胡東昊， 劉鳳云， 謝金枝， 李偉宏

(1焦作職工醫(yī)學(xué)院， 河南 焦作 454150； 2鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校， 河南 鄭州 450064)

在全球范圍內(nèi)，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直很高，環(huán)境污染、生活習(xí)慣和人口老齡化等多種因素導(dǎo)致全球腫瘤患者繼續(xù)增多。腫瘤的免疫治療是通過(guò)激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能來(lái)控制和殺死腫瘤細(xì)胞[1]，這是繼手術(shù)、化療和放療后一種有效的輔助治療。隨著腫瘤免疫治療的發(fā)展，這一治療方法越來(lái)越為人們看重。腫瘤的免疫治療具有特異性強(qiáng)和副作用小的優(yōu)點(diǎn)[2]。腫瘤的免疫治療和腫瘤多肽疫苗的研究的前提條件是找到有效的腫瘤抗原特異性CTL表位。黑色素瘤相關(guān)抗原C2(melanoma-associated antigen C2,MAGEC2)是一種新型癌-睪丸(cancer-testis，CT)抗原。在正常組織中，僅在睪丸中檢測(cè)到MAGEC2 的mRNA表達(dá)；但是在肝癌、惡性黑色素瘤和膀胱癌中具有高水平的MAGEC2表達(dá)[3-5]。用于腫瘤患者的肽疫苗目前正處于臨床研究的活躍階段。然而，基于肽的免疫治療受人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-A等位基因的高度限制。在中國(guó)人群中，HLA-A2超型占45%左右，HLA-A3超型超過(guò)50%[6]，所以尋找并鑒定MAGEC2的HLA-A3限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T-lymphocyte,CTL)表位對(duì)腫瘤的免疫治療具有重要意義。本次研究使用BIMAS、SYFPEITHI和IEDB等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行綜合預(yù)測(cè)[7-9]，篩選出綜合打分較高的表位，并通過(guò)鑒定篩選出MAGEC2的HLA-A3限制性CTL表位。

材 料 和 方 法

1 材料

T2A3細(xì)胞由焦作職工醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，采用37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由HLA-A3+健康供者捐贈(zèng)。HLA-A3+外周血健康供者來(lái)自醫(yī)院尋找的健康志愿者。

2 方法

2.1HLA-A3限制性CTL表位肽的預(yù)測(cè) 使用BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)和IEDB(http://tools.iedb.org/main/tcell/)軟件對(duì)MAGEC2氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)打分，CTL表位限制性MHC類型為HLA-A*03，預(yù)測(cè)抗原肽長(zhǎng)度為9 aa (nona-mers)。根據(jù)各個(gè)預(yù)測(cè)軟件所推選的前20個(gè)優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行綜合選擇，選出在各種軟件打分較好的HLA-A3超型限制性表位。

2.2HLA-A3限制性CTL表位肽的合成 候選表位肽由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)分析純化后，其純度>95%。采用電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)鑒定多肽，條件設(shè)置：噴霧器壓力為7.0或11.0 Psi；干燥器流速為4.0或8.0 L/min；溫度300 ℃；噴霧針電壓4.0 kV。G2025A Software A.02.01數(shù)據(jù)分析軟件檢測(cè)精肽的分子質(zhì)量。

2.3表位肽與HLA-A3分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn) 收集T2A3細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗3次，調(diào)整細(xì)胞密度至1×109/L，鋪于24孔板中(每孔1 mL)，每實(shí)驗(yàn)孔加入待測(cè)肽50 μmol/L和β2-微球蛋白(Merck)3 mg/L，37 ℃、5% CO2共孵育18 h后，冷PBA洗滌3次，加入500 μL稀釋度為1 ∶100的單克隆抗體(鼠抗人β2-微球蛋白)，4 ℃避光靜置40 min。之后冷PBA洗滌3次，加入50 μL稀釋度為1 ∶50的FITC-羊抗鼠抗體溶液，4 ℃靜置40 min，PBA洗滌1次后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用熒光系數(shù)(flourescence index，F(xiàn)I)表示。FI=(表位肽平均熒光強(qiáng)度-背景平均熒光強(qiáng)度)/背景平均熒光強(qiáng)度。FI>1.0表示高等結(jié)合力，0.5

