廖思寧，李 松，褚開淼，曾 菲，張 彪，胡有生

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斑馬魚GAPDH蛋白片段的原核表達(dá)差異分析

廖思寧，李 松，褚開淼，曾 菲，張 彪，*胡有生

（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與藥學(xué)院,，江西，吉安343009;）

為了分析斑馬魚基因不同區(qū)域原核表達(dá)構(gòu)建的誘導(dǎo)效應(yīng)差異，應(yīng)用生物信息技術(shù)分析斑馬魚分子結(jié)構(gòu)，通過定向刪除技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)部分斑馬魚GAPDH蛋白片段的質(zhì)粒。通過IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAG檢測(cè)，分析基因不同區(qū)域構(gòu)建的蛋白表達(dá)差異。結(jié)果：引物對(duì)ZGCKF/ZGCXR構(gòu)建的GAPDH重組表達(dá)質(zhì)粒具有IPTG誘導(dǎo)表達(dá)效應(yīng)，而引物對(duì)ZGNKF/ZGNXR構(gòu)建的質(zhì)粒則不具有IPTG誘導(dǎo)表達(dá)效應(yīng)。因此，為了在原核表達(dá)真核蛋白時(shí)應(yīng)考慮過表達(dá)的真核蛋白是否會(huì)影響宿主的代謝以及是否會(huì)導(dǎo)致宿主的抵抗，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)當(dāng)選擇合適的區(qū)域構(gòu)建重組質(zhì)粒才能獲表達(dá)產(chǎn)物。

斑馬魚；GAPDH；蛋白片段原核表達(dá)；表達(dá)差異分析

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，EC1.2.1.12)是糖代謝中有氧氧化和無氧酵解途徑中必需的一種重要催化酶。GAPDH在生物體各種組織中表達(dá)相對(duì)恒定并且表達(dá)水平較高，常常被用作研究其它基因和蛋白表達(dá)的內(nèi)參[1- 4]。隨著代謝組學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)GAPDH還表現(xiàn)出功能的多樣性，它不僅參與能量代謝，還參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)控。例如在細(xì)胞質(zhì)中，GAPDH有磷酸激酶活性、參與催化微管的聚合及細(xì)胞保護(hù)；在生物膜上，GAPDH可促進(jìn)膜融合并參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)等[1, 5-6]。

文獻(xiàn)表明，基因被利用于許多研究中。一方面GAPDH作為內(nèi)參，通過RT-PCR和WB檢測(cè)其它基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，對(duì)基因功能和基因表達(dá)調(diào)控研究起重要作用。例如Wu Y等（2012）和Chauhan AS等（2017）根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)定量PCR引物，然后應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)比較其它基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)節(jié)控制機(jī)制[5-6]。另一方面，有研究者根據(jù)斑馬魚基因序列，設(shè)計(jì)構(gòu)建并原核表達(dá)GAPDH蛋白全長(zhǎng)或部分片段，以原核表達(dá)的蛋白作為抗原物質(zhì)，免疫大白兔或小鼠、山羊等動(dòng)物，制備兔或鼠、羊抗斑馬魚GAPDH蛋白的多克隆抗體，這種單克隆抗體可作為內(nèi)參基因，廣泛應(yīng)用于檢測(cè)比較斑馬魚的其它蛋白表達(dá)水平，并廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)重要的模式動(dòng)物斑馬魚的分子生物學(xué)研究[1, 5-6]。

本研究通過分析斑馬魚基因序列，構(gòu)建原核表達(dá)斑馬魚GAPDH蛋白部分片段，以用于斑馬魚GAPDH多克隆抗體的制備。但由于基因生物進(jìn)化的高度保守性，而宿主菌對(duì)GAPDH蛋白全長(zhǎng)或重要功能區(qū)域的表達(dá)往往具有抵抗性，因而不能有效地通過大量表達(dá)來滿足多克隆抗體制備過程中對(duì)大量蛋白抗原的需要[7-9]。因此，本研究通過克隆斑馬魚基因，然后應(yīng)用生物信息學(xué)分析GAPDH蛋白的分子結(jié)構(gòu)，選擇既能有效地大量表達(dá)，又能較好地純化的GAPDH蛋白的片段來構(gòu)建原核表達(dá)載體；通過大量原核表達(dá)并純化GAPDH蛋白，為制備兔抗斑馬魚GAPDH多克隆抗體做準(zhǔn)備。

