黃煒平， 李 可， 劉愛軍， 陳東風(fēng)， 王洪琦

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告》指出近十年來居民膳食脂肪功能比超過30%，由肥胖引起的一系列嚴(yán)重合并癥如高血壓病和胰島素抵抗等對人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。肥胖是由于脂肪細(xì)胞的數(shù)量增多和體積增大所致，而脂肪細(xì)胞已被證實來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)。BMSCs是一類來源于中胚層的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，具有高度的增殖能力，易純化，均一性好，又因其低免疫源性和可移植性，被認(rèn)為是組織工程學(xué)的種子細(xì)胞，在細(xì)胞移植和基因治療方面得到廣泛關(guān)注[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中藥在調(diào)控BMSCs成脂分化中發(fā)揮積極作用[3-6]，芥子堿(sinapine)作為輕身藥萊菔子的有效成分，對BMSCs成脂分化的作用尚未見到相關(guān)報道?？紤]氧化應(yīng)激會增加不正常脂肪細(xì)胞的形成進(jìn)而加大肥胖的發(fā)生率[7-8]，因而本實驗采用低濃度過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)BMSCs成脂分化作為模型，旨在探討中藥單體芥子堿對氧化應(yīng)激引起B(yǎng)MSCs向脂肪細(xì)胞分化的影響，進(jìn)一步了解芥子堿的藥理作用。

材 料 和 方 法

1 實驗材料與儀器

SPF級雄性SD大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(粵)2013-0034， 使用程序符合《廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會章程》。

芥子堿硫氰酸鹽購自廣東省藥品檢驗所(編號62.111702，CAS No.: 7431-77-8)；DMEM低糖培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清和0.25% EDTA-胰蛋白酶均購自Gibco；SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基購自賽業(yè)生物科技有限公司； 抗CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5和CD90-PE流式抗體購自Abcam；CCK-8試劑盒購自Dojindo；油紅O粉末購自Sigma；蘇木素染色液由廣州中醫(yī)藥大學(xué)張賽霞老師提供；30% H2O2購自天津市精細(xì)化學(xué)制劑廠；抗過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)抗體購自Santa Cruz；抗葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4, Glut4)抗體購自Abclonal； 抗脂肪細(xì)胞蛋白2(adipocyte protein 2，aP2)抗體、 HRP標(biāo)記的羊抗免IgG和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購自Abcam；抗β-actin抗體(貨號M0627)購自博士德公司；引物購自上海生工；TRIzol總RNA抽提試劑、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和GeneRuler 100 bp DNA Ladder均購自Thermo Fisher；Talent qPCR PreMix(SYBR Green)購自Tiangen。

移液器(Eppendorf)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo 150i)；倒置顯微鏡(Motic AE2000)；流式細(xì)胞儀(BD)；多功能酶標(biāo)儀(EnSpire)；圖像分析系統(tǒng)(Olympus)；紫外分光光度計(BioSpec-Nano)；電泳轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad)；PCR儀(Bio-Rad T100)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96)；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀(Tanno 5200)等。

2 方法

2.1大鼠BMSCs的獲取 選取60～80 g健康雄性SD大鼠，乙醇浸泡15 min后采用頸椎脫位法處死大鼠，碘伏消毒手術(shù)暴露骨髓腔，用10 mL注射器抽吸含1%雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)吹打骨髓腔，吸取含骨髓的培養(yǎng)基于15 mL離心管常溫離心(1 000 r/min)8 min，棄上清，獲取細(xì)胞。所獲取的BMSCs采用全骨髓培養(yǎng)法，將細(xì)胞用含10% FBS和1%抗生素的專用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，24 h后半量換液，96 h后全量換液，此后每隔2～3 d換液。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況以及有無污染等并拍照。

2.2鑒定BMSCs表面標(biāo)志物 待P3細(xì)胞長至融合90%左右，常規(guī)消化細(xì)胞并離心(1 000 r/min) 8 min，棄上清。預(yù)冷PBS洗滌2遍并離心棄上清，500 μL PBS重懸細(xì)胞(此時細(xì)胞數(shù)至少為1.0×106以上)，實驗分為空白對照組、同型對照組和實驗組。每個流式管中分別吸取細(xì)胞懸液50 μL并加入不同標(biāo)記抗體5 μL。室溫避光孵育30 min，2 mL PBS溶液洗滌2遍以除去未結(jié)合抗體。離心后垂直倒掉上清液，分別用200 μL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。實驗重復(fù)3次，用FlowJo 7.6軟件分析數(shù)據(jù)。

