劉 意， 趙林雙

(中國(guó)人民解放軍武漢總醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 武漢 430070)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是高發(fā)且縮短患者生存年限、嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量的糖尿病并發(fā)癥之一。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)幾乎1/3的糖尿病患者受DN影響，最終50%發(fā)展為終末期腎病[1]。2016年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)科學(xué)年會(huì)指出，慢性低度炎癥參與糖尿病病程，而干預(yù)慢性低度炎癥利于糖尿病好轉(zhuǎn)[2]。可見慢性低度炎癥在DN并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用[3]。

白細(xì)胞介素22(interlukin-22，IL-22)屬IL-10細(xì)胞因子家族，參與宿主屏障組織防御。IL-22受體(IL-22 receptor，IL-22R)由IL-22R1和IL-10R2異二聚體亞基組成，IL-22與IL-22R1有高度親和性和專一性。與其它大多數(shù)作用于造血細(xì)胞的細(xì)胞因子不同，IL-22R1在免疫細(xì)胞缺如，而只表達(dá)于肺臟、肝臟、腎臟和胰腺等組織非造血上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[4-5]。

最近研究發(fā)現(xiàn)， IL-22在2型糖尿病患者高表達(dá)[6-7]。還有研究表明,IL-22可以促進(jìn)組織器官纖維化[8-9]。腎小管上皮細(xì)胞是表達(dá)IL-22R1的主要細(xì)胞[4]，IL-22可能在DN發(fā)病機(jī)制中起重要作用。IL-22/IL-22R1系統(tǒng)近期已被認(rèn)為在代謝性疾病中有重要的藥物發(fā)展前景[10-11]。但關(guān)于IL-22在DN發(fā)生發(fā)展中的作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過構(gòu)建糖尿病小鼠模型，探討IL-22在DN發(fā)生發(fā)展中的作用及具體機(jī)制，為治療DN提供新的思路和理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

24只SPF級(jí)5～6周齡C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物合格證編號(hào)：11400700167238)，體重16～18 g。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～24 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由攝食飲水，12 h交替照明。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ； Sigma)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA； Biosharp)；重組IL-22(recombinant IL-22, rIL-22； PeproTech)；IL-22中和抗體(IL-22 antibody,anti-IL-22; PeproTech)；抗纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N) 抗體和抗E-鈣黏素(E-cadherin)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；TRIzol(Aidlab)；cDNA第一鏈合成試劑盒(Vazyme)；PCR引物由武漢擎科生物有限公司合成。

3 主要方法

3.1糖尿病小鼠模型的建立 18只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，予以高脂飼料(普通飼料中加入2%膽固醇、0.15%膽酸鈉、10%蔗糖和10%豬油)喂養(yǎng)4周，禁食10 h后按50 mg/kg劑量腹腔注射STZ溶液，連續(xù)5 d，另取6只普通飼料喂養(yǎng)小鼠腹腔注射等量檸檬酸緩沖液作為正常對(duì)照(normal control，NC)組。1周后剪尾法測(cè)隨機(jī)血糖≥13.9 mmol/L為造模成功。

3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)及分組 造模成功后，糖尿病模型小鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8周，隨機(jī)分為DN組(n=6)、rIL-22干預(yù)組(DN+rIL-22組，n=6)和anti-IL-22干預(yù)組(DN+anti-IL-22組，n=6)。分組干預(yù)如下：(1)DN+rIL-22組：rIL-22 200 μg/kg，每周2次，連續(xù)4周，腹腔注射；(2)DN+anti-IL-22組：anti-IL-22 200 μg/kg，每周2次，連續(xù)4周，腹腔注射；(3)DN組：等量0.1% BSA腹腔注射，每周2次，連續(xù)4周；(4)NC組：等量0.1% BSA腹腔注射，每周2次，連續(xù)4周。

