物結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為某些QNs喹啉環(huán)N1位上連接的環(huán)丙烷是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的合成活性基團(tuán)[14]。MXF、環(huán)丙沙星、加替沙星、司帕沙星等均有該結(jié)構(gòu)，在治療劑量就能影響TNF-α、IL- 1、IL- 6 和趨化因子等細(xì)胞因子的合成，有抑制促炎細(xì)胞因子的作用。Purswani等研究表明，MXF能夠通過(guò)下調(diào)TNF-α或IL- 12，或通過(guò)上調(diào)IL- 10，調(diào)節(jié)肺泡巨噬細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的炎性反應(yīng)[14]。 但目前很少有證據(jù)說(shuō)明藥物可以直接與相應(yīng)細(xì)胞受體(如TLR4)發(fā)生作用或直接作用于各種激酶。

在本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度MXF作用細(xì)胞后，對(duì)TLR4和SPHK1的表達(dá)有不同的影響，在低中等濃度(16 mg/L)時(shí)對(duì)TLR4和SPHK1的表達(dá)有明顯抑制作用，而在高濃度(32 mg/L)時(shí)則對(duì)其表達(dá)影響不大，當(dāng)濃度達(dá)到更高(64 mg/L)時(shí)對(duì)TLR4、SPHK1的表達(dá)有一定的刺激作用，對(duì)細(xì)胞分泌促炎因子TNF-α、IL- 6的影響也是同樣，與報(bào)道MXF有雙向免疫調(diào)節(jié)作用相符[15]。抗菌藥在臨床的應(yīng)用十分廣泛，隨著對(duì)抗菌藥物的免疫調(diào)節(jié)作用研究的不斷深入，如果抗菌藥不僅限于抗菌治療，還能有助于重癥感染性疾病免疫功能的改善，在臨床上將起到事半功倍的效果。

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