王奎鵬， 余海濱

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 河南 鄭州 450000)

腦缺血(ischemia)是因腦內(nèi)血氧供應(yīng)不足而導(dǎo)致的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在發(fā)展中國(guó)家已經(jīng)成為繼心臟病和腫瘤的第3大致死病因[1]。有數(shù)據(jù)表明，腦缺血引起的致殘率高達(dá)20%～30%，在幸存的患者中，1/3的患者在1周之內(nèi)有所改善，40%患者確沒(méi)有任何改善，20%病患病情在第1周的時(shí)候甚至?xí)觿2]，這提示腦缺血具有高治殘率及致死率。腦缺血超過(guò)1 h，即可出現(xiàn)不可逆性腦損傷，表現(xiàn)為不同程度的感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知功能障礙，該疾病一旦發(fā)生將會(huì)給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。鑒于我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái)，尋找有效的治療腦缺血的藥物以及治療途徑已刻不容緩。在尋找治療腦缺血的藥物中，α2腎上腺素受體激動(dòng)劑進(jìn)入人們的視野。有研究表明可樂(lè)定(clonidine)能顯著提高正常和高血糖全腦缺血的大鼠模型中神經(jīng)細(xì)胞的存活率以及谷氨酸的釋放[3]。但是對(duì)腦缺血的認(rèn)知功能后遺癥是否具有改善作用仍然不清楚。此外，α2腎上腺素通路能介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號(hào)通路[4]。綜上所述，本文旨在探討可樂(lè)定是否通過(guò)調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路來(lái)改善腦缺血的后遺癥—學(xué)習(xí)記憶障礙，為慢性腦缺血提供新的治療策略。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

45只雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(300±50) g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2014-0005。利用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)(sham)組、腦缺血(ischemia)組和可樂(lè)定(clonidine)組，每組15只，術(shù)前連續(xù)給藥1周，其中可樂(lè)定組每日100 μg/kg可樂(lè)定灌胃，正常組和模型組每日灌胃等體積蒸餾水。手術(shù)后連續(xù)喂養(yǎng)30 d，均自由飲食與攝水。

2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

可樂(lè)定購(gòu)于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為09081232；抗ERK1/2、p-ERK1/2、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(c-AMP-response element binding protein)CREB和p-CREB抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔抗及鼠抗β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。DYC2-24DN型電泳儀(北京市六一儀器廠)；MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；FA1104電子天平(上海方瑞儀器有限公司)。

3 方法

3.1大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MACO)模型的制備 各組大鼠手術(shù)前禁食12 h，自由飲水。手術(shù)當(dāng)天，對(duì)大鼠稱重后，用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于大鼠解剖板上，剪去頸部手術(shù)區(qū)毛，碘伏、醫(yī)用乙醇依次消毒手術(shù)區(qū)，于頸部行合適的切口，分離胸鎖乳突肌，切斷二腹肌前腹，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)，靠近近心端結(jié)扎CCA，在分岔處結(jié)扎ECA，并預(yù)留一根線于CCA處，用微型動(dòng)脈夾在遠(yuǎn)心端進(jìn)行夾閉，于CCA與ICA分岔處0.5 cm剪一小口，從開(kāi)口處往頸內(nèi)動(dòng)脈慢慢插入直徑0.235 mm或0.265 mm的尼龍栓，將栓線插入2.5cm左右可達(dá)到1.8～2.0 cm的插入深度，并用預(yù)留的手術(shù)線結(jié)扎切口處，全層縫合傷口，消毒，最后將大鼠放于鼠籠中并用白熾燈加熱維持大鼠體溫。持續(xù)栓塞2 h后將栓線拔出再灌注30 d，待動(dòng)物蘇醒后血管栓塞的同側(cè)出現(xiàn)Hornor征和對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙即為模型成功。假手術(shù)組操作過(guò)程同手術(shù)組，但大鼠右側(cè)頸總和頸外動(dòng)脈不結(jié)扎也不插入栓線。