3.3血糖、腎功能、24 h尿微量白蛋白(microalbumin，m-Alb)和24 h尿肌酐(urine creatinine,UCr)的檢測(cè) 用血糖儀以剪尾法測(cè)定各組小鼠干預(yù)前和干預(yù)后的空腹血糖(fasting plasma glucose， FPG)，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、24 h m-Alb和24 h UCr，并計(jì)算m-Alb/UCr比值。

3.4腎臟指數(shù)(kidney index,KI)的計(jì)算 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠稱重，腹腔注射1%水合氯醛50 mg/kg麻醉。留取腎臟標(biāo)本，稱重，計(jì)算KI。KI (%)=雙側(cè)腎臟重量(g)/體重(g)×100%。

3.5光鏡下觀察腎臟組織的病理結(jié)構(gòu)改變 取4%多聚甲醛常溫固定的小鼠腎臟組織，常規(guī)的梯度脫水、石蠟包埋、切片(5 μm)，做常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)學(xué)改變。

3.6腎小管間質(zhì)損傷的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 腎小管間質(zhì)各項(xiàng)病理指標(biāo)包括腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)3項(xiàng)半定量評(píng)分。采用Katafuchi計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，腎間質(zhì)積分0～9分，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)0～3分，間質(zhì)纖維化0～3分，腎小管萎縮0～3分。綜合積分作為標(biāo)本腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，記為腎小管損傷分?jǐn)?shù)(score of tubular injury STI)。

3.7qPCR法檢測(cè)腎臟組織Snail1的mRNA表達(dá) 取出-80 ℃凍存的新鮮腎臟組織，以TRIzol試劑盒提取腎臟組織總RNA，分光光度計(jì)進(jìn)行RNA濃度測(cè)定。Snail1的上游引物為5’-CACCCTCATCTGGGACTCTC-3’，下游引物為5’-TTGCCACTGTCCTCATCGG-3’；β-actin的上游引物為5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下游引物為5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’。使用ABI 7900實(shí)時(shí)熒光PCR儀，qPCR反應(yīng)嚴(yán)格依試劑盒操作說明進(jìn)行。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸25 s，30次循環(huán)；繼續(xù)72 ℃延伸4 min，4 ℃ 4 min。擴(kuò)增完成后，50 ℃開始升溫做熔解曲線，基因相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt值計(jì)算分析。

3.8Western blot法檢測(cè)腎臟組織FN和E-cadherin的蛋白表達(dá) 提取腎臟總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。經(jīng)過10%的SDS-PAGE分離，PVDF膜印跡，5%脫脂奶粉室溫封閉。加入抗FN(1 ∶1 000)抗體和抗E-cadherin抗體(1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(1 ∶50 000)孵育2 h。洗滌后經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影，曝光成像。以β-actin作為內(nèi)參照，計(jì)算蛋白條帶的灰度比值進(jìn)行半定量分析，結(jié)果由計(jì)算機(jī)凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較選用單因素方差分析(ANOVA)，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠血糖、腎功能和腎臟指數(shù)的比較

NC組小鼠體型正常，毛柔順且色澤烏黑，反應(yīng)靈敏；各糖尿病模型組小鼠體型肥胖，毛粗糙且色澤暗淡，反應(yīng)稍遲鈍。干預(yù)前和干預(yù)4周后，與NC組小鼠比較，各糖尿病模型組小鼠FPG均顯著升高(P<0.01)，但各組間KI和腎功能的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表1。

表1 各組小鼠血糖、腎功能和腎臟指數(shù)的比較

**P<0.01vsNC group.

2 各組小鼠干預(yù)后微量白蛋白尿的比較

干預(yù)4周后，與NC組小鼠比較，各模型組24 h尿微量白蛋白/肌酐比值均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，出現(xiàn)微量白蛋白尿，提示進(jìn)展為糖尿病腎臟病變。另外，rIL-22干預(yù)4周后，相較于DN組，24 h m-Alb和24 h UCr均顯著升高(P<0.05)，而anti-IL-22阻斷4周后，24 h m-Alb、24 h UCr和24 h尿微量白蛋白/肌酐比值較DN組和DN+rIL-22組均顯著降低(P<0.05)，說明anti-IL-22可減輕糖尿病腎病白蛋白尿，見表2。

表2 各組小鼠干預(yù)后微量白蛋白尿的比較

*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsDN group;△△P<0.01vsDN+rIL-22 group.