2.3CCK-8法檢測芥子堿對BMSCs的毒性作用 取對數(shù)生長期BMSCs(P3)按照細(xì)胞密度每孔4.0×103接種于96孔板，待細(xì)胞融合70% 以上，棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加入含藥芥子堿的條件培養(yǎng)基，設(shè)置濃度梯度為5、10、20、40、80、160和320 μmol/L，同時設(shè)單細(xì)胞懸液不加藥物的正常對照(normal control)組及無細(xì)胞培養(yǎng)液的空白對照(blank control)組。孵育24 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液和100 μL新鮮完全培養(yǎng)基，混勻后置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，多功能酶標(biāo)儀于490 nm處檢測吸光度，實驗重復(fù)3次，每組6個復(fù)孔。

2.4BMSCs成脂分化模型的建立和實驗分組設(shè)計 實驗中模型的建立參照文獻(xiàn)[9-10]并作修改，選取生長狀態(tài)良好的BMSCs，待其生長融合85%左右，采用含H2O2無血清培養(yǎng)基(終濃度200 μmol/L)誘導(dǎo)BMSCs 1 h之后棄誘導(dǎo)液，更換成條件培養(yǎng)基。整體實驗設(shè)計分組如下：正常對照(control)組、H2O2模型(model)組和芥子堿(sinapine)組。模型組和芥子堿組用無血清培養(yǎng)基稀釋H2O2進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)，同時正常對照組加上相同體積的無血清培養(yǎng)基統(tǒng)一條件。1 h后正常對照組和模型組更換成完全培養(yǎng)基，芥子堿組換成含藥培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行檢測。

2.5油紅O染色實驗及半定量分析 按照每孔1.0×105的密度將細(xì)胞接種于24孔板中，孵育結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min。棄固定液，PBS洗2遍，每孔加入適量60%異丙醇，室溫放置5 min。完全棄掉異丙醇，每孔加入300 μL 60%油紅O工作液，室溫放置25 min?？焖偃サ粲图t染料，60%異丙醇速洗1遍，雙蒸水洗3遍。棄雙蒸水，蘇木素染色15 s 后棄染色液，自來水洗3～4遍，甘油明膠封片。在圖像分析系統(tǒng)下觀察并隨機(jī)選取5個視野拍攝照片。半定量分析不進(jìn)行蘇木素染色，油紅染色結(jié)束并洗去多余染料后加入300 μL 100%異丙醇，在搖床中放置10 min，使細(xì)胞內(nèi)的油紅充分溶解，用移液器吸50 μL混合液于96孔板中，同時設(shè)立陰性對照組，多功能酶標(biāo)儀于570 nm處檢測吸光度，實驗重復(fù)3次，每組5個復(fù)孔。

2.6Western blot測PPARγ、aP2和Glut4的蛋白表達(dá) 棄舊液，預(yù)冷PBS洗2遍，加入適量裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)用刮刀收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，冰上裂解30 min，超聲5 min，離心(12 000 r/min)15 min，取上清，BCA蛋白定量將樣品濃度調(diào)整一致后煮沸變性。蛋白樣品30～50 μg于10%分離膠中電泳(條件為80 V 30 min、120 V 60 min)；濕轉(zhuǎn)(條件為300 mA 80 min)于PVDF膜上。室溫封閉 2 h，I 抗4 ℃過夜或者室溫孵育2 h；TBST洗脫6次，每次5 min， 加入II抗室溫孵育1 h；TBST洗脫6次，每次5 min, 后曝光。所有抗體用5% BSA稀釋，比例參照說明書。ECL化學(xué)發(fā)光工作液配合天能全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀曝光條帶。應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件分析各組條帶灰度值后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.7qPCR法檢測PPARγ、aP2和Glut4的mRNA表達(dá) 采用經(jīng)典TRIzol-氯仿的方法抽提總RNA，檢測濃度和純度后，取1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，具體方法按照說明書操作。逆轉(zhuǎn)錄條件為 65 ℃ 反應(yīng)5 min，結(jié)束后置于冰上，此后是42 ℃ 反應(yīng)60 min，升溫至70 ℃ 反應(yīng)5 min，降溫至4 ℃。qPCR采用一步法，具體操作參照說明書。反應(yīng)體系為15 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性反應(yīng)3 min; 95 ℃變性反應(yīng)5 s、60 ℃退火/延伸反應(yīng)15 s，采集熒光信號并循環(huán)40次，最后繪制熔解曲線。采用2-ΔΔCt法分析統(tǒng)計各基因表達(dá)差異。引物序列見表1。