1　材料與方法

1.1　材料和試劑

斑馬魚購于中國科學(xué)院水生生物研究所斑馬魚資源中心；大腸桿菌（）DH5α購自上海超研生物科技有限公司；BL21購自北京博凌科為生物科技有限公司；質(zhì)粒pET32a購自上海君瑞生物技術(shù)有限公司。高保真DNA聚合酶PrimeSTAR、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ、dNTP、DL2000 Marker、RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司；180 kDa蛋白質(zhì)Marker購自Solarbio公司；PEG20000購自Biotopped公司；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒及其它生化試劑和藥品均購自生工生物工程有限公司; Ni-NTA His·BindTMResin購于德國Merk Novagen公司。

1.2　主要儀器設(shè)備

美國ABI公司PCR儀；美國Thermo公司高速離心機(jī)；德國sigma公司高速冷凍離心機(jī)；美國Bio-Rad公司垂直電泳；杭州奧盛三聯(lián)多用途金屬??；北京博醫(yī)康雙門層析冷柜（YC-2）；上海智誠生化培養(yǎng)箱（ZXSD-R1430）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWYR-240）等。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1生物信息學(xué)分析與引物設(shè)計(jì)

在NCBI基因信息庫檢索斑馬魚基因及其蛋白氨基酸序列（Danio rerio glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, mRNA, complete cds，NCBI Reference Sequence: NP_001108586.1），利用在線軟件分析基因編碼蛋白的cDNA序列及其ORF，同時(shí)對(duì)其編碼的GAPDH蛋白的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析[17]。根據(jù)分析結(jié)果選擇特定區(qū)域進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)。

1.3.2斑馬魚組織RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄合成

將喂養(yǎng)約1周的斑馬魚用于RNA提?。籖NA提取后利用膠瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA質(zhì)量；同時(shí)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書；反轉(zhuǎn)錄后以斑馬魚內(nèi)參基因β-actin的定量引物通過PCR檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄cDNA的質(zhì)量。

1.3.3斑馬魚GAPDH基因片段的擴(kuò)增

用保守的PrimeSTAR DNA聚合酶對(duì)檢測(cè)合格的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：滅菌去離子水21 μL，10 nmol/L的上下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，PrimeSTAR預(yù)混液25 μL，總體積50 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃ 10 min，然后98 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共38個(gè)循環(huán)，再72 ℃ 7 min 然后至4 ℃結(jié)束。用10 μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)PCR的擴(kuò)增效果。

1.3.4原核表達(dá)GAPDH片段的pET32a質(zhì)粒構(gòu)建

PCR擴(kuò)增基因片段并純化；用限制性內(nèi)切酶I和I對(duì)純化產(chǎn)物和pET32a質(zhì)粒同時(shí)在37 ℃進(jìn)行快速酶切15 min；酶切產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行DNA的純化；純化的DNA和質(zhì)粒用T4DNA連接酶進(jìn)行重組連接，4 ℃酶連24 h。

用酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α及陽性克隆篩選參照文獻(xiàn)[10]；檢測(cè)陽性菌擴(kuò)菌送測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)克隆菌是否重組了目的基因的片段，并通過測(cè)序結(jié)果分析排除突變。

1.3.5測(cè)序分析正確的克隆菌質(zhì)粒提取與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21

通過對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析，選擇構(gòu)建正確無突變的菌進(jìn)行擴(kuò)菌，并提取質(zhì)粒；用提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌BL21，并對(duì)陽性菌進(jìn)行篩選鑒定[10]。驗(yàn)證陽性菌保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6重組蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)

帶有重組有GAPDH基因片段的質(zhì)粒的BL21菌，用小錐形瓶擴(kuò)菌20 mL培養(yǎng)進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)[10]；通過誘導(dǎo)前后樣品的SDS-PAG電泳檢測(cè)誘導(dǎo)前后菌體蛋白表達(dá)的差異，根據(jù)構(gòu)建的基因片段編碼的蛋白大小判斷目的蛋白的表達(dá)是否有誘導(dǎo)效應(yīng)，誘導(dǎo)的蛋白大小與推測(cè)的大小是否一致。