3 腎臟病理學(xué)改變的比較

NC組小鼠腎臟體積正常，質(zhì)地柔軟；各糖尿病模型小鼠腎臟體積增大，質(zhì)地變硬。HE染色后光鏡下可見，NC組小鼠腎小球體積正常，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、邊界清晰，管腔規(guī)則，未見明顯擴(kuò)張；而DN組腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、細(xì)胞核溶解、細(xì)胞邊界不清，腎小管管腔不規(guī)則，部分管內(nèi)有蛋白管型；腎小球體積增大，系膜細(xì)胞增多、系膜增寬；DN+rIL-22組較DN組上述病變更為廣泛，而DN+anti-IL-22組上述病變明顯減輕，見圖1。

Figure 1. The pathological changes of renal tissues under light microscope (HE staining, ×400).

圖1光鏡下腎臟組織病理學(xué)改變

4 腎小管間質(zhì)損傷的半定量分析

rIL-22干預(yù)4周后，DN+rIL-22組STI為7.17±0.75，較NC組(1.60±0.27)和DN組(4.63±0.58)均顯著升高(P<0.01)；而anti-IL-22阻斷4周后，STI為3.01±0.52，較DN組顯著下降(P<0.05)。

5 各組小鼠干預(yù)后腎臟Snail1 mRNA表達(dá)水平比較

qPCR結(jié)果顯示，干預(yù)4周后，與NC組小鼠比較，DN組和DN+rIL-22組Snail1的mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；而anti-IL-22阻斷4周后，Snail1的mRNA表達(dá)較DN組顯著降低(P<0.05)，見圖2。這說明anti-IL-22可以抑制糖尿病小鼠腎臟組織Snail1信號(hào)分子高表達(dá)。

6 各組小鼠干預(yù)后腎臟FN蛋白表達(dá)水平的比較

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rIL-22干預(yù)4周后，F(xiàn)N蛋白表達(dá)水平較NC組和DN組均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；而anti-IL-22阻斷4周后，F(xiàn)N蛋白表達(dá)水平較NC組顯著升高(P<0.05)，但與DN組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。這說明IL-22可誘導(dǎo)FN蛋白表達(dá)，加速細(xì)胞外基質(zhì)積聚引起的糖尿病腎纖維化。

Figure 2. The relative mRNA expression level of Snail1 in the kidney among different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDN group.

圖2各組小鼠腎臟組織Snail1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

Figure 3. The relative protein expression level of FN in the kidney among different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsDN group.

圖3各組小鼠腎臟組織FN蛋白的表達(dá)水平

7 各組小鼠干預(yù)后腎臟E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rIL-22干預(yù)4周后，DN+rIL-22組E-cadherin蛋白表達(dá)水平較NC組和DN組均顯著下降(P<0.05)，見圖4。這說明IL-22抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)，加速上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進(jìn)程，從而促進(jìn)糖尿病腎纖維化。

討 論

炎癥的標(biāo)志是炎癥細(xì)胞滲透、黏附分子表達(dá)和趨化因子、促炎細(xì)胞因子、血清C反應(yīng)蛋白升高。慢性低度炎癥發(fā)生于慢性、低級(jí)別水平，和傳統(tǒng)炎癥性疾病相比相當(dāng)輕微[3]。目前認(rèn)為，“2型糖尿病是一種慢性低度炎癥性疾病”[2]。而炎癥因子可能參與了2型糖尿病和DN并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，IL-22在2型糖尿病患者升高。IL-22可以促進(jìn)組織器官纖維化[8-9]，而腎小管上皮細(xì)胞是表達(dá)IL-22R1的主要細(xì)胞[4]，因此有必要探討IL-22在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用。

Figure 4. The relative protein expression levels of E-cadherin in the kidney among different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDN group.