表1 qPCR的引物序列

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)輸入Excel 2016、SPSS 20、GraphPad Prism 7統(tǒng)計軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計作圖，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，樣品多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞術(shù)鑒定

倒置顯微鏡下觀察體外分離所培養(yǎng)的原代大鼠BMSCs，P0和P1細(xì)胞混雜造血干細(xì)胞，經(jīng)過換液傳代，鏡下觀察細(xì)胞貼壁速度較快，呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞外觀，大部分為梭形，見圖1A；隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)、排列趨于一致，大量擴(kuò)增后可見漩渦狀排列，見圖1B。流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代BMSCs，結(jié)果顯示BMSCs高表達(dá)CD29、CD44和CD90，低表達(dá)CD45，其陽性率分別為99.79%、89.77%、99.41%和3.76%，證明按照上述方法培養(yǎng)BMSCs，至第3代細(xì)胞純度較高，未見分化，可用于下一步實驗，見圖1C。

2 CCK-8法檢測芥子堿對BMSCs的毒性作用

不同濃度的芥子堿對BMSCs作用24 h后對細(xì)胞活性有不同的影響。結(jié)果提示當(dāng)藥物濃度<40 μmol/L，芥子堿對BMSCs的活力影響較??；當(dāng)藥物濃度>40 μmol/L，隨著芥子堿藥物濃度的升高，BMSCs的活力明顯被抑制(P<0.01)，見圖2A。在此基礎(chǔ)上，對藥物芥子堿低濃度范圍內(nèi)再次進(jìn)行CCK-8實驗，結(jié)果顯示與正常對照組比較，濃度為15 μmol/L時，芥子堿對BMSCs的活力影響最小，見圖2B。為確定芥子堿對BMSCs成脂分化的最佳有效濃度，選取5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L 4個濃度進(jìn)行油紅O半定量實驗。

Figure 1. Culture and identification of BMSCs. A: BMSCs, P3 (×200); B: large numbers of expanded BMSCs, P3 (×100); C: flow cytometric analysis.

圖1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

Figure 2. The toxicity of sinapine at different concentrations on the BMSCs. A: high concentration range; B: low concentration range. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2CCK-8法檢測不同濃度芥子堿硫氰酸鹽對BMSCs的毒性作用

3 油紅O半定量及染色實驗分析H2O2及芥子堿對BMSCs的影響

油紅O半定量結(jié)果顯示，H2O2模型組與正常對照組比較吸光度增加，提示H2O2明顯促進(jìn)BMSCs成脂分化，脂滴含量明顯較多；而與模型組比較，隨著芥子堿藥物濃度的增加，BMSCs成脂分化的趨勢明顯受到抑制，見圖3A。結(jié)合CCK-8實驗結(jié)果，最終選取芥子堿濃度15 μmol/L進(jìn)行實驗。另外油紅O染色結(jié)果顯示，相對于正常未分化的BMSCs，經(jīng)過H2O2誘導(dǎo)1 h后，包繞在細(xì)胞核周圍的脂滴數(shù)量明顯增多，更為直觀地提示H2O2可促進(jìn)BMSCs成脂分化；而藥物芥子堿濃度15 μmol/L作用細(xì)胞24 h后脂滴數(shù)量明顯減少，提示芥子堿抑制由H2O2誘導(dǎo)的BMSCs成脂分化過程，見圖3B。

Figure 3. Oil Red O assay. A: the optimum and effective concentration of sinapine was selected by Oil Red O semi-quantitative assay; B: observation of the effect of sinapine at 15 μmol/L on the adipogenic differentiation of BMSCs induced by H2O2(×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖3油紅半定量及染色實驗結(jié)果

