靳 文， 張根葆,2△， 高恬媛， 桑金鳳

(皖南醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室， 2蛇毒研究所， 安徽 蕪湖 241002)

尖吻蝮蛇毒蛋白C 激活劑(Agkistrodonacutusvenom protein C activator，PCA)是從皖南蝮蛇和尖吻蝮蛇蛇毒中分離、純化得到的一種蛋白C激活劑，用于抗凝實(shí)驗(yàn)的研究[1]。血栓性疾病是臨床上的常見(jiàn)病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康[2]。血栓的形成是多因素的(如手術(shù)、外傷、敗血癥、腫瘤及充血性心力衰竭等)，研究表明，各因素導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)損傷后，大量組織因子(tissue factor，TF)合成與釋放，以致凝血途徑被激活是血栓性疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素[3]。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為一種炎癥致病因子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF[4]。有報(bào)道認(rèn)為，LPS引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)度分泌TF，主要是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6，TRAF6)泛素化激活轉(zhuǎn)錄途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的[5-7]。而人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞TF的表達(dá)主要是由于核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)家族p65和活化蛋白1(activator protein-1，AP-1)家族Fos-Jun異二聚體的激活所致[8]。本實(shí)驗(yàn)室已證實(shí)PCA可抑制LPS損傷的VECs合成分泌TF，保護(hù)VECs，發(fā)揮抗凝作用[9]。因此，推測(cè)PCA減少TF的合成分泌，可能是通過(guò)抑制核因子的活化和TF基因的表達(dá)有關(guān)。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[10]，本實(shí)驗(yàn)選取1.25 mg/L PCA作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，通過(guò)觀(guān)察PCA對(duì)HUVECs活性、TRAF6活化、NF-κB p65、c-Fos、c-Jun蛋白及TF基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討PCA減少TF分泌的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

皖南五步蛇蛇毒PCA組份由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供；DMEM完全培養(yǎng)基和PBS緩沖液(Thermo)；0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA、青霉素-鏈霉素雙抗、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、SDS-PAGE凝膠試劑盒、Western blot半干轉(zhuǎn)膜液、超敏ECL發(fā)光液和PMSF試劑(江蘇碧云天)；胎牛血清(杭州四季青公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)和DAB顯色試劑盒(博士德)；LPS、MTT和DMSO(Sigma)； 本實(shí)驗(yàn)所用I抗(Abcam)；引物(上海生工生物工程公司)；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒(TIANGEN)；人TF因子ELISA試劑盒(上海源葉生物有限公司)；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)生化分析純。超凈工作臺(tái)(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；5% CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；熒光倒置顯微鏡(Olympus)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺公司)；恒溫水浴箱(上海醫(yī)用設(shè)備廠(chǎng))；酶標(biāo)儀(Sunrise)；電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、qPCR儀和ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 HUVECs購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)，取長(zhǎng)滿(mǎn)80%左右的HUVECs換液并進(jìn)行傳代，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、形態(tài)正常的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照(control)組、LPS組、PCA組和PCA+LPS組。空白對(duì)照組加入DMEM完全培養(yǎng)基，LPS組加入0.1 mg/L LPS，PCA組加入1.25 mg/L的PCA 溶液，PCA+LPS組加入1.25 mg/L PCA與0.1 mg/L LPS的混合液。各組均于藥物作用12 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 HUVECs接種于一次性96孔板中。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，各組加藥。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12 h，于結(jié)束前4 h加入濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后吸凈細(xì)胞上清，每孔加入150 μL DMSO，水平搖床振蕩搖勻10 min，在酶標(biāo)儀上于490 nm處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(inhibition ratio，IR)。生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。

2.3免疫組化法檢測(cè)TRAF6蛋白在細(xì)胞中的分布 HUVECs接種于一次性6孔板中培養(yǎng)，各組加藥。棄去培養(yǎng)液，依次加入4%多聚甲醛、0.5% TritonX-100及3%過(guò)氧化氫處理；吸去3%過(guò)氧化氫，加入試劑A液(封閉用正常山羊血清工作液)，室溫封閉；加入用PBS緩沖液稀釋的 I 抗，4 ℃冰箱過(guò)夜。第2天從冰箱中取出6孔板，再依次加試劑B液(生物素化 II 抗工作液)和試劑C液(辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液)處理；去掉試劑C液，加入已配好的DAB工作液顯色。加入蘇木素溶液復(fù)染，充分水洗，加入1%鹽酸乙醇脫色，水洗。梯度乙醇脫水，甩干，顯微鏡下觀(guān)察，拍照。用Image-Pro Plus 6．0軟件分析平均吸光度。