1.3.7重組蛋白的大量表達(dá)和純化

通過小量驗(yàn)證能被IPTG誘導(dǎo)且蛋白大小正確的構(gòu)建菌，進(jìn)行蛋白的大量表達(dá)[10]。

原核表達(dá)的帶His-Tag的融合蛋白的分離純化。購買于Novagen公司的His-Bind Resin用1 mL加液器輕輕吹勻，裝入層析柱，沉積后體積約為2 mL。蛋白純化程序參照His-Tag融合蛋白純化的常規(guī)方法[10]。收集純化的蛋白液用透析袋透析過夜。12 h后用PEG20000對(duì)透析蛋白液進(jìn)行濃縮，直到濃縮到1 mL左右，收集濃縮蛋白置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8 原核表達(dá)蛋白的SDS-PAG電泳

將大量表達(dá)過程收集的誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后，包涵體，純化前，純化后，濃縮后等蛋白樣品加入蛋白loading buffer，混勻，100 ℃加熱5 min，然后進(jìn)行SDS-PAG電泳，檢測(cè)大量表達(dá)過程的誘導(dǎo)效果，純化效果和濃縮效果。

2　結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚GAPDH蛋白結(jié)構(gòu)分析

在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中檢索到斑馬魚基因的完整cDNA核苷酸序列及其編碼氨基酸序列(NCBI Reference Sequence: NP_001108586.1)。將其氨基酸序列輸入SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)[11]，結(jié)果顯示（圖1）蛋白多肽鏈N端2-150氨基酸序列具有一個(gè)高度保守的3-磷酸甘油醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域，而C端則為不規(guī)則的卷曲結(jié)構(gòu)。因此，考慮分別在GAPDH多肽鏈N端和C端分別設(shè)計(jì)引物，部分表達(dá)蛋白多肽鏈的片段。然后選擇表達(dá)和純化效果好的構(gòu)建作為大量表達(dá)的構(gòu)建菌[12-14]。

設(shè)計(jì)引物的位置應(yīng)在斑馬魚GAPDH的ORF范圍內(nèi)，并且要注意不能引起移碼突變。另外，引物外側(cè)還需要加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基[10,15- 16]。根據(jù)設(shè)計(jì)引物的位置，推算ZGCKF/ZGCXR引物對(duì)和ZGNKF/ZGNXR引物對(duì)擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度和表達(dá)的蛋白分子量。結(jié)果如表2，N端蛋白片段分子量為35.1 kD，C端為43.1 kD。

表2　構(gòu)建表達(dá)GAPDH蛋白片段的DNA長(zhǎng)度和蛋白質(zhì)分子量

注 * 蛋白分子量含18kD的融合蛋白。

2.2　GAPDH原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2.1GAPDH基因片段的擴(kuò)增

以斑馬魚組織cDNA作為模板，對(duì)斑馬魚基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增片段以瓊脂糖凝膠電泳顯示，C端片段小于750 bp，N端片段略小于500 bp，如圖2所示。根據(jù)引物對(duì)設(shè)計(jì)時(shí)的預(yù)測(cè)，引物對(duì)ZGCKF/ZGCXR擴(kuò)增的基因的DNA片段長(zhǎng)度約為684 bp；ZGNKF/ZGNXR擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度約為465 bp，從圖2可以看出電泳檢測(cè)的結(jié)果與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

圖中1為引物對(duì)ZGCKF/ZGCXR擴(kuò)增的GAPDH蛋白C端所對(duì)應(yīng)的DNA片段；2為引物對(duì)ZGNKF/ZGNXR擴(kuò)增的GAPDH蛋白N端所對(duì)應(yīng)的DNA片段；中間泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)

2.2.2兩對(duì)引物構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)GAPDH蛋白片段的比較

