陳靜 李鵬飛 吳杰 孟勝利 申碩 王澤鋆

443002宜昌,三峽大學醫(yī)學院(陳靜)；430207武漢生物制品研究所病毒性疫苗研究一室(陳靜、李鵬飛、吳杰、孟勝利、申碩、王澤鋆)

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是全球性傳染病,以嬰幼兒發(fā)病為主。根據(jù)中國疾病預防控制中心數(shù)據(jù)顯示,自2009年以來,每年HFMD報告病例數(shù)均在100萬以上,發(fā)病數(shù)和死亡人數(shù)在丙類傳染病中一直居第一,嚴重威脅兒童生命健康。引起HFMD的病毒屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬,包括柯薩奇病毒(Coxsackie virus)A 組的 2、4、5、6、7、9、10、16 型等,B 組的1、2、3、4、5、13 型等,腸道病毒71 型(human enterovirus 71,EV71),?？刹《?echo viruses)等[1-2]。2013年以前,EV71和CVA16是 HFMD的主要病原體[3]。近幾年,CVA6感染病例數(shù)急速上升,甚至在我國多地替代EV71或CVA16成為引起HFMD暴發(fā)的主要病原體[4-8]。因此,CVA6已成為繼EV71和CVA16后,最值得關注的引起HFMD的腸道病毒病原體,但是目前關于CVA6的研究報道較EV71和CVA16少,用于CVA6抗原檢測的抗體等試劑缺乏。

CVA6為無包膜,正二十面體衣殼,單股正鏈RNA病毒,基因全長約7.4 Kb,兩端為保守的非編碼區(qū),中間為編碼區(qū)。編碼區(qū)編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白有4種,即VP1～VP4,VP4位于病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接,VP1、VP2和VP3裸露于病毒顆粒的表面,包含了主要的抗原決定簇。本研究選擇了CVA6的VP1和VP2片段,將CVA6-VP1和CVA6-VP2基因分別整合入pGEX-6p-1載體,然后導入大腸埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG誘導表達出GST融合蛋白,用作抗原免疫家兔后,獲得兔抗血清,并進行了鑒定,為進一步研究CVA6提供抗原檢測試劑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購自NEB公司；蛋白預染Marker、FITC標記羊抗兔IgG購自Thermo公司；硝酸纖維素膜購自Pall公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自Sigma公司；HRP標記的羊抗兔IgG購自博士德公司；HRPDAB顯色試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA分子量標準品購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司；PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit,購自TaKaRa公司；Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0 plus dye)購自TaKaRa公司；其他常規(guī)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒與毒株：感受態(tài)細胞E.coliDH5α和表達菌株E.coliBL21(DE3)由本實驗室保存；質(zhì)粒pGEX-6p-1為本實驗室保存；CVA6病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)由本課題組制備純化(數(shù)據(jù)未發(fā)表)；CVA6原型株Gdula購自ATCC。

1.1.3 實驗動物：新西蘭大白兔,雄性,2.0～2.2 Kg,由武漢生物制品研究所有限責任公司動物室提供。

1.1.4 細胞：人惡性胚胎橫紋肌瘤細胞(human Rhabdomyosarcoma,RD)由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的擴增：以CVA6中國湖北分離株(序列未發(fā)表)VP1和VP2片段序列設計上下游擴增引物,并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列如下：VP1上游引物 F：5′-CCGGAA TTCAATGATCCCATTACAAATGCAG-3′,VP1 下游引物 R：5′-CCGCTCGAGTTAAGATGTCCTTTGTGGGTT TGC-3′；VP2 上游引物 F：5′-CCGGAATTCTCCCCTTC TGTTGAGGCGTGC-3′,VP2 下游引物 R：5′-CCGC TCGAGTTATTGTTTTATTGCTTGTCGGAG-3′。 其 中上游引物含EcoRI酶切位點,下游引物含XhoI酶切位點。按照試劑盒步驟操作,提取CVA6病毒核酸RNA,按照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明,以RNA為模板合成第一鏈cDNA。然后以cDNA為模板,F、R為引物進行 PCR擴增,50μl PCR 反應體系為：dd H2O 22μl、2×Premix LA Taq 25 μl、引物 F 1 μl、引物R 1 μl、cDNA(≥50 ng/μl)1μl。反應條件為：94℃ 預變性4 min,94℃ 30 s、50℃30 s、72℃ 1 min,共35個循環(huán),最后延伸72℃7 min。獲得目的片段后,將條帶大小正確的PCR回收產(chǎn)物及測序引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定。

