趙晟昊 李 彤 王 凡

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100

目前腦卒中已是中老年人的常見病與多發(fā)疾病，也是我國居民的第一大死亡原因以及首位致殘因素[1-2]。腦動脈粥樣硬化(cerebral atherosclerosis，CAS)是缺血性腦血管病的首要誘發(fā)因素，尤其彌漫性的小血管病變類型，目前無有效的治療辦法[3-4]。為多發(fā)性、彌漫性CAS所致的腦缺血尋找一個有效的治療方法，以改變目前治療方法少且效果差的現(xiàn)狀，目前想到的是改變血運情況，但如何重建有效的血供是值得廣大醫(yī)學工作者深思的問題[5-6]，從而為解決老齡化社會癡呆和腦梗死預防的難題打下基礎。自從“基因治療使心臟生成新血管”被列為美國心臟學會1998年度公布的十大研究項目之首，促血管生長細胞因子促血管新生的研究便成為醫(yī)學領域關注的熱點[7-8]。從2005年至今，《Nature》《Science》《Cell》等有關腦血管形成的分子機制研究始終引領本學科的前沿領域。諸多相關基因的功能與信號轉導機制在胚胎腦血管發(fā)生中的發(fā)現(xiàn)，為成年腦血管新生機制的研究奠定了理論基礎[9]。Ad-HGF目前已經(jīng)進入臨床Ⅲ期試驗，并在心肌缺血和骨骼肌缺血治療并獲良好評價，目前，與HGF關系密切并具有明確相互作用的是TGF-β1[10-11]。

本實驗通過向老齡CAS大鼠蛛網(wǎng)膜下腔中注入外源性Ad-HGF，觀察其促腦血管新生的作用，采用ELISA法分析CAS大鼠腦脊液中HGF和TGF-β1含量，采用免疫組化和免疫印跡法分析腦組織中HGF和TGF-β1含量，探討HGF、TGF-β1相互間作用關系與大鼠老齡和CAS的相關性。

1 材料和方法

1．1主要材料Ad-HGF(攜帶人HGF基因的重組腺病毒，滴度為5×109pfu/100 μL，北京奧洛英)，Westernblot試劑盒(碧云天)，鼠抗HGF單克隆抗體，鼠抗TGF-β1單克隆抗體，Western blot試劑盒，人HGF及鼠TGF-β1的ELISA檢測試劑盒(南京森貝伽)，膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶、豬油、蛋黃粉、蔗糖(北京索萊寶)，手術顯微鏡，大鼠腦立體定位儀，微型手持式顱鉆，25 μL微量注射器，ML125鼠尾無創(chuàng)血壓測定儀，Powerlab生理信號采集與處理系統(tǒng)(Powerlab/8SP Australia)，奧林帕斯AU2700全自動生化分析儀。

1．2動物模型建立SPF級18月齡雄性SD大鼠30只，體質量300～400 g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2012-0001，實驗動物設施使用許可證：SYXK(豫)2014-0005]，隨機分為對照組(n=15)和腦動脈硬化模型組(CAS，n=15)。采用高血壓合并高脂飼料喂養(yǎng)制備腦動脈硬化動物模型，造模方法按有關文獻[12]處理，造模處理后凡血壓較處理前高20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上且高于115 mmHg認為形成高血壓模型[13]。大鼠喂養(yǎng)16周后，模型組TC、TG、LDL-C水平均明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義。模型組隨機取大鼠5只，常規(guī)腹腔麻醉后，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液經(jīng)心臟灌注后，斷頭取頸內動脈終段(約0.5 cm)，制成石蠟切片并進行HE染色，光鏡下觀察頸內動脈血管病變。頸內血管形態(tài)學觀察到血管內皮表面粗糙凹凸不平，細胞排列不規(guī)整，大量泡沫細胞堆積，血管內膜增厚顯著，形成典型的AS斑快，提示CAS造模成功。

1．3藥物處理建模成功后，另用40只造模大鼠隨機分為模型組、模型Ad-HGF組各20只；模型Ad-HGF組20只大鼠5×109pfu/mL，0.05 mL的Ad-HGF經(jīng)小腦延髓池注射入蛛網(wǎng)膜下腔中。模型組大鼠20只，經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔注射0.05 mL生理鹽水。1月齡雄性SD大鼠40只，隨機抽取20只經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔中，注射5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF。另取40只1月齡大鼠，隨機抽取20只經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF，另外20只經(jīng)小腦延髓池至蛛網(wǎng)膜下腔注射0.05 mL生理鹽水。6月齡雄性SD大鼠40只，隨機抽取20只經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔注射5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF，另外20只經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔0.05 mL生理鹽水。12月齡雄性SD大鼠40只，隨機抽取20只經(jīng)小腦延髓池至蛛網(wǎng)膜下腔注射5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF，另外20只經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔0.05 mL生理鹽水。