3.2Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 術(shù)后4周對(duì)各組大鼠進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn)。(1) 定位航行實(shí)驗(yàn)：將站臺(tái)置于水迷宮第3象限中央，每天相同時(shí)段讓大鼠面向池壁從第1象限中入水，電腦記錄其在90 s內(nèi)找到并爬上站臺(tái)的時(shí)間，若在90 s內(nèi)沒(méi)有找到站臺(tái)，則將其放至站臺(tái)停留20 s，逃避潛伏期記為90 s，每天游泳訓(xùn)練2次，連續(xù)5 d；(2) 空間探索實(shí)驗(yàn)：MWM實(shí)驗(yàn)第6天，將第3象限中站臺(tái)撤去，在相同時(shí)段，讓大鼠自由游泳1次，每次時(shí)間為90 s。電腦記錄大鼠在第3象限的停留時(shí)間(residence time in the third quadrant，RTQ)、跨越隱匿站臺(tái)的次數(shù)及入水朝向角。

3.3腦組織實(shí)驗(yàn)樣本的制備 MWM實(shí)驗(yàn)完成后，對(duì)大鼠腹腔注射10% 水合氯醛(3.5 mL/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，迅速打開(kāi)其胸腹腔，充分暴露心臟和肝臟，將灌注針從心尖插入左心室至主動(dòng)脈，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，用0.01 mol/L PBS快速灌注至肝臟透明[4]。灌注成功后，將大鼠在冰上斷頭處死，快速分離海馬組織，一半腦組織迅速放入-80 ℃冰箱中，一半腦組織迅速放于4%多聚甲醛溶液中固定24 h備用。

3.4免疫組織化學(xué)檢測(cè) 將腦組織制成海馬相關(guān)區(qū)域冠狀切片并在梯度乙醇下常規(guī)脫蠟至水；室溫下用3% H2O2孵育25 min；在微波沸騰條件下用檸檬酸修復(fù)液行抗原修復(fù)；5% BSA 30 ℃條件下封閉30 min；滴加 I 抗稀釋液 (1∶300)，濕盒4 ℃孵育過(guò)夜。選擇合適的生物素化 II 抗工作液滴加于切片組織上，30 ℃避光孵育30 min；將適量的辣根酶標(biāo)記物工作液滴加于切片組織上，30 ℃避光孵育30 min；DAB顯色劑顯色5 min，蘇木素復(fù)染30 s，沖洗干凈；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。用0.01 mol/L PBS代替 I 抗進(jìn)行免疫組化染色設(shè)為陰性對(duì)照組，其余步驟同上。在倒置顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照，用IPP 6.0軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行累積吸光度(IA)值定量分析。

3.5Western blot檢測(cè) 將海馬組織從-80 ℃冰箱中取出，根據(jù)蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取總蛋白，BCA法測(cè)定并將各組蛋白調(diào)至等濃度，加適量上樣緩沖液并混勻，煮沸5 min；采用濕轉(zhuǎn)法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉膜2 h，加入稀釋的I抗(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜；加入稀釋的 II 抗(1∶4 000)，室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光；蛋白表達(dá)量以其與內(nèi)參照蛋白條帶灰度的比值表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)或非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 可樂(lè)定對(duì)SD大鼠逃避潛伏期的影響

與假手術(shù)組比較，在5 d定位航行的實(shí)驗(yàn)中，腦缺血組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)；與腦缺血組相比，可樂(lè)定組大鼠的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 3組SD大鼠逃避潛伏期的比較

*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsischemia group.

2 3組SD大鼠在第3象限停留時(shí)間、跨越隱匿站臺(tái)次數(shù)及入水朝向角的比較

與假手術(shù)組比較，腦缺血組大鼠的RTQ及跨越隱匿站臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.01)，入水朝向角明顯增加(P<0.01)；與腦缺血組比較，可樂(lè)定組大鼠的RTQ及跨越隱匿站臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.01)，入水朝向角明顯減小(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表23組SD大鼠間RTQ、跨越隱匿平臺(tái)的次數(shù)及入水朝向角的比較

Table 2. Comparison of RTQ, number of cross-hidden platform and the orientation angle between 3 groups of SD rats (Mean±SD.n=15)