兩對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，通過重組構(gòu)建到pET32a質(zhì)粒上。通過測(cè)序檢測(cè)結(jié)果顯示，兩種引物擴(kuò)增產(chǎn)物的構(gòu)建都正確，無移碼突變，無提前終止突變也無點(diǎn)突變。將這些正確構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化表達(dá)型大腸桿菌BL21，IPTG小量誘導(dǎo)結(jié)果顯示，ZGCKF/ZGCXR引物對(duì)擴(kuò)增片段構(gòu)建的質(zhì)粒在BL21菌中具有IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的效應(yīng)，如圖3中泳道1和泳道2；而ZGNKF/ZGNXR引物對(duì)擴(kuò)增片段構(gòu)建的質(zhì)粒在BL21菌中則不具有IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的效應(yīng)，如圖3中泳道4和泳道5。具有誘導(dǎo)效應(yīng)的重組質(zhì)粒菌進(jìn)一步進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，通過鎳柱進(jìn)行蛋白純化，濃縮蛋白SDS-PAG電泳顯示（圖3中泳道3），其分子量大小與小量誘導(dǎo)后圖3中泳道2所顯示的誘導(dǎo)蛋白的大小一致，且其大小與引物設(shè)計(jì)時(shí)所預(yù)測(cè)的分子量大小43.1 kD一致。綜合克隆構(gòu)建的測(cè)序分析結(jié)果表明，ZGCKF/ZGCXR引物對(duì)擴(kuò)增的基因片段構(gòu)建的質(zhì)粒所表達(dá)的蛋白，就是GAPDH蛋白中所對(duì)應(yīng)的片段，其可以作為蛋白抗原用來制備GAPDH多克隆抗體。

1、2、3為ZGCKF/ZGCXR引物對(duì)擴(kuò)增構(gòu)建表達(dá)的GAPDH蛋白C端片段，1為未加入IPTG誘導(dǎo)，2為同樣條件下加入IPTG誘導(dǎo)，3為大量表后達(dá)純化濃縮的蛋白；4、5為ZGNKF/ZGNXR引物對(duì)擴(kuò)增構(gòu)建表達(dá)的GAPDH蛋白N端未加入和加入IPTG誘導(dǎo)；箭頭所指為誘導(dǎo)和純化蛋白（43.1kD）

3 討論

本研究設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)斑馬魚GAPDH蛋白的部分片段，為斑馬魚GAPDH多克隆抗體制備準(zhǔn)備GAPDH蛋白抗原。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，兩對(duì)引物中只有一對(duì)引物構(gòu)建的質(zhì)粒具有IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)效應(yīng)，而另外一對(duì)引物則不具有蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)，如圖3所示。究其原因，其差異是兩對(duì)引物設(shè)計(jì)分別位于斑馬魚GAPDH基因編碼的GAPDH蛋白結(jié)構(gòu)的不同區(qū)域，如圖1所示。

大腸桿菌DE3GAPDH蛋白SMART在線結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，顯示GAPDH的N端為3-磷酸甘油醛脫氫酶活性結(jié)構(gòu)域，C端為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺顯示的是大腸桿菌DE3的GAPDH蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列

通過比對(duì)SMART預(yù)測(cè)的斑馬魚和大腸桿菌GAPDH的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)兩者十分相似。它們的N端都是高度保守的催化活性中心的結(jié)構(gòu)域，C端都是不規(guī)則的卷曲結(jié)構(gòu)，如圖1和圖4。事實(shí)上，它們都能夠結(jié)合所催化的底物3-磷酸甘油醛和輔助因子NAD+，并且催化底物產(chǎn)生同樣的產(chǎn)物1,3-二磷酸甘油酸[1-3]。因?yàn)椴还馨唏R魚還是大腸桿菌，甚至人類都需要GAPDH分解葡萄糖來產(chǎn)生能量物質(zhì)ATP。因此，基因是高度保守的管家基因[5-6]。

斑馬魚（Zebra Fish）GAPDH氨基酸序列和大腸桿菌DE3（E. Coli. DE3）GAPDH氨基酸序列來源于NCBI基因數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)分別為NP_001108586.1和AAN80643.1。使用序列比對(duì)軟件ClustalX進(jìn)行比對(duì)?！?”號(hào)表示兩者一致的氨基酸

進(jìn)一步應(yīng)用CluxtalX軟件對(duì)兩者GAPDH的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示它們具有很大的相似性，如圖5所示。對(duì)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)，它們?nèi)L(zhǎng)的氨基酸具有68.3%的一致性，如表3。

