范姝婕，劉俊雅，王 俊，劉娜斯，黃 薇，楊 楠，劉雁勇

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理學(xué)系，北京 100005)

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是一種缺乏雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2的特殊亞型乳腺癌。TNBC侵襲性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后較差[1]。目前，多西紫杉醇(docetaxel, DTX)作為T(mén)NBC主要的化療藥物廣泛應(yīng)用于臨床治療，但獲得性耐藥已經(jīng)成為一大障礙[2]。

前期研究中，課題組利用噬菌體展示技術(shù)篩選得到一種多肽LPLTPLP(P7)，可靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞膜表面的熱休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)并誘導(dǎo)其降解[9]。HSP90與腫瘤細(xì)胞內(nèi)眾多關(guān)鍵性信號(hào)調(diào)控因子有關(guān)，通過(guò)多條途徑使腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力增強(qiáng)[3- 6]。臨床試驗(yàn)顯示HSP90抑制劑聯(lián)用常規(guī)化療藥物能顯著提高治療效果[7- 8]。

本研究將HSP90抑制劑多肽P7與化療藥物DTX聯(lián)合應(yīng)用，探討兩藥聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，為增強(qiáng)TNBC對(duì)DTX化療敏感性提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

TNBC細(xì)胞系MDA-MB- 231(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)。藥物DTX(北京中碩醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)；多肽P7(吉爾生化公司合成)；單克隆抗體(Cell Signal Technology公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞分為：1)DTX組：0～100 nmol/L 8個(gè)濃度梯度；2)P7組：0～100 μmol/L 8個(gè)濃度梯度；3)P7 10、20和40 μmol/L分別與DTX 0～100 nmol/L 8個(gè)濃度梯度聯(lián)用；4)DTX(nmol/L)與P7(μmol/L)分別以固定比例2∶1、1∶1、1∶2、1∶4聯(lián)用。

1.2.2 SRB法檢測(cè)細(xì)胞活性：將MDA-MB- 231細(xì)胞接種于96孔板，孵育過(guò)夜后分組處理。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，經(jīng)SRB法處理，在波長(zhǎng)570 nmol/L處檢測(cè)吸光度A值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)多肽P7和化療藥物DTX單用或聯(lián)用對(duì)TNBC細(xì)胞系MDA-MB- 231凋亡水平的影響。按照上述實(shí)驗(yàn)方法分組加藥處理細(xì)胞，流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[10]。隨后使用BD AccuriTM C6流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 P7與DTX聯(lián)合對(duì)MDA-MB- 231細(xì)胞增殖的影響

不同濃度藥物處理MDA-MB- 231細(xì)胞48 h 后，DTX和P7均能抑制MDA-MB- 231(圖1A, B)。在10、20 和40 μmol/L P7共處理的條件下，DTX的半數(shù)有效濃度IC50明顯降低(圖1C)。P7聯(lián)合DTX的劑量比例均位于等效線下方(圖1D)，表明P7和DTX具有協(xié)同作用。

此外，本研究還計(jì)算了聯(lián)合作用指數(shù)(combined index, CI)，判斷DTX與P7的協(xié)同性。計(jì)算公式為CI=DA/ICX,A+DB/ICX,B(A、B代表兩種不同藥物，ICX,A和ICX,B是兩種藥物單獨(dú)使用使生長(zhǎng)抑制率達(dá)X時(shí)的藥物濃度，DA和DB是兩藥聯(lián)用使生長(zhǎng)抑制率達(dá)X時(shí)兩種藥物的濃度)。當(dāng)CI>1、CI=1或CI<1時(shí)，兩藥分別為拮抗、疊加或協(xié)同作用。通過(guò)抑制率Fa- 合用指數(shù)CI曲線，結(jié)果顯示CI<1，進(jìn)一步表明P7和DTX有協(xié)同作用(圖1E)。

2.2 P7與DTX聯(lián)合促進(jìn)細(xì)胞凋亡

合用后MDA-MB- 231細(xì)胞的凋亡率約為60.6%，是DTX單藥組的1.8倍(圖2A, B)。與對(duì)照組相比，DTX組(P<0.05)及兩藥聯(lián)用組(P<0.01)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax與Bcl- 2表達(dá)量的比值Bax/Bcl- 2明顯升高。與DTX單藥組相比，兩藥聯(lián)用組Bax/Bcl- 2明顯降低(P<0.05)(圖2C, D)。

A.cell viability in MDA-MB- 231 cells following 48 hours treatment of DTX; B.P7; C.DTX combined with P7; D.synergism of the interaction between DTX and P7 against MDA-MB- 231 cells according to the isobologram method; E.Fa-CI plot

A.following treatment with 0 (vehicle control), P7 20 μmol/L or DTX 10 nmol/L or P7 20 μmol/L combined with DTX 10 nmol/L for 48 hours, MDA-MB- 231 cells were subjected to Annexin V/PI staining and flow cytometry analysis to determine apoptotic cells; B.statistics of cell distribution in each group; C.effect of DTX and/or P7 on apoptosis-relevant proteins in MDA-MB- 231 cells as determined by Western blot; D.effect of DTX and/or P7 on Bax/Bcl- 2 ratio at protein level;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group；#P<0.05 compared with DTX group