圖4各組小鼠腎臟組織E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平

本研究發(fā)現(xiàn)，anti-IL-22可以減輕糖尿病腎病白蛋白尿，延緩DN進(jìn)程。研究結(jié)果顯示，糖尿病模型小鼠24 h尿微量白蛋白/肌酐比值均顯著升高，出現(xiàn)白蛋白尿，提示進(jìn)展為糖尿病腎臟病變。而anti-IL-22阻斷4周后，24 h尿微量白蛋白/肌酐比值顯著下降，表明白蛋白尿得到改善，為今后以IL-22為靶點(diǎn)治療DN提供理論依據(jù)。白蛋白尿是糖尿病腎病早期階段和特征性表現(xiàn)，通常作為評(píng)估藥物療效的終點(diǎn)事件[12]。

我們通過光鏡觀察進(jìn)一步證實(shí)，rIL-22促進(jìn)DN發(fā)生發(fā)展，而anti-IL-22可改善DN。我們發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、蛋白管型形成和腎小球系膜擴(kuò)張，rIL-22干預(yù)4周后上述病變更為廣泛，反之a(chǎn)nti-IL-22阻斷4周后病變程度得以減輕?？梢姡琁L-22在DN發(fā)病機(jī)制中起著不可忽視的作用。

Snai1基因編碼Snail家族鋅指蛋白1，以Snail1蛋白著稱[13]。“上皮可塑性”指在腎臟，一些腎小管上皮細(xì)胞變?yōu)楦咏g充質(zhì)細(xì)胞，而另一些則回到上皮表型或保留去分化狀態(tài)。“部分EMT”指極少甚至沒有腎小管上皮細(xì)胞，可以真正穿越基底膜徹底轉(zhuǎn)化為纖維母細(xì)胞[14]。而糖尿病腎纖維化主要由EMT[15]、細(xì)胞外基質(zhì)積聚和腎小管上皮細(xì)胞凋亡引起[16]。FN是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，為細(xì)胞外基質(zhì)積聚標(biāo)志物[16]。E-cadherin主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，為EMT發(fā)生標(biāo)志物[15]。有研究表明，Snail1可以阻止腎小管上皮細(xì)胞的最終分化，誘導(dǎo)部分EMT促進(jìn)腎纖維化發(fā)展[13-14,17]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病小鼠Snail1轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)，anti-IL-22可能通過抑制腎小管上皮細(xì)胞Snail1信號(hào)分子表達(dá)改善DN。qPCR結(jié)果顯示，糖尿病腎病小鼠腎臟組織Snail1的mRNA表達(dá)水平顯著升高，而anti-IL-22能夠抑制Snail1的mRNA表達(dá)。

本研究結(jié)果表明，rIL-22可以促進(jìn)ECM積聚和誘導(dǎo)EMT進(jìn)程，加速糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展。Western blot結(jié)果顯示，rIL-22可以增加糖尿病小鼠腎臟組織FN表達(dá)，而抑制腎臟組織E-cadherin蛋白表達(dá)。

不同劑量和時(shí)長(zhǎng)藥物干預(yù)可能發(fā)揮不同藥效，本研究結(jié)果未顯示rIL-22對(duì)Snail1產(chǎn)生顯著影響。因此，最佳的劑量和時(shí)長(zhǎng)有待進(jìn)一步探索，其它可能參與信號(hào)通路機(jī)制也有待深入發(fā)掘。

IL-22R1除與IL-22結(jié)合外，還可與IL-20和IL-24結(jié)合，以IL-22R1依賴性方式產(chǎn)生IL-22樣效應(yīng)。因此，中和IL-22后并不能完全阻斷IL-22發(fā)揮生物效應(yīng)[4,10]。本研究結(jié)果未顯示給予anti-IL-22后對(duì)FN和E-cadherin產(chǎn)生顯著影響，可能與代償機(jī)制有關(guān)。反之，阻斷IL-22R1也許比中和IL-22能發(fā)揮更完全的阻斷效應(yīng)[10]。后續(xù)研究，還須深入探討應(yīng)用IL-22R1抗體(IL-22 receptor-1 antibody，IL-22RA1)阻斷IL-22R1后對(duì)糖尿病腎病保護(hù)機(jī)制。

