王 倩， 袁 敏， 陳志國(guó)， 卞 華△

(南陽(yáng)理工學(xué)院 1河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2張仲景國(guó)醫(yī)國(guó)藥學(xué)院， 河南 南陽(yáng) 473004； 3武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 湖北 武漢 430072)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，致死率在男性腫瘤和女性腫瘤中分別排第2位和第3位[1]。在中國(guó)，由于飲食結(jié)構(gòu)的特殊性，胃癌致死率在所有腫瘤死因中排第2位，嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的健康[2]。在所有胃癌患者中，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。眾所周知，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其過(guò)度激活能夠促進(jìn)其靶基因，如c-myc和cyclin D1等的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，而抑制其活性則可降低細(xì)胞的增殖和遷移能力[3-5]。視黃酸受體γ(retinoic acid receptor gamma，RARG)是核受體亞家族的成員。最近越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)RARG在許多腫瘤，如肝細(xì)胞癌、食管癌、膽管癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力密切相關(guān)。但是，RARG在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演著什么樣的角色，目前尚不清楚。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染技術(shù)，并用MTT和Transwell等實(shí)驗(yàn)探討RARG對(duì)胃癌細(xì)胞的活力和遷移能力的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

胃癌細(xì)胞系MGC-803購(gòu)自ATCC；SGC7901細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。FLAG和HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗RARG、β-catenin、c-Myc、cyclin D1、Twist、Snail和GAPDH抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 3000購(gòu)自Invitrogen；胰蛋白酶購(gòu)自索萊寶生物科技公司；MTT細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；Transwell小室購(gòu)自Corning；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；Dual-Luciferase? Reporter Assay System購(gòu)自Promega；Protein A/G瓊脂糖珠購(gòu)自Santa Cruz；空載體pFLAG-NC和pHA-NC均購(gòu)自Sigma；pFLAG-RARG和pHA-β-catenin質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，經(jīng)測(cè)序正確。

2 方法

2.1RARG干擾序列的設(shè)計(jì)及干擾載體的構(gòu)建 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索人RARG基因序列(NM_000966.5)，按照siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3條siRNA序列，見表1。將上述3條target sequences交由上海吉瑪公司構(gòu)建得到RARG的干擾載體(siR-RARG)以及陰性對(duì)照(siR-negative control,siR-NC)。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合度時(shí)，用胰蛋白酶消化后傳代至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%融合度時(shí)，按照Lipofectamine 3000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

表1靶向RARG基因的小干擾RNA序列

Table 1. Small interfering RNA sequences targeting theRARGgene

NameThesequenceRARG-homo-836Sense(5-3):GCCGAAGCAUCCAGAAGAATTAntisense(5-3):UUCUUCUGGAUGCUUCGGCTTRARG-homo-959Sense(5-3):CCAAGGAAGCUGUGCGAAATTAntisense(5-3):UUUCGCACAGCUUCCUUGGTTRARG-homo-1266Sense(5-3):CCAGAUCACUCUGCUCAAATTAntisense(5-3):UUUGAGCAGAGUGAUCUG-GTT

2.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種到96孔板，使待測(cè)細(xì)胞密度至每孔5 000個(gè)左右，轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒和空載體，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間0 h、24 h和48 h；每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h；終止培養(yǎng)，小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，在搖床上低速振蕩10 min，于570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(A)值。

2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，按每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種到Transwell小室中，其中上層小室為不含血清的細(xì)胞懸液，下層為500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS將小室洗3遍，然后用4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100通透細(xì)胞膜，加入DAPI溶液染色后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察拍照。

2.5TOP/FOPFlash雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將SGC7901細(xì)胞按每孔5 000個(gè)左右的密度接種到96孔板中，實(shí)驗(yàn)分為 pFLAG-RARG+TOP+pRL-TK組、pFLAG-RARG+FOP+pRL-TK組、pFLAG-NC+TOP+pRL-TK組和pFLAG-NC+FOP+pRL-TK組，按照上述分組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒到SGC7901細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞按Dual-Luciferase? Reporter Assay System試劑盒說(shuō)明書操作，記錄并分析數(shù)據(jù)。

2.6Western blot 收集各處理組細(xì)胞，利用RIPA蛋白裂解液聯(lián)合超聲細(xì)胞破碎儀使細(xì)胞完全破裂，12 000×g、4 ℃離心10 min，吸取上清液，通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取適量蛋白樣品加上樣緩沖液后，沸水煮5 min，離心后置于冰上。將40 μg各組蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Millipore)上。然后使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉膜1 h。封閉后，分別將膜與抗RARG、β-catenin、c-Myc、cyclin D1、Twist、Snail(Cell Signaling Technology，均1∶1 000倍稀釋)和GAPDH(Cell Signaling Technology，1∶5 000倍稀釋)抗體敷育過(guò)夜。用TBST緩沖液洗滌膜后，將膜與相應(yīng)的Ⅱ抗在室溫敷育1 h。最后，將膜用TBST洗滌3次，并使用BeyoECL Plus試劑盒通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。