1．4 實驗方法

1．4．1 ELISA法測定腦脊液中HGF和TGF-β1濃度

1．4．1．1 腦脊液的采集：將大鼠麻醉后，再將頭部固定于立體定位儀上，頭頸部剃毛、消毒干凈后，用手術刀在后頸部作一3 cm縱向切口，輕輕分離頸部背側的肌肉。術中及時止血，在暴露出枕骨大孔后。將大鼠頭部壓低，垂直由枕骨大孔向內進針抽取腦脊液，注意勿插入過深。抽完后縫好里面肌肉及外面皮膚，用干凈紗布包扎傷口，防止感染。采集腦脊液后，應注入等量的生理鹽水，以維持原有顱內的壓力。最后將腦脊液移入1.5 mL的EP管中，放入液氮或干冰中迅速冷凍后移入-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4．1．2 ELISA檢測實驗步驟：依試劑盒所提供的方法，嚴格進行ELISA檢測。配置2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL的標準品各0.1 mL，每孔加入100 μL標準品或待測腦脊液。另設零孔2個，酶標板加上蓋，37 ℃反應90 min。反應后用力甩盡酶標板內液體，再對著吸水紙拍幾下，不洗。將準備好的生物素一抗工作液以每孔0.1 mL的標準依次加入(TMB空白顯色孔除外)孔內，溫箱內37 ℃下反應60 min。然后用PBS液洗滌酶標板3次，每次浸泡1 min以上。再用試劑盒中的ABC工作液按每孔0.1 mL的標準依次加入(TMB空白顯色孔除外)各孔中，溫箱內37 ℃下反應30 min，然后重復前面洗板工作。最后每孔依次加入等量的TMB顯色液，溫箱內37 ℃下避光反應30 min。最后每孔依次加入TMB終止液1滴并混勻，用酶標儀在450 nm處測吸光值OD。結果計算與判斷：以零孔為對照，測得的數(shù)據(jù)以吸光值OD作為縱坐標，以濃度作為橫坐標，在電腦中繪制出標準曲線，計算樣品含量。

1．4．2 Western印跡檢測：取-80 ℃冰箱內保存的各組大鼠的腦皮質，每組80 mg，用液氮研磨后分別加入蛋白裂解液后離心、取上清液，BCA法測定各組蛋白質濃度，每個樣品上樣80 μg，按總的蛋白質量計算各樣品所需體積，需配平體積，再加入3倍Buffer煮沸5 min。再用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入HGF或TGF-β1一抗，一抗?jié)舛染鶠?：1 000，在4 ℃下孵育過夜。第2天室溫下復溫60 min，用TBST洗膜3次，每次10 min以后，加入對應的辣根過氧化物酶標記的二抗(濃度均為1：2 000)，室溫搖床上孵育2 h，再加入DAB顯色液在凝膠成像系統(tǒng)中進行曝光和圖像分析，用Image Q軟件分析蛋白質條帶，并計算出各個條帶的面積與灰度值大小，計算二者乘積為積分灰度值，取3次重復測定值的均數(shù)。

1．4．3 觀察指標：采用ELISA法測定各組大鼠腦脊液中HGF、TGF-β1的動態(tài)變化。采用Western blotting測定各組大鼠腦組織中HGF、TGF-β1蛋白雜交條帶，與內參進行相對密度掃描求OD值。

1．5統(tǒng)計學處理應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，對于符合方差分析應用條件的，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著性差異(LSD)檢驗；不滿足方差分析條件時，組間多重比較采用Dunnett’s T3檢驗。假設檢驗統(tǒng)一使用雙側檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1腦脊液中HGF、TGF-β1濃度未打入Ad-HGF組大鼠腦脊液中均未檢測到HGF，打入Ad-HGF組可在腦脊液中可檢測到HGF濃度。經(jīng)Dunnett’s T3法組間多重比較，打入Ad-HGF組腦脊液HGF濃度值均高于未打入Ad-HGF組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，腦脊液HGF濃度值隨年齡增加而降低，腦脊液HGF濃度值未打入Ad-HGF組間比較差異無統(tǒng)計學意義，打入Ad-HGF組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組大鼠腦脊液HGF濃度比較

經(jīng)Dunnett’s T3法組間多重比較，打入Ad-HGF的組別腦脊液TGF-β1濃度值均高于未打入Ad-HGF的組別，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；腦脊液TGF-β1濃度值隨年齡增加而增加，各組內不同時間比較，經(jīng)one way ANOVA分析，未打入Ad-HGF的組別腦脊液TGF-β1濃度值隨時間變化差異無統(tǒng)計學意義，3個年齡Ad-HGF組腦脊液TGF-β1濃度值隨時間變化差異有統(tǒng)計學意義，經(jīng)LSD法組間多重比較，TGF-β1濃度第20天組低于第10天和第30天組(表2)。