4 芥子堿對H2O2誘導(dǎo)BMSCs成脂分化過程中PPARγ、aP2和Glut4的影響

以aP2、PPARγ和Glut4的表達(dá)情況來分析芥子堿作用于BMSCs 24 h后對其成脂分化的影響。Western blot結(jié)果顯示相對于正常對照組，H2O2模型組中aP2、PPARγ和Glut4的蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.01)；而相比較H2O2模型組，芥子堿降低aP2、PPARγ和Glut4的表達(dá)(P<0.05)，見圖4A。qPCR結(jié)果同樣顯示在轉(zhuǎn)錄層面，H2O2模型組中aP2、PPARγ和Glut4基因的mRNA水平明顯高于正常對照組(P<0.01)和加藥芥子堿組(P<0.01)，其中對PPARγ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控最為明顯，見圖4B。Western Blot和qPCR結(jié)果均提示芥子堿能夠降低H2O2誘導(dǎo)的BMSCs中脂肪分化相關(guān)蛋白的表達(dá)。

討 論

1 H2O2可以促使BMSCs向脂肪細(xì)胞分化

肥胖會增加患心臟病、中風(fēng)和糖尿病等疾病的風(fēng)險，有資料明確表明氧化應(yīng)激、肥胖和脂肪細(xì)胞這三者之間關(guān)系密切，氧化應(yīng)激的增加會加速脂肪的累積進(jìn)而引發(fā)代謝綜合征，因而脂肪組織中的氧化還原狀態(tài)是肥胖相關(guān)代謝綜合征的一個潛在治療靶點[10]?；诖?，本研究利用H2O2創(chuàng)造氧化應(yīng)激環(huán)境以促進(jìn)BMSCs成脂分化作為模型。前期已有文獻(xiàn)報道低濃度H2O2誘導(dǎo)1 h對BMSCs增殖沒有影響[11]，而后續(xù)補充的油紅O、qPCR以及Western blot實驗結(jié)果證明該模型的可行性。

2 芥子堿可以抑制BMSCs成脂分化，可能與其能夠抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)相關(guān)

中醫(yī)理論認(rèn)為肥胖之人身重氣虛，不良于行，因而中藥的功效中有了“輕身”這一詞。萊菔子最早見于《日華子本草》，是十字花科植物萊菔的成熟種子，為健脾輕身藥的一種，有降氣化痰和消食除脹之功?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)芥子堿廣泛存在于十字花科植物中，其在自然界常與有機(jī)酸結(jié)合成鹽的形式存在，其中以芥子堿硫氰酸鹽的形式存在最為廣泛。芥子堿具有抗氧化、抗輻射、抗衰老、抗增殖、抗凋亡、降血壓及促進(jìn)腸胃蠕動等作用[12-18]。又有研究表明芥子堿硫氰酸鹽作為萊菔子水溶性生物堿的主要成分，能夠提高高密度脂蛋白膽固醇的含量，進(jìn)而增強(qiáng)血脂代謝能力[19-20]。本實驗通過檢測不同濃度的芥子堿作用于細(xì)胞24 h后的光吸收度，結(jié)果提示芥子堿在濃度<40 μmol/L條件下對BMSCs幾乎沒有毒性，對其增殖抑制沒有顯著影響；隨后采用H2O2誘導(dǎo)BMSCs成脂分化作為模型，通過油紅O半定量及染色實驗又發(fā)現(xiàn)芥子堿組脂滴數(shù)量減少，光吸收度降低，細(xì)胞形態(tài)逐漸呈纖維狀。提示芥子堿能夠逆轉(zhuǎn)氧化反應(yīng)形成的脂質(zhì)化，明顯抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞方向分化。

Figure 4. The effects of sinapine on the expression of aP2, PPARγ and Glut4 at mRNA and protein levels in H2O2-induced BMSCs. A: Western blot for determining the relative protein expression of aP2, PPARγ and Glut4 in the BMSCs (n=4); B: qPCR for detecting the relative mRNA expression of aP2, PPARγ and Glut4 in the BMSCs (n=3). Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖4芥子堿硫氰酸鹽對H2O2誘導(dǎo)BMSCs成脂分化過程中aP2、PPARγ和Glut4表達(dá)的影響