2.4CTL的體外誘導(dǎo) 抽取20 mL健康志愿者血液，經(jīng)常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，獲取PBMCs，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×109/L。第2天分別加入10 mg/L的候選肽共培養(yǎng)，第3天加入3×104U/L的重組人白細(xì)胞介素2(recombinant interleukin-2，rIL-2；Promega)繼續(xù)培養(yǎng)。每周收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，除去上清液，加入新鮮的含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，同時(shí)加入上述條件的候選肽和rIL-2。刺激3輪后于最后 1 次刺激的第3天收集細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度作為效應(yīng)細(xì)胞，荷肽的T2A3細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度[11]。

2.5干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)分泌水平的檢測(cè) 取出酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)實(shí)驗(yàn)板條(購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)，加200 μL無(wú)血清的IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行封閉，靜置10 min；誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，荷肽的T2A3細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，細(xì)胞密度均調(diào)整為2×109/L；設(shè)立對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔；37 ℃、5% CO2孵育18 h；傾盡孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無(wú)菌的去離子水，4 ℃ 裂解細(xì)胞10 min；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×Washing Buffer 洗滌6次，每次停留60 s；加入 100 μL生物素標(biāo)記的抗體，37 ℃ 孵育1 h；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×Washing Buffer進(jìn)行洗滌，方法同上，在吸水紙上拍干；加入100 μL酶聯(lián)親和素，37 ℃ 孵育1 h；每孔加入200 μL 1×Washing Buffer進(jìn)行洗滌，方法同上；加入100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，25 ℃避光靜置30 min；結(jié)束后置于通風(fēng)處，室溫靜置干燥；結(jié)果用 ELISPOT 圖像分析儀計(jì)數(shù) 96 孔板中每孔的斑點(diǎn)數(shù)。

2.6乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)細(xì)胞毒活性檢測(cè) 調(diào)整CTL密度為5×109/L；荷肽的T2A3細(xì)胞作為靶細(xì)胞，調(diào)整靶細(xì)胞密度為1×108/L；按50 ∶1、25 ∶1和12.5 ∶1的不同效靶比鋪于96孔板中，同時(shí)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組、體積校正組和背景對(duì)照組，每孔終體積為100 μL。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h。于孵育結(jié)束前45 min，在靶細(xì)胞最大釋放組及體積校正組中加入10 μL裂解液。1 000 r/min離心4 min，轉(zhuǎn)移50 μL上清至另一干凈96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室溫避光孵育30 min；每孔再加入50 μL終止液。用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)。殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放A值-CTL自發(fā)釋放A值)/(靶細(xì)胞A值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放A值)×100%。

2.7羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)熒光染色檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 離心收集靶細(xì)胞，并將細(xì)胞重懸于含有1%FCS的PBS中，并將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至1×109/L。致敏靶細(xì)胞：每1 mL細(xì)胞懸浮液加入0.5 μL 5 mmol/L CFSE(購(gòu)自Sigma)，室溫，光照孵育4 min。對(duì)照靶細(xì)胞：每1 mL細(xì)胞懸液中加入0.5 μL 100 μmol/L CFSE，室溫，光照孵育4 min。將細(xì)胞用5% FCS-PBS洗滌1次，離心并除去上清液，將細(xì)胞重懸于無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應(yīng)細(xì)胞在無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基中洗滌1次，并以(1.25～5.00)×109/L的密度重懸于無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應(yīng)細(xì)胞與致敏的靶細(xì)胞(效靶比分別為12.5 ∶1、25 ∶1和50 ∶1)在離心管中混合，靶細(xì)胞數(shù)為2×104，在37 ℃溫育4 h 孵育后，用含有1% FCS和0.1%疊氮化鈉的PBS(FACS)處理相同效靶比的致敏靶細(xì)胞組和對(duì)照靶細(xì)胞組，并用FACS洗滌。離心，重懸在含4%多聚甲醛的PBS溶液中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。殺傷率(%)=(對(duì)照樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量-測(cè)試樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量)/對(duì)照樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)多組平均數(shù)之間的差別，采用SPSS 16.0標(biāo)準(zhǔn)版統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用GraphPad Prism軟件繪圖，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MAGEC2 HLA-A3限制性CTL表位的預(yù)測(cè)結(jié)果