表2 不同時間點各組大鼠腦脊液TGF-β1濃度比較

2．2 Western blotting法檢測腦組織HGF、TGF-β1蛋白表達未打入Ad-HGF的組別大鼠腦組織中只有較少HGF表達，打入Ad-HGF的組別腦組織可見HGF表達增多，同一時間點打入Ad-HGF的組別均較未打入Ad-HGF的組別有明顯增加。經(jīng)Dunnett’s T3法組間多重比較，未打入Ad-HGF的模型組HGF OD值高于未打入Ad-HGF的增齡組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。打入Ad-HGF的增齡組HGF值隨年齡增加而降低，經(jīng)LSD法組間多重比較，第20天組高于第10天和第30天組(圖1，表3)。

未打入Ad-HGF增齡組大鼠腦組織中TGF-β1表達較少，但在未打入Ad-HGF的模型組大鼠腦組織中TGF-β1明顯增加。打入Ad-HGF組腦組織可見TGF-β1表達減少。TGF-β1 OD值隨年齡的增加呈正相關(表4)。各組內不同時間之間比較，經(jīng)one way ANOVA分析，未打入Ad-HGF增齡組大鼠腦組織中TGF-β1 OD值隨時間變化無差異，未打入Ad-HGF的模型組和3個年齡Ad-HGF組腦組織中TGF-β1 OD值隨時間變化有差異，經(jīng)LSD法組間多重比較，第20天組低于第10天和第30天組(P<0.05，圖2，表4)。

表3 不同時間點各組大鼠腦組織中HGF OD值比較

表4 不同時間點各組大鼠腦組織中TGF-β1 OD值比較

圖1 Western blotting HGF蛋白表達 A：1月組；B：6月組；C：12月組；D：1月Ad-HGF組；E：6月Ad-HGF組；F：12月Ad-HGF組；G：模型組；H：模型Ad-HGF組

圖2 Western blotting TGF-β1蛋白表達 A：1月組；B：6月組；C：12月組；D：1月Ad-HGF組；E：6月Ad-HGF組；F：12月Ad-HGF組；G：模型組；H：模型Ad-HGF組

3 討論

本實驗將外源性HGF打入3組增齡大鼠組，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，HGF水平逐漸降低，隨年齡增加，TGF-β1水平逐漸升高。而將外源性HGF打入老齡腦動脈粥樣硬化模型大鼠后，隨著動脈硬化程度加深，機體內HGF水平逐漸增加，TGF-β1水平卻逐漸降低。說明HGF與動脈硬化程度呈正相關，與年齡呈負相關，TGF-β1與動脈硬化程度呈負相關，與年齡呈正相關。HGF、TGF-β1水平隨年齡變化呈動態(tài)互逆平衡，HGF、TGF-β1水平隨腦動脈硬化程度呈動態(tài)互逆平衡。

HGF 的快速誘導表達在遙遠的完整器官中很常見，如肝、腎、肺、脾，以及在受傷在大鼠缺血再灌注損傷后的心及大腦中[14]，表明內源性HGF可能來自這些器官。在肝、腎損傷大鼠血漿中，也有體液因子誘導HGF的表達[15]。轉化生長因子β1可以由急性和慢性腦損傷引起，包括卒中、外傷、癲癇、多發(fā)性硬化癥和阿爾茨海默病[16]。轉化生長因子β1在不同類型的腦損傷中表達是不一樣的，不同類型腦損傷時，TGF-β1有不同對應：卒中時TGF-β1的mRNA至少升高1周以上，明確發(fā)揮保護神經(jīng)細胞的作用[17]。有文獻報道，卒中時TGF-β1過度表達[18-20]；當TGFβ信號被阻斷，缺血損害加劇[21]。因此，它可能是一種有效的卒中治療劑。

HGF、TGF-β1之間相互的平衡，參與確定的慢性器官疾病的預后，如腦梗死、肝硬化、腎硬化和肺纖維化[22-23]。在慢性疾病的早期階段，HGF生產(chǎn)增強抑制TGF-β1產(chǎn)生。一般來說，HGF只在細胞再生和抗肝纖維化事件中作為代償反應發(fā)生[24-25]。相比之下，在晚期TGF-β1表達的上調抑制HGF的表達[26]。在TGF-β1占主導地位的條件下，容易導致器官纖維化的發(fā)生和器官發(fā)展為功能障礙。為扭轉這種不利的平衡，根據(jù)這種發(fā)病機制，所以用HGF治療器官的功能衰竭以及纖維化(及增生)應視為一種新策略[27-29]。

本實驗通過建立增齡及動脈硬化模型大鼠實驗，探討了腦組織和腦脊液中HGF和TGF-β1含量變化與年齡以及動脈硬化的關系，初步顯示HGF-TGF-β1平衡在老齡以及腦動脈硬化發(fā)生、發(fā)展中的神經(jīng)保護和血管形成過程中的作用，明確外源性Ad-HGF應用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效性和不良反應。本實驗對Ad-HGF應用于腦動脈硬化臨床提供了科學依據(jù)，對腦血管病的防治提供了一種新的治療方法和研究方向，也為神經(jīng)康復治療提供一個新途徑。

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