2.7免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 將SGC7901細(xì)胞接種到100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)分為 pFLAG-RARG+pHA-β-catenin組和pFLAG-NC+pHA-β-catenin組，按照上述分組轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒到SGC7901細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液并放置于冰上裂解，4 ℃高速離心后取上清液，分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育1 h后，再加入Protein A/G瓊脂糖珠，4 ℃孵育過(guò)夜后，以4 ℃、3 000 r/min離心，棄去上清液，再用細(xì)胞裂解液輕柔洗滌沉淀中的Protein A/G瓊脂糖珠3次，最后加入蛋白上樣緩沖液，沸水煮5 min，通過(guò)Western blot檢測(cè)目的蛋白，確定結(jié)合蛋白。

2.8免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn) 將pFLAG-RARG和pEGFP-β-catenin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至SGC7901細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，再用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.5% Triton X-100通透細(xì)胞15 min，用山羊血清封閉液封閉30 min，敷育FLAG標(biāo)記的兔抗人Ⅰ抗4 ℃過(guò)夜，再用PE標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗敷育1 h，DAPI染細(xì)胞核10 min，最后通過(guò)熒光顯微鏡觀察拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。RARG在胃癌和正常組織中的表達(dá)水平差異，以及RARG敲減和過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組之間的比較均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)分析RARG表達(dá)水平與患者術(shù)后總生存率的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生物信息學(xué)分析RARG在胃癌和正常組織中的表達(dá)水平及其與胃癌患者總生存率的相關(guān)性

通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine和UCSC Cancer Genomics Browser分析胃癌和正常胃上皮組織中RARG的mRNA表達(dá)水平和DNA拷貝數(shù)的差異，結(jié)果顯示，與正常胃上皮組織相比，胃癌組織中RARG的mRNA表達(dá)水平增高，DNA拷貝數(shù)增加(P<0.05)。同時(shí)，Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，RARG的表達(dá)水平與胃癌患者的總生存率呈負(fù)相關(guān),見圖1。

Figure 1. The mRNA expression level (A, C) and DNA copy number (B) were analyzed by bioinformatics in Oncomine database and UCSC Cancer Genomics Browser database. The correlation of RARG expression level with gastric cancer patients’ overall survival probability was determined in Kaplan-Meier plotter database (D).

圖1生物信息學(xué)分析RARG在胃癌和正常組織中的表達(dá)水平及其與胃癌患者總生存率的相關(guān)性

2 采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RARG對(duì)胃癌細(xì)胞活力的影響

分別在SGC7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pFLAG-RARG和pFLAG-NC，結(jié)果顯示RARG表達(dá)上調(diào)能夠增加SGC7901細(xì)胞的活力；在MGC-803細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染靶向RARG的3個(gè)siRNA質(zhì)粒和陰性對(duì)照siR-NC，結(jié)果顯示敲減RARG能夠抑制MGC-803細(xì)胞的活力。其中，分別與同時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組相比，24 h的pFLAG-RARG組和siR-RARG組細(xì)胞活力的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，48 h的細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The viability of the SGC7901 cells with over-expression ofRARG(A) and the BGC-803 cells with knockdown ofRARG(B) measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFLAG-NC group;#P<0.05vssiR-NC group.

圖2MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RARG對(duì)胃癌細(xì)胞活力的影響

3 采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RARG對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

分別在SGC7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pFLAG-RARG和pFLAG-NC，結(jié)果顯示RARG表達(dá)上調(diào)能夠增加SGC7901細(xì)胞的遷移能力(P<0.05)；分別在MGC-803細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siR-RARG和siR-NC，結(jié)果顯示敲減RARG能夠抑制MGC-803細(xì)胞的遷移能力(P<0.05),見圖3。

Figure 3. The migration abilities of the SGC7901 cells with over-expression ofRARG(A) and the MGC-803 cells with knockdown ofRARG(B) measured by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFLAG-NC group;#P<0.05vssiR-NC group.

圖3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RARG對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

4 胃癌細(xì)胞中RARG對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

分別在SGC7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pFLAG-RARG和pFLAG-NC，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)RARG能夠顯著增加Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc、cyclin D1、Twist和Snail的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路；分別在MGC-803細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siR-RARG和siR-NC，結(jié)果顯示敲減RARG能夠顯著降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc、cyclin D1、Twist和Snail的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路,見圖4。

Figure 4. The effects of RARG expression level on the protein levels of Wnt/β-catenin signal pathway-related molecules in the SGC7901 cells with over-expression ofRARG(A) and in the BGC-803 cells with knockdown ofRARG(B) determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFLAG-NC group;#P<0.05vssiR-NC group.