2.4Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65、c-Jun、c-Fos及TF蛋白的表達(dá) 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，加藥處理，冰上提取細(xì)胞蛋白并測(cè)蛋白濃度，按照比例加入蛋白上樣緩沖液(5×)，混勻煮沸以使蛋白變性，冷卻至室溫后放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。配膠、上樣、電泳，電泳結(jié)束后切膠轉(zhuǎn)膜。結(jié)束后，牛奶封閉，加 I 抗孵育，抗體孵育盒放入4 ℃冰箱過(guò)夜。第2天取出膜，加入稀釋好的 II 抗，水平搖床上室溫孵育2 h。洗膜后滴加ECL發(fā)光液，放置于凝膠成像顯影儀中成像。最后用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

2.5qPCR檢測(cè)HUVECs的TF的mRNA表達(dá) 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，加藥處理，TRIzol試劑提取總RNA；打開(kāi)NANO DROP2000分光光度計(jì)，測(cè)總RNA濃度及A260/A280比值。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再進(jìn)行qPCR反應(yīng)，配制20 μL qPCR反應(yīng)體系，混勻，離心，將反應(yīng)體系置于qPCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件： 50.0 ℃，2 min循環(huán)1次； 95.0 ℃ 5 min循環(huán)1次； 95.0 ℃ 15 s及60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。β-actin的上游引物序列為5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下游引物序列為 5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’；TF的上游引物序列為5’-TGAAGGATGTGAAGCAGACG，下游引物序列為5’-GCCAGGATGATGACAAGGAT-3’。用2-ΔΔCt法分析mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

2.6ELISA法檢測(cè)HUVECs培養(yǎng)上清液中TF的表達(dá) 選取合適的細(xì)胞，接種于一次性6孔板中培養(yǎng)，各組加藥。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液。按ELISA試劑盒上的步驟進(jìn)行操作，加樣，孵育洗滌，顯色，終止顯色，在酶標(biāo)儀上于450 nm處測(cè)定A值，制作標(biāo)曲計(jì)算TF濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異用單因素方差分析，兩兩間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PCA明顯抑制LPS所致的HUVECs活力的變化

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果可見(jiàn)，LPS組細(xì)胞的A值與對(duì)照組比較顯著下降，細(xì)胞活力降低(P<0.01)；PCA組的A值與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PCA+LPS組與LPS組比較，細(xì)胞A值大于LPS組，細(xì)胞活力上升(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2 HUVECs中TRAF6蛋白的分布

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組HUVECs呈梭形，邊界清晰，胞質(zhì)內(nèi)黃染顆粒不明顯；LPS組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃染顆粒，胞質(zhì)染色加深，TRAF6 平均吸光度值升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而LPS+PCA組與LPS組比較，細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)黃染顆粒不明顯，TRAF6平均吸光度明顯小于LPS組(P<0.01)，見(jiàn)圖1、表1。

表1PCA逆轉(zhuǎn)LPS所致的HUVECs活力的變化和TRAF6蛋白的表達(dá)

Table 1. PCA reversed LPS-induced changes of HUVECs viability and protein expression of TRAF6 (Mean±SD.n=8)

GroupMTTAIR(%)TRAF6expressionControl0.554±0.051—0.014±0.002LPS0.401±0.047**31.200.057±0.000**PCA0.516±0.04411.740.017±0.002PCA+LPS0.476±0.049△14.000.024±0.004△△

**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsLPS.

Figure 1. Distribution of TRAF6 protein in the HUVECs (×200).