GroupRTQ(s)NumberOrientationangle(°)Sham30.78±6.565.68±1.7236.52±18.78Ischemia15.32±4.97**1.35±0.86**65.69±34.33**Clonidine28.19±5.87##4.49±1.31##38.17±22.17#

**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsischemia group.

3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)可樂(lè)定對(duì)海馬CA1區(qū)p-ERK1/2和p-CREB蛋白的表達(dá)

海馬CA1區(qū)中p-ERK1/2蛋白主要存在于細(xì)胞膜及胞漿中，p-CREB蛋白主要存在于細(xì)胞核中。與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠海馬中各蛋白陽(yáng)性水平均明顯增加(P<0.01)；與腦缺血組相比，可樂(lè)定組海馬中各蛋白陽(yáng)性水平均明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖1、表3。

4 Western blot 檢法可樂(lè)定對(duì)海馬組織中p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB和CREB蛋白水平的影響

與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠海馬組織中p-ERK1/2和p-CREB的蛋白水平顯著增加(P<0.01)；與腦缺血組相比，可樂(lè)定組大鼠海馬組織中p-ERK1/2和p-CREB的蛋白水平顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

討 論

本次實(shí)驗(yàn)的目的是探討α2腎上腺素受體激動(dòng)劑可樂(lè)定對(duì)腦缺血導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙是否具有改善作用?；诖宋覀兪紫炔捎眯袨閷W(xué)研究方法——Morris水迷宮檢測(cè)可樂(lè)定對(duì)慢性腦缺血大鼠是否具有改善學(xué)習(xí)記憶的作用，結(jié)果表明可樂(lè)定能提高腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象后我們進(jìn)一步通過(guò)免疫組織化學(xué)和Western blot法檢測(cè)ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生了改變，提示可樂(lè)定改善腦缺血后的學(xué)習(xí)記憶障礙可能是通過(guò)調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

Figure 1. The relative protein levels of p-ERK1/2 and p-CREB in hippocampal of 3 groups of SD rats (×400).

圖1可樂(lè)定對(duì)海馬CA1區(qū)p-ERK1/2和p-CREB蛋白水平的影響

Figure 2. The effects of clonidine on the relative protein levels of p-ERK1/2 and p-CREB in the hippocampal between 3 groups of SD rats. Mean±SD.n=15.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsischemia group.

圖23組SD大鼠海馬組織中p-ERK1/2和p-CREB相對(duì)蛋白表達(dá)量的比較

表33組SD大鼠海馬組織CA1區(qū)p-ERK1/2和p-CREB蛋白水平(IA)的比較

Table 3. Comparison of the protein levels of p-ERK1/2 and p-CREB (expressed asIA) in the hippocampal CA1 between 3 groups of SD rats (×103. Mean±SD.n=15)

Groupp-ERK1/2p-CREBSham2.09±0.619.83±2.15Ischemia5.76±0.77**20.52±4.81**Clonidine2.69±0.68##11.08±3.57##

**P<0.01vssham operation group;##P<0.01vsischemia group.

腦缺血能夠引起乙酰膽堿酯酶(acetylcholines-terase，AChE)活性增加，導(dǎo)致膽堿能系統(tǒng)功能降低，從而引起學(xué)習(xí)記憶能力的下降，甚至癡呆[5]。從上世紀(jì)70年代起α2腎上腺素受體激動(dòng)劑已經(jīng)成功應(yīng)用于高血壓的治療，并能夠降低充血性心力衰竭的心臟后負(fù)荷，此外，α2腎上腺素受體激動(dòng)劑對(duì)腦缺血后導(dǎo)致的神經(jīng)損傷無(wú)論是從行為學(xué)還是功能上[6]都具有很好的改善作用。葉春玲等[7]發(fā)現(xiàn)可樂(lè)定作為α2腎上腺素受體激動(dòng)劑能顯著延長(zhǎng)腦缺血小鼠以及急性腦缺血貓的的存活時(shí)間。并且越來(lái)越多的研究表明可樂(lè)定可以對(duì)抗神經(jīng)元興奮性毒性從而具有神經(jīng)元保護(hù)作用。Zhang等[6]研究指出可樂(lè)定預(yù)處理可明顯提高大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能評(píng)分及降低腦梗死體積，從而對(duì)抗腦缺血產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。但可樂(lè)定對(duì)腦缺血的后遺癥是否具有改善作用目前報(bào)道甚少。我們的實(shí)驗(yàn)旨在探討可樂(lè)定是否可以改善腦缺血后學(xué)習(xí)記憶障礙。