圖4RARG對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

5 采用TOP/FOPFlash雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)RARG對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的影響

過(guò)表達(dá)RARG能夠顯著增加TOPFlash報(bào)告基因活性(P<0.05)，說(shuō)明RARG能夠顯著激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,見圖5。

6 胃癌細(xì)胞中RARG與β-catenin蛋白存在相互作用

通過(guò)RCSB Protein Data Bank(PBD)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.rcsb.org)分析RARG(PDB ID: 3LBD)和β-catenin(PDB ID: 3SLA)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站zdock(http://zdock.umassmed.edu/)預(yù)測(cè)得知RARG與β-catenin存在可能直接結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。另外，通過(guò)蛋白免疫共沉淀和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示RARG和β-catenin存在相互作用,見圖6。

Figure 5. Over-expression ofRARGenhanced the activity of TOP/FOPFlash dual-luciferase reporter gene in the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFLAG-NC group.

圖5TOP/FOPFlash雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)RARG對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的影響

Figure 6. RARG (inside the red dotted line) may interact with β-catenin (outside the red dotted line) based on protein structure (A). Co-IP (B) and immunofluorescence co-localization (C) assays showed that RARG may interact with β-catenin (×200).

圖6胃癌細(xì)胞中RARG與β-catenin蛋白存在相互作用

討 論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多基因共同參與的過(guò)程。同時(shí)伴隨著抑癌基因的失活、癌基因的激活，細(xì)胞周期紊亂、致癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活或抑癌信號(hào)通路的失活等病理過(guò)程的改變[2]。我國(guó)的胃癌發(fā)病率位居世界第二，而且往往由于診斷技術(shù)的局限和健康意識(shí)的淡薄等原因，使得大部分胃癌患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，預(yù)后非常差。因此，深入探討胃癌的發(fā)病機(jī)制，從而為胃癌的診斷以及治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)就顯得尤為重要。

關(guān)于RARG的研究由來(lái)已久，然而最近幾年越來(lái)越多的研究顯示RARG與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，目前的研究結(jié)果表明RARG在不同的腫瘤中扮演著不同的角色，可能是抑癌基因，也可能是癌基因。一方面，RARG可能作為癌基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。例如，在膽管癌中RARG過(guò)表達(dá)能夠激活A(yù)kt/NF-κB和Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖和遷移能力[6];同樣，RARG在肝癌組織中表達(dá)升高，RARG表達(dá)上調(diào)能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路，增加癌細(xì)胞的惡性程度[7-8];同時(shí)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中，RARG表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，并且能夠削弱維A酸對(duì)于肝癌的治療作用[9];在結(jié)直腸癌研究中，RARG過(guò)表達(dá)增加了結(jié)直腸癌細(xì)胞的多藥耐藥性，其機(jī)制可能是通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路而上調(diào)MDR1[10]。另一方面，RARG也被報(bào)道為抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲的腫瘤抑制因子。例如，RARG通過(guò)調(diào)節(jié)碳水化合物轉(zhuǎn)移酶10的表達(dá)，可以抑制黑色素瘤的侵襲能力[11];RARG的表達(dá)缺失能夠促進(jìn)v-Ha-Ras誘導(dǎo)的鱗狀細(xì)胞癌[12];最近有研究發(fā)現(xiàn)RARG在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低，揭示了RARG可以作為抑癌基因，通過(guò)抑制Hippo-Yap信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[13]。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析表明，在胃癌組織中RARG的mRNA表達(dá)水平增高，其表達(dá)增高可能與拷貝數(shù)的增加有關(guān)。在體外胃癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中RARG過(guò)表達(dá)或敲減能夠增加或減弱胃癌細(xì)胞的活力和遷移能力，同時(shí)能夠激活或抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，因此，我們推測(cè)在胃癌細(xì)胞中RARG表達(dá)上調(diào)通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)c-myc、cyclin D1、Twist和Snail等經(jīng)典癌基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的活力和遷移。

為了進(jìn)一步探討RARG對(duì)于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，我們分析了RARG和β-catenin的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)RARG和β-catenin蛋白可能存在相互作用。接下來(lái)，我們通過(guò)蛋白質(zhì)免疫共沉淀和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RARG和β-catenin蛋白確實(shí)存在相互作用，這個(gè)結(jié)果初步驗(yàn)證了我們的預(yù)測(cè)。而更進(jìn)一步地探討RARG和β-catenin蛋白的具體結(jié)合位點(diǎn)以及調(diào)控機(jī)制將是我們接下來(lái)研究的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過(guò)組織學(xué)和分子細(xì)胞學(xué)研究，揭示了RARG能夠通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，其基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演著癌基因的角色。更加重要的是，RARG在胃癌組織中表達(dá)明顯升高，而且其表達(dá)水平與胃癌患者的生存率呈負(fù)相關(guān)，提示RARG可以作為胃癌診斷及預(yù)后的分子標(biāo)志物。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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