3 討論

HSP90是一種新的腫瘤治療靶點(diǎn)，HSP90抑制劑與紫杉醇類化療藥物聯(lián)合具有良好的協(xié)同作用。17-AAG、AUY922以及Ganetespib 等HSP90抑制劑與紫杉醇類藥物聯(lián)用，可以提高非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌等腫瘤的治療效果[7- 8]。已經(jīng)有研究證明，HSP90與紫杉醇類藥物的作用靶點(diǎn)微管蛋白之間存在著聯(lián)系。HSP90保護(hù)微管蛋白不變性并穩(wěn)定微管蛋白的聚合[11]。同時(shí)，HSP90作為分子伴侶，其客戶蛋白在調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡中發(fā)揮著重要作用，誘導(dǎo)HSP90降解能通過(guò)多條途徑激活細(xì)胞的凋亡通路，避免了信號(hào)通路之間的代償。新型的HSP90抑制劑如BIIB021、NVP-AUY92229和Ganetespib等改進(jìn)了化學(xué)結(jié)構(gòu)，與二代HSP90抑制劑17-AAG和17-DMAG相比肝毒性明顯降低。然而遺憾的是，新型HSP90抑制劑仍有一定的不良反應(yīng)，如腹瀉、轉(zhuǎn)氨酶升高等。這些不良反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用。

多肽具有高親和力、高靶向特異性和高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，同時(shí)也顯示出一系列小分子藥物所具有的特點(diǎn)，例如快速的組織滲透性，較低的免疫應(yīng)答激活風(fēng)險(xiǎn)?；诙嚯念愃幬锱c靶點(diǎn)特異性高的強(qiáng)結(jié)合作用，多肽類藥物可以使用較低的給藥劑量，避免出現(xiàn)主要的不良反應(yīng)。前期研究篩選出了多肽P7，使用類免疫共沉淀及質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定了多肽P7的結(jié)合位點(diǎn)為HSP90。多肽P7可特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的HSP90并誘導(dǎo)其降解，為HSP90抑制劑[9]。本研究中HSP90靶向抑制劑雙功能多肽P7與化療藥物多西紫杉醇聯(lián)用表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用，也為將多肽作為載體、合成P7與DTX偶聯(lián)靶向藥提供了研究基礎(chǔ)。

DTX使有絲分裂阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。HSP90的許多客戶蛋白在凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[12]。前期研究證明，HSP90抑制劑多肽P7可誘導(dǎo)HSP90降解，激活細(xì)胞凋亡通路，提高細(xì)胞凋亡率[9]。Bcl- 2和Bax是重要的凋亡相關(guān)蛋白，抑凋亡蛋白Bcl- 2與促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平?jīng)Q定了細(xì)胞的存活或凋亡。上調(diào)Bax/Bcl- 2比值對(duì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高化療敏感性有重要作用。本研究將HSP90抑制劑多肽P7與化療藥物DTX聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示P7協(xié)同DTX誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞MDA-MB- 231凋亡，凋亡相關(guān)蛋白Bcl- 2、Bax表達(dá)量比值顯著降低。

綜上所述，P7能協(xié)同增強(qiáng)DTX對(duì)人TNBC細(xì)胞MDA-MB- 231的殺傷作用，其機(jī)制與調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，這為提高TNBC細(xì)胞對(duì)DTX的敏感性提供了新的研究思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] Jitariu AA, Campean AM, Ribatti D,etal. Triple negative breast cancer: the kiss of death[J]. Oncotarget, 2017, 8:46652- 46662.

[2] Li X, Wang LZ, Li A,etal. Dose modifications in Asian cancer patients with hepatic dysfunction receiving weekly docetaxel: A prospective pharmacokinetic and safety study[J]. Cancer Sci, 2016, 107:173- 180.

[3] Karag?z GE, Rüdiger SG. Hsp90 interaction with clients[J]. Trends Biochem Sci, 2015, 40:117- 125.

[4] Hommeyer SC, Freeny PC, Crabo LG,etal. Potenial prognostic value of heat-shock protein 90 in the presence of phosphatidylinositol-3-kinase overexpression or loss of PTEN, in invasive breast cancers[J]. Breast Cancer Res, 2010, 12:1- 10.

[5] Park Y, Lee KS, Park SY,etal. Potential prognostic value of histone deacetylase 6 and acetylated heat- shock protein 90 in early-stage breast cancer[J]. J Breast Cancer, 2015, 18:249- 255.

[6] Davidson B, Reinertsen KV, Trinh D,etal. BAG- 1/SODD, HSP70, and HSP90 are potential prognostic markers of poor survival in node-negative breast carcinoma[J]. Human Pathol, 2016, 54:64- 73.

[7] Ku S, Lasorsa E, Adelaiye R,etal. Inhibition of Hsp90 augments docetaxel therapy in castrate resistant prostate cancer[J]. PLoS One, 2014, 9:103- 128.

[8] Goss GD, Andric ZG, Bondarenko I,etal. A randomized study of ganetespib, a heat shock protein 90 inhibitor, in combination with docetaxel versus docetaxel alone for second-line therapy of lung adenocarcinoma (GALAXY- 1)[J]. J Clin Oncol, 2013, 31:2631- 2632.

[9] Jiang Y, Yang N, Zhang H,etal. Enhancedinvivoantitumor efficacy of dual-functional peptide-modified doce-taxel nanoparticles through tumor targeting and Hsp90 inhibition[J]. J Controlled Release, 2016, 221:26- 36.

[10] Huang W, Yuan X, Sun T,etal. Proteasome inhibitor YSY01A abrogates constitutive STAT3 signaling via down-regulation of Gp130 and JAK2 in human A549 lung cancer cells[J]. Front Pharmacol, 2017, 8:476- 487.

[11] Weis F, Moullintraffort L, Heichette C,etal. The 90-kDa heat shock protein Hsp90 protects tubulin against thermal denaturation[J]. J Biol Chem, 2010, 285:9525- 9534.

[12] Mohammadi A, Yaghoobi MM, Gholamhoseyniannajar A,etal. HSP90 inhibitor enhances anti-proliferative and apoptotic effects of celecoxib on HT- 29 colorectal cancer cells via increasing BAX/Bcl- 2 ratio[J]. Cell Mol Biol, 2016, 62:62- 74.