為了預(yù)測(cè)MAGEC2開(kāi)放閱讀框中潛在的HLA-A3超型限制性CTL表位，我們依據(jù)BIMAS、SYFPEITHI和IEDB軟件的結(jié)果，選取在各個(gè)預(yù)測(cè)軟件中分值排名靠前的表位肽，根據(jù)這3個(gè)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行綜合打分，篩選出分值在各個(gè)軟件中打分較好的CTL表位肽，打分情況見(jiàn)表1。使用質(zhì)譜儀測(cè)定候選表位肽的分子量，結(jié)果顯示各多肽分子量測(cè)定值與理論值相符，表明合成的多肽是我們所需要的目的肽，見(jiàn)表2。

表1 MAGEC2 HLA-A3限制性CTL表位預(yù)測(cè)結(jié)果

2 表位肽與HLA-A3分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

T2A3結(jié)合力實(shí)驗(yàn)測(cè)試表位肽與HLA-A*03的結(jié)合能力。使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表明P147、P167、P196、P229和P251均具有較好的結(jié)合HLA-A*03的能力(FI>0.5)，見(jiàn)表2。

表2候選肽與HLA-A*03分子結(jié)合力結(jié)果

Table 2. The HLA-A*03 binding affinity of the peptides derived from MAGEC2

PeptideESI-MS[M+H]+CalculatedObservedFIP471046.21047.20.26P129937.9938.70.34P1401017.11018.50.37P1471103.41105.40.68P1671138.51139.30.76P1751122.41122.60.34P196950.0950.70.98P229996.3995.50.86P2321045.41046.50.45P251963.1964.20.88P2571035.11038.60.33HBcAg18-271155.31155.61.58

FI = [mean fluorescence intensity (MFI) of the peptide-MFI background]/MFI background.

3 IFN-γ分泌水平結(jié)果

為了檢測(cè)各表位肽是否可被MAGEC2抗原特異性的CD8+T細(xì)胞識(shí)別，根據(jù)結(jié)合力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇了較好結(jié)合力的多肽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示P167、P196和P251多肽疫苗能檢測(cè)到特異性T細(xì)胞免疫，能分泌較多的IFN-γ，見(jiàn)圖1。

Figure 1. ELISPOT assay was conducted to measure the IFN-γ release by CTLs induced from the PBMCs of healthy donors. CTLs induced by PBS and HBcAg18-27were taken as negative controls. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

圖1ELISPOT法檢測(cè)MAGEC2候選表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN-γ的能力

4 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)IFN-γ分泌水平結(jié)果，我們將有效果的P167、P196和P251進(jìn)行進(jìn)一步的免疫活性檢測(cè)；P196和P251這2條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50 ∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率較陰性對(duì)照組和無(wú)關(guān)肽組在效靶比為50 ∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率均顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

5 CFSE熒光染色檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

候選肽所誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL，隨著效靶比的提高殺傷效果相應(yīng)得到提高，P196和P251這2條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)荷肽T2A3細(xì)胞的殺傷率分別較陰性對(duì)照組和無(wú)關(guān)肽組顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

討 論

隨著社會(huì)發(fā)展，日益突出的環(huán)境問(wèn)題及人們生活方式的改變引發(fā)了一系列的健康問(wèn)題，其中最為令人關(guān)注的問(wèn)題之一就是有著上升趨勢(shì)的腫瘤發(fā)病率。腫瘤的手術(shù)摘除及放療、化療的聯(lián)合應(yīng)用在臨床治療上有一定的治愈率，但術(shù)后的復(fù)發(fā)率及毒副作用也是困擾人們的問(wèn)題之一。特別是惡性腫瘤，其高轉(zhuǎn)移性更是令人們束手無(wú)策。而隨著生物信息學(xué)及分子免疫學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)人體免疫系統(tǒng)有了更深的認(rèn)識(shí)，利用自身免疫系統(tǒng)來(lái)治療疾病已經(jīng)成為可能。腫瘤的免疫治療作為一種新興的腫瘤治療方式引起了更多的關(guān)注[12-13]。

Figure 2. Specific lysis of target cells by the CTLs generated from the PBMCs of healthy donors. The levels of LDH release were detected.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