圖1HUVECs中TRAF6蛋白的分布

3 HUVECs胞內(nèi)NF-κB p65、c-Jun及c-Fos蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組中NF-κB p65、c-Jun和c-Fos的蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.01)；PCA+LPS組3種蛋白的表達(dá)則明顯低于LPS組(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

4 PCA對(duì)HUVECs損傷時(shí)TF mRNA及蛋白表達(dá)的影響

qPCR檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，LPS組TF的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)；PCA組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；PCA+LPS組與LPS組比較，TF的mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)，見(jiàn)圖3。Western blot檢測(cè)TF蛋白的結(jié)果可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，LPS組TF蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01),而PCA組的比值無(wú)顯著變化；PCA+LPS組蛋白表達(dá)則明顯低于LPS組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TF表達(dá)量可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，LPS組TF的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)，而PCA組的值無(wú)顯著變化；PCA+LPS組TF值則明顯低于LPS組(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 2. The results of Western blot for protein expression of NF-κB p65, c-Jun and c-Fos. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsLPS.

圖2NF-κBp65、c-Jun和c-Fos蛋白的Westernblot結(jié)果

Figure 3. The effect of PCA on the mRNA expression of TF in the HUVECs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsLPS.

圖3PCA對(duì)HUVECs損傷時(shí)TFmRNA表達(dá)的影響

討 論

生理狀態(tài)下VECs不表達(dá)TF，但病變的血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)TF，引起血液高凝狀態(tài)，導(dǎo)致病理性血栓形成[11]。不同刺激誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TF的表達(dá)涉及不同的信號(hào)?？梢砸饍?nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF的刺激因子包括細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL-8)、LPS、生長(zhǎng)因子(VEGF、FGF)[12]和缺氧等?，F(xiàn)已知涉及到誘導(dǎo)TF表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵酶有很多，它們介導(dǎo)相同或不同的信號(hào)途徑，但不管如何都認(rèn)為p44/42 MAPK、p38 MAPK以及轉(zhuǎn)錄因子Egr-1、NF-κB、AP-1的激活對(duì)誘導(dǎo)TF是必需的[13]。

Figure 4. The result of Western blot for protein expression of TF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsLPS.

圖4TF蛋白的Westernblot結(jié)果

Figure 5. PCA reduces the TF expression in HUVECs culture supernatants. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsLPS.

圖5PCA減少LPS誘導(dǎo)的HUVECs培養(yǎng)上清中TF表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)室將PCA用于心血管疾病的研究，證實(shí)了PCA可改善LPS引起的大鼠心肌損傷，抑制大鼠微血栓的形成,對(duì)血栓性疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)——VECs損傷有抑制作用，減少損傷的VECs合成分泌TF[14]。這些實(shí)驗(yàn)提示了PCA可抑制VECs分泌TF，發(fā)揮抗凝作用，但具體如何抑制TF的合成分泌機(jī)制還不明確。實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PCA+LPS實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性明顯大于LPS組，可見(jiàn)PCA對(duì)HUVECs具有一定的保護(hù)作用。TF的表達(dá)是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的TRAF6泛素化后激活核轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的。TRAF6是細(xì)胞內(nèi)多功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，是激活NF-κB通路和MAPK信號(hào)通路(TRAF6/JNK/AP-1途徑)的交叉點(diǎn)[15]。NF-κB和AP-1是細(xì)胞中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信息傳遞，可調(diào)控多種細(xì)胞因子的基因表達(dá)。細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，這2種轉(zhuǎn)錄因子活性極低或被抑制，但當(dāng)受到外界刺激時(shí)(如TNF-α、IL-1、LPS等)，它們就會(huì)迅速被激活，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄[16-17]。本實(shí)驗(yàn)顯示PCA+LPS實(shí)驗(yàn)組TRAF6 平均光密度明顯小于LPS組，TRAF6活化被抑制，NF-κB p65、c-Jun和c-Fos 3種蛋白的表達(dá)也被抑制，同時(shí)TF mRNA、蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含量均明顯少于LPS組。蛋白的表達(dá)主要是靠基因調(diào)控[18]。因此得出，PCA可減輕LPS引起的HUVECs損傷，是通過(guò)抑制TRAF6、NF-κB及AP-1核轉(zhuǎn)錄因子的活化來(lái)抑制TF基因的表達(dá)，從而減少組織因子的釋放。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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