芥子堿結(jié)構(gòu)的苯環(huán)帶有羥基可形成化合物酚，酚類化合物具有清除氧自由基抗氧化作用，近年來有研究揭示芥子堿是一種非常有價值的天然抗氧化劑。人類疾病中如腫瘤、血管硬化及衰老等現(xiàn)象都涉及脂質(zhì)過氧化作用，生物堿降血脂一般通過提高高密度脂蛋白膽固醇含量、抑制脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)抗氧化酶活性等途徑降低血脂[21]，因而我們推測芥子堿亦可能是通過上述途徑抑制BMSCs成脂分化。

3 芥子堿可以抑制BMSCs成脂分化，其機(jī)制或與AMPK和PPARγ信號通路有關(guān)

BMSCs具有多向分化潛能，給予適當(dāng)?shù)臈l件，細(xì)胞便可以定向分化，本研究通過流式細(xì)胞鑒定術(shù)可以鑒定原代BMSCs培養(yǎng)至第3代，其純度高且細(xì)胞未分化。有研究報道，在完全分化的脂肪細(xì)胞中，PPARγ即使被敲低細(xì)胞仍然能保留其脂肪細(xì)胞的表型，表明在完全分化的脂肪細(xì)胞中，PPARγ可能不是維持脂肪細(xì)胞表型的必要條件，另外通過雙重siRNA干擾方法，發(fā)現(xiàn)了PPARγ功能的缺失正是由Glut4和Glut1介導(dǎo)引起的[22]。除此之外有實驗通過構(gòu)建shRNA腺病毒載體靶向PPARγ基因，發(fā)現(xiàn)該載體能夠有效阻斷BMSCs或者3T3-L1等未完全分化細(xì)胞內(nèi)PPARγ mRNA表達(dá)進(jìn)而抑制其成脂分化，并且Glut4的表達(dá)亦有下調(diào)[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)在早期未分化的BMSCs中可觀察到PPARγ與C/EBPα關(guān)系密切，同時介導(dǎo)aP2的轉(zhuǎn)錄并互為正反饋調(diào)控促進(jìn)BMSCs成脂分化[24-25]。在本次研究中發(fā)現(xiàn)芥子堿對BMSCs成脂分化的一些關(guān)鍵基因的表達(dá)具有影響。Western blot和qPCR提示與正常未分化的BMSCs相比，芥子堿組中aP2、PPARγ和Glut4表達(dá)量變化不一致，但明顯低于模型組。

將PPARγ、aP2和Glut4通過蛋白富集分析發(fā)現(xiàn)，Glut4位于AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號通路，aP2位于PPARγ信號通路，三者均是BMSCs成脂分化中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，主要功能體現(xiàn)在正向調(diào)控棕色脂肪細(xì)胞的分化[26]。早期有報道AMPK與PPARγ信號通路在3T3-L1細(xì)胞成脂分化中存在相互交叉的關(guān)系，共同調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的形成[27]。芥子堿能夠抑制BMSCs成脂分化，其機(jī)制可能與AMPK和PPARγ信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究采用低濃度H2O2誘導(dǎo)BMSCs建立成脂分化細(xì)胞模型，芥子堿作用于該模型可明顯抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞分化，但其具體機(jī)制尚未明確，上述兩種推測有待進(jìn)一步實驗證明。

致謝：流式細(xì)胞術(shù)檢測由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院流式細(xì)胞室工作人員完成，感謝科室老師的幫助！

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Schrepfer S, Deuse T, Lange C, et al. Simplified protocol to isolate, purify, and culture expand mesenchymal stem cells[J]. Stem Cells Dev, 2007, 16(1):105-107.

[2] Phinney DG, Pittenger MF. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy[J]. Stem Cells, 2017, 35(4):851-858.

[3] 張志峰， 陳 嘉， 葉偉洪， 等. 壯骨強(qiáng)筋片含藥血清對老年大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2013, 30(3):352-356.

[4] 程志安， 韓 凌， 危建安， 等. 六味地黃丸、金匱腎氣丸及健骨二仙丸含藥血清對BMSCs成脂、成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2013, 33(2):261-265.

[5] 齊振熙， 李樹強(qiáng)， 于 濤. 土鱉蟲含藥血清干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化[J]. 中國組織工程研究, 2013, 17(14):2597-2602.