從上述研究結(jié)果我們得知，IL-22抗體可能通過抑制腎小管上皮細(xì)胞Snail1信號(hào)分子高表達(dá)而減輕糖尿病腎病白蛋白尿，延緩DN進(jìn)程。本研究尚存在一些不足之處，課題組未檢測(cè)IL-22在模型動(dòng)物和干預(yù)動(dòng)物中的表達(dá)水平。在下一步的工作中，課題組將進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)干預(yù)對(duì)糖尿病腎病產(chǎn)生的影響。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Lv M, Chen Z, Hu G, et al. Therapeutic strategies of diabetic nephropathy: recent progress and future perspectives[J]. Drug Discov Today, 2015, 20(3):332-346.

[2] Zhou J, Xu H, Huang K. Organoselenium small molecules and chromium(III) complexes for intervention in chronic low-grade inflammation and type 2 diabetes[J]. Curr Top Med Chem, 2016, 16(8):823-834.

[3] Shikata K, Makino H. Microinflammation in the pathoge-nesis of diabetic nephropathy[J]. J Diabetes Investig, 2013,4(2):142-149.

[4] Dudakov JA, Hanash AM, van den Brink MR. Interleukin-22: immunobiology and pathology[J]. Annu Rev Immunol, 2015, 33:747-785.

[5] Perusina LM, Lin Y, Fang J, et al. Biological and pathological activities of interleukin-22[J]. J Mol Med (Berl), 2016, 94(5):523-534.

[6] Zhao R, Tang D, Yi S, et al. Elevated peripheral frequencies of Th22 cells: a novel potent participant in obesity and type 2 diabetes[J]. PLoS One, 2014, 9(1):e85770.

[7] Guo H, Xu BC, Yang XG, et al. A high frequency of peripheral blood IL-22+CD4+T cells in patients with new onset type 2 diabetes mellitus[J]. J Clin Lab Anal, 2016, 30(2):95-102.

[8] Wu LY, Liu S, Liu Y, et al. Up-regulation of interleukin-22 mediates liver fibrosis via activating hepatic stellate cells in patients with hepatitis C[J]. Clin Immunol, 2015, 158(1):77-87.

[9] Zhao J, Zhang Z, Luan Y, et al. Pathological functions of interleukin-22 in chronic liver inflammation and fibrosis with hepatitis B virus infection by promoting T helper 17 cell recruitment[J]. Hepatology, 2014, 59(4):1331-1342.

[10] Sabat R, Ouyang W, Wolk K. Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system[J]. Nat Rev Drug Discov, 2014, 13(1):21-38.

[11] Sabat R, Wolk K. Deciphering the role of interleukin-22 in metabolic alterations[J]. Cell Biosci, 2015, 5:68.

[12] Kr?pelin TF, de Zeeuw D, Andress DL, et al. Number and frequency of albuminuria measurements in clinical trials in diabetic nephropathy[J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2015,10(3): 410-416.

[13] Grande MT, Sanchez-Laorden B, Lopez-Blau C, et al. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease[J]. Nat Med, 2015, 21(9):989-997.

[14] Huang S, Susztak K. Epithelial plasticity versus EMT in kidney fibrosis[J]. Trends Mol Med, 2016, 22(1):4-6.

[15] Lamouille S, Xu J, Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(3):178-196.

[16] Chuang PY, Menon MC, He JC. Molecular targets for treatment of kidney fibrosis[J]. J Mol Med (Berl), 2013, 91(5):549-559.

[17] Lovisa S, LeBleu VS, Tampe B, et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis[J]. Nat Med, 2015, 21(9):998-1009.