表3 斑馬魚與大腸桿菌DE3的GAPDH蛋白多肽鏈的氨基酸序列一致性比較

盡管斑馬魚和大腸桿菌在進(jìn)化上具有較遠(yuǎn)的聯(lián)系，它們?cè)诎被嵝蛄泻偷鞍踪|(zhì)分子結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為高度的進(jìn)化保守性。這可能和它們催化同樣的底物產(chǎn)生同樣的產(chǎn)物有關(guān)；或者說它們雖然在進(jìn)化上距離很遠(yuǎn)，但功能十分相似或相同[5-6]。因此，在大腸桿菌中過表達(dá)的斑馬魚GAPDH，可能也具有類似大腸桿菌GAPDH的作用，從而可能導(dǎo)致大腸桿菌內(nèi)糖代謝異常，從而影響大腸桿菌的生長(zhǎng)甚至生存。因此，大腸桿菌可能通過一定的機(jī)制對(duì)影響其代謝和生長(zhǎng)的過表達(dá)蛋白表現(xiàn)出抑制其表達(dá)的作用。因此，設(shè)計(jì)表達(dá)斑馬魚GAPDH的N端酶活性中心結(jié)構(gòu)域這部分蛋白不具有誘導(dǎo)效應(yīng)。但這種推測(cè)還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

另外一個(gè)方面，引物對(duì)ZGCKF/ZGCXR構(gòu)建表達(dá)斑馬魚GAPDH蛋白C端的蛋白片段，由于這一片段避開了GAPDH的活性中心，它在大腸桿菌中的過表達(dá)不會(huì)影響大腸桿菌的代謝，也不會(huì)威脅它的生長(zhǎng)和生存，因此，它的表達(dá)具有IPTG的誘導(dǎo)效應(yīng)[13-15]。盡管這一片段的氨基酸的一致性要略高于不能誘導(dǎo)的這一片段，如表3。

綜上所述，對(duì)于真核蛋白的原核表達(dá)，特別是高度保守的管家基因的過表達(dá)，在策略上應(yīng)當(dāng)考慮真核蛋白是否會(huì)影響或干擾宿主的代謝，導(dǎo)致宿主的抵抗[5, 13-15]。因此，在設(shè)計(jì)部分表達(dá)時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡量避開其活性部位。

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VARIATION ANALYSIS OF PROKARYOTIC EXPRESSION OF THE PROTEIN FRAGMENTS FROM ZEBRA FISH GAPDH

LIAO Si-ning, LI Song, CHU Kai-miao, ZENG Fei, ZHANG Biao,*HU You-sheng

（School of Basic Medicine and Pharmacy, Medical College, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China）

To analyze the variation of induction effect of the prokaryotic expressed Zebra fish GAPDH protein fragments which were constructed by different primers, the molecular structure of Zebra fish GAPDH was analyzed by bioinformatics approaches, and the targeting deletion technique was applied to construct the recombinant plasmids for partially expressed GAPDH. Then the variation of protein expression by the recombinant plasmids were induced with IPTG and detected by SDS-PAGE. And the primers had the efficiency of IPTG induced expression to the recombinant plasmids constructed by ZGCKF/ZGCXR, but not for ZGNKF /ZGNXR. The results indicated that it should be considered if the eukaryotic proteins will affect the metabolism of the prokaryotic host when the eukaryotic proteins over-expressed in prokaryotic organism, and result in the resistance of the host bacteria. Hence, proper region of the protein should be considered to express efficiently when the primers were designed.

Zebra fish; GAPDH; prokaryotic expression of the protein fragment; analysis of the variation of expression

1674-8085(2018)01-0037-06

Q786

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.01.009

2017-11-17；

2017-12-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560595)；井岡山大學(xué)第六批大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(63)

廖思寧(1997-)，女，江西贛州人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級(jí)本科生(E-mail:804358470@qq.com); 李 松(1995-)，男，江西撫州人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2013級(jí)本科生(E-mail:1769401545@qq.com); 褚開淼(1997-)，女，湖南張家界人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級(jí)本科生(E-mail:1505790694@qq.com); 曾 菲(1997-)，女，江西吉水人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級(jí)本科生(E-mail:1031281322@qq.com); 張 彪(1997-)，男，江西泰和人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級(jí)本科生(E-mail:2504511574@qq.com); *胡有生(1968-)，男，江西吉水人，副教授，博士，主要從事分子免疫學(xué)研究(E-mail:huyousheng68@163.com).