[6] 齊振熙， 張占勇， 萬 甜， 等. 葛根素干預(yù)激素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的Wnt信號途徑[J]. 中國組織工程研究, 2014, 18(10):1502-1507.

[7] Kanda Y, Hinata T, Kang SW, et al. Reactive oxygen species mediate adipocyte differentiation in mesenchymal stem cells[J]. Life Sci, 2011, 89(7-8): 250-258.

[8] Turker I, Zhang Y, Zhang Y, et al. Oxidative stress as a regulator of adipogenesis[J]. FASEB J, 2007, 21(6): A1053.

[9] 張 婭， 陳民佳， 朱 明， 等. 低濃度H2O2預(yù)處理增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活力[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2016, 36(3):342-347.

[10] Furukawa S, Fujita T, Shimabukuro M, et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome[J]. J Clin Invest, 2004, 114(12):1752-1761.

[11] 周健洪, 黎 暉, 宋述財, 等. 過氧化氫對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2005, 26(9): 1199-1200.

[12] Li X, Han L, Li Y, et al. Protective effect of sinapine against hydroxyl radical-induced damage to mesenchymal stem cells and possible mechanisms[J]. Chem Pharma Bull, 2016, 64(4): 319-325.

[13] 黃德娟， 徐巍越， 黃德超. 花椰菜芥子堿對果蠅輻射的保護(hù)作用[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2009, 31(6):588-590.

[14] 李 群， 顧瑞琦. 十字花科植物中的芥子堿對果蠅的抗衰老作用[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 1999, 5(1): 32-35.

[15] Guo Y, An H, Feng L, et al. Sinapine as an active compound for inhibiting the proliferation of Caco-2 cells via downregulation of P-glycoprotein[J]. Food Chem Toxicol, 2014, 67(5):187-192.

[16] Yang CY, He L. Neuroprotective effects of sinapine on PC12 cells apoptosis induced by sodium dithionite[J]. Chin J Nat Med, 2008, 6(3):205-209.

[17] 丁 韻， 盧 軒， 王惠國， 等. 芥子堿氯化鹽的制備及其對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2013, 42(5):60-62.

[18] 朱立俏， 盛華剛， 周洪雷. 萊菔子水提液中芥子堿硫氰酸鹽在大鼠小腸的吸收特性研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2014, 25(4):459-462.

[19] 張國俠， 蓋國忠. 萊菔子總生物堿對Apo E基因敲除小鼠血脂的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2010, 30(6):844-845.

[20] 王 群， 孫忠迪， 劉 梅， 等. 炒萊菔子中芥子堿對高血脂大鼠血脂水平的影響[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2013, 42(5):60-62.

[21] 潘繼勛. 中藥有效成分降血脂作用研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)藥前沿, 2016, 6(13):17-19.

[22] Liao W, Nguyen MT, Yoshizaki T, et al. Suppression of PPAR-γ attenuates insulin-stimulated glucose uptake by affecting both GLUT1 and GLUT4 in 3T3-L1 adipocytes[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2007, 293(1):E219-E227.

[23] 馮志尉， 鄧云平， 趙 慧， 等. shRNA干擾PPARγ基因表達(dá)預(yù)防兔激素性股骨頭壞死的研究[J]. 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2017, 12(2):127-132.

[24] Payne VA, Au WS, Lowe CE, et al. C/EBP transcription factors regulateSREBP1cgene expression during adipogenesis[J]. Biochem J, 2009, 425(1):215-224.

[25] Nguyen TTN, Ha TT, Nguyen TH, et al. Peptide fraction pOh2 exerts antiadipogenic activity through inhibition of C/EBP-α and PPAR-γ expression in 3T3-L1 adipocytes[J]. Biomed Res Int, 2017, 2017:4826595.

[26] Li Y, Rong Y, Bao L, et al. Suppression of adipocyte differentiation and lipid accumulation by stearidonic acid (SDA) in 3T3-L1 cells[J]. Lipids Health Dis, 2017, 16:181.

[27] Jiang S, Wang W, Miner J, et al. Cross regulation of sirtuin 1, AMPK and PPARγ in conjugated linoleic acid treated adipocytes[J]. PLoS One, 2012, 7(11):e48874.