α2腎上腺素能通路介導(dǎo)的信號(hào)途徑多且復(fù)雜，除了經(jīng)典的Gi蛋白介導(dǎo)的 PKA-cAMP 通路以外，還可以激活絲裂原活化蛋白激酶家族中的ERK1/2通路[8]。ERK1/2是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育及生物學(xué)功能發(fā)揮的必需物質(zhì)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖，并介導(dǎo)凋亡信號(hào)傳遞等，然而一些新近研究報(bào)道指出，ERK信號(hào)通路可能參與神經(jīng)毒性作用[4]，腦缺血發(fā)生后，通過(guò)各種胞膜受體介導(dǎo)，激活蛋白激酶C途徑、腺苷酸環(huán)化酶途徑、肌醇三磷酸激酶途徑和酪氨酸受體途徑等，再激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)腦缺血損傷[9]。此外，ERK1/2通路在神經(jīng)可塑性以及學(xué)習(xí)記憶中起著重要的作用[10]，與學(xué)習(xí)密切相關(guān)的形式就是長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(long-term potentiation，LTP)，即突觸活動(dòng)的易化現(xiàn)象，目前被公認(rèn)為是研究學(xué)習(xí)記憶的最理想模型。大量的研究發(fā)現(xiàn)，LTP的形成伴隨著ERK2活性的升高，而采用特異性ERK2阻斷劑則可以抑制LTP的形成，起到長(zhǎng)時(shí)程抑制的效果，因此表明ERK1/2與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。而我們的實(shí)驗(yàn)表明腦缺血后ERK1/2活性增加，學(xué)習(xí)記憶下降，而可樂(lè)定則能逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，因此我們推測(cè)缺血狀態(tài)下，ERK1/2信號(hào)可能參與了學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的調(diào)節(jié)或者修復(fù)過(guò)程。CREB作為ERK1/2下游信號(hào)因子也是cAMP反應(yīng)原件應(yīng)答蛋白，其主要在腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞核中表達(dá)，是被最早證實(shí)的具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用的細(xì)胞因子，其可以調(diào)節(jié)cAMP的基因轉(zhuǎn)錄主要是作用于cAMP的起始子以及由各種信號(hào)分子產(chǎn)生的cAMP大量下游信號(hào)靶點(diǎn)，從而影響很多神經(jīng)元的基因和蛋白表達(dá)，最終調(diào)節(jié)整個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。大量的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)CREB與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。有研究表明在海馬切片中后期LTP的維持伴隨著磷酸化CREB蛋白表達(dá)增加，這種情況可以持續(xù)4 h，證實(shí)了磷酸化CREB在LTP后期中起著非常重要的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，PKA抑制劑可以阻斷CERB的磷酸化以及長(zhǎng)期LTP的形成，但是并不影響早期LTP階段。在早期壓力所致的學(xué)習(xí)記憶下降的中年ApoE4-TR大鼠中檢測(cè)到磷酸化CREB的降低[13]。據(jù)此表明磷酸化CREB與學(xué)習(xí)記憶密切相連。我們的實(shí)驗(yàn)表明可樂(lè)定能夠使大鼠在原來(lái)象限所逗留的時(shí)間增加，表明可樂(lè)定確有提高學(xué)習(xí)記憶的作用，進(jìn)一步觀察到與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的蛋白磷酸化ERK1/2以及CREB表達(dá)均減少，表明ERK1/2改善腦缺血后的學(xué)習(xí)記憶可能是通過(guò)降低磷酸化ERK1/2以及CREB表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

總之，我們的實(shí)驗(yàn)表明在MACO模型中所致的慢性腦缺血模型中可樂(lè)定具有改善腦缺血的學(xué)習(xí)記憶的作用，其可能是通過(guò)升高磷酸化ERK1/2以及CREB表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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