圖2候選肽P196和P251誘導(dǎo)得到的CTL在不同效靶比時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷情況

Figure 3. Detection of antigen-specific cytotoxicity by FACS-CTL assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

圖3CFSE法檢測(cè)特異性CTL的體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

腫瘤疫苗作為腫瘤生物治療的重要組成部分，為腫瘤的治療和預(yù)防開(kāi)辟了新途徑。近年來(lái)腫瘤疫苗的研究在國(guó)內(nèi)外逐漸受到重視，并且得到了十分迅速的發(fā)展[14]。腫瘤疫苗的基本原理是通過(guò)激活患者自身的免疫系統(tǒng)，主要通過(guò)利用腫瘤細(xì)胞和腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫或者體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力，阻止腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，最終達(dá)到清除或抑制腫瘤的目的[15]。多肽疫苗近年來(lái)已經(jīng)獲得了很多關(guān)注，在對(duì)抗腫瘤和病毒疾病是一種有效且安全的治療方式。針對(duì)腫瘤抗原的研究表明，在腫瘤細(xì)胞表面存在許多抗原多肽，這些抗原多肽可以有效地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列針對(duì)該腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)[16]。通過(guò)對(duì)腫瘤抗原編碼基因的序列分析，篩選其被 CD8+T淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原表位，構(gòu)建多肽疫苗，能夠加強(qiáng)HLA 和 TCR 的結(jié)合，而且還可以通過(guò)氨基酸替換、改變肽的構(gòu)象以及修飾氨基酸殘基等方法提高肽的免疫原性[17]。

近年來(lái)的研究報(bào)道顯示，用表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤抗原的 CTL 表位肽刺激機(jī)體可以很好的產(chǎn)生抗原特異性的 CTL 細(xì)胞，進(jìn)而參與針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答并發(fā)揮出較好的抗腫瘤效應(yīng)。反向免疫學(xué)方法被廣泛應(yīng)用，并被證明是鑒定腫瘤相關(guān)肽的有效方法[18]。使用這種方法，已經(jīng)從人類TAA鑒定了大量的CD8+T細(xì)胞表位，例如PBF[19]，PIWIL2[20]和MUC4[21]等。生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)腫瘤表位，可以減少實(shí)驗(yàn)的盲目性，對(duì)前期實(shí)驗(yàn)的篩選很有幫助。BIMAS軟件是依據(jù)肽-MHC分子復(fù)合物的分裂半衰期原理來(lái)預(yù)測(cè)HLA限制性表位；SYFPEITHI軟件則是基于表位肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)及與MHC結(jié)合的長(zhǎng)度和結(jié)和力等因素的預(yù)測(cè)手段。IEDB是基于序列的線性表位預(yù)測(cè)工具。因此將SYFPEITHI和BIMAS的預(yù)測(cè)結(jié)果結(jié)合然后綜合IEDB表位預(yù)測(cè)軟件打分結(jié)果分析。3種不同的在線預(yù)測(cè)軟件的使用，可以提高表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

在本次研究中， P196和P251的免疫原性已在體外實(shí)驗(yàn)中展示，結(jié)果顯示P196和P251能有效誘導(dǎo)MAGEC2+HLA-A3+限制性CTL，能夠識(shí)別和裂解自然遞呈野生型MAGEC2表位的靶細(xì)胞。但其在體內(nèi)抗腫瘤免疫誘導(dǎo)中的效力仍有待確定。腫瘤表位肽在腫瘤治療中發(fā)揮了重要作用，但應(yīng)該加大力度提高其治療潛力[22-23]。我們應(yīng)該繼續(xù)探索具有抗腫瘤特性的新型表位肽，通過(guò)開(kāi)發(fā)更多的肽庫(kù)和新技術(shù)來(lái)提高肽的腫瘤靶向能力。通過(guò)開(kāi)發(fā)具有非天然氨基酸的新型肽，以提高其高度特異性和有效抗腫瘤活性，從而克服天然肽半衰期短的缺點(diǎn)。我們應(yīng)該設(shè)計(jì)更可靠和有效的修飾策略，以提高生物活性肽的抗癌效果和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。納米技術(shù)也可以用于表位肽藥物的開(kāi)發(fā)，它可以使表位肽持續(xù)釋放或者具有靶向功能[24]。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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