1.2.2 重組表達載體的構(gòu)建和鑒定：PCR產(chǎn)物和pGEX-6p-1載體分別經(jīng)EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶進行雙酶切,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離條帶后切膠回收,回收的目的基因與pGEX-6p-1載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.ColiDH5α,獲得的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-CVA6-VP1和pGEX-6p-1-CVA6-VP2經(jīng)雙酶切和PCR鑒定后,送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.3 融合蛋白的誘導表達：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.ColiBL21(DE3),菌落PCR挑選陽性克隆,提取質(zhì)粒測序鑒定。將含重組質(zhì)粒的菌株E.ColiBL21(DE3)接種至5 ml含100μg/ml Ampicillin的液體LB培養(yǎng)基中,于37℃,200 rpm的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)至A450值為0.6～0.8(約2 h),取1 ml菌液作為誘導前對照,其余4 ml菌液中加入IPTG至其終濃度為0.5 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h,取0.5 ml菌液做誘導后分析。5 000×g,室溫離心1 min收集誘導前后菌體,加入ddH2O重懸菌體,與SDSloading buffer混勻,在100℃恒溫金屬浴中加熱10 min,短暫離心,進行SDS-PAGE,判斷融合蛋白表達情況。

1.2.4 融合蛋白的純化及鑒定：將陽性表達菌株擴大培養(yǎng),6 000×g離心15 min收集誘導表達后的菌體沉淀,加入預冷的0.01 mol/L PBS重懸后放置于超聲細胞破碎機進行超聲裂解。裂解液于6000×g離心分離上清和沉淀,分別取樣分析目的蛋白的表達量及表達形式。判斷GST-VP1和GST-VP2融合蛋白為非可溶性蛋白后,采用蛋白電泳,切膠回收目的蛋白,以恒流10mA/管,電洗脫純化目的融合蛋白,SDS-PAGE電泳,染色,脫色后通過灰度掃描軟件Quantity One對目的蛋白作初步定量分析和純度分析。蛋白洗脫液在1～2 L 0.01 mol/L PBS中4℃透析24 h,去除SDS等雜質(zhì),PBS更換至少3次,透析后的蛋白用作免疫抗原。

1.2.5 多克隆抗體的制備：將純化后的GST-VP1和GST-VP2以0.6 mg/只抗原量分別免疫家兔,通過皮下多點注射方式進行免疫。免疫前通過耳動脈采血5 ml,37℃放置2 h,2 000×g,4℃離心20 min之后分離血清,作為陰性對照?？乖o以等體積弗氏完全佐劑(FCA)混合乳化后進行初免,7 d后輔以弗氏不完全佐劑(FICA)加強免疫,之后每隔14 d輔以FICA加強,一共免疫5針。第4針結(jié)束后以Western blot(WB)對血清效果進行鑒定。最后一次加強免疫10 d后對家兔進行頸動脈采血,離心分離血清,分裝后于-20或-80℃保存。

1.2.6 WB檢測：將菌株 BL21(DE3)表達產(chǎn)物、CVA6病毒收獲液或CVA6 VLPs經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后,通過電轉(zhuǎn)印儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,用 PBST洗膜3次,將膜置于含1%BSA的PBST緩沖液,室溫1 h封閉,加入抗CVA6-VP1或抗CVA6-VP2兔抗血清,室溫溫和振蕩1 h,PBST洗膜3次,加入HRP標記羊抗兔IgG抗體(1∶2000稀釋),室溫孵育1 h,PBST洗膜3次,DAB顯色液顯色。

1.2.7 間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence assay,IFA)：以1×105/ml的密度在6孔板中加入細胞,2 ml/孔。37℃,5%CO2培養(yǎng)24 h。移除舊培養(yǎng)基,加入1 ml的0.01 mol/L PBS漂洗2次,每孔加入2 ml細胞維持液。取適量病毒收獲液上清接種于6孔板,保留未接種病毒的細胞孔作為陰性對照,37℃,5%CO2培養(yǎng)48 h。移除舊的培養(yǎng)基,每孔加入PBS-4%多聚甲醛,室溫固定30 min；移除多聚甲醛,以0.01 mol/L PBS漂洗3次。加入透化封閉液,室溫反應30 min；移除透化封閉液,PBS洗3次,加入稀釋的抗CVA6-VP1或抗CVA6-VP2兔抗血清,室溫孵育1 h；移除一抗,PBS洗3次,加入G488-驢抗兔二抗(1∶500),37℃避光孵育1 h；移除二抗,PBS洗3次,以熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果并拍照保存結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 pGEX-6p-1表達載體的構(gòu)建通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增CVA6-VP1全長基因編碼區(qū)(915 bp)和CVA6-VP2全長基因編碼區(qū)(789 bp)),分別將其插入表達載體 pGEX-6p-1。重組質(zhì)粒經(jīng) PCR和EcoRI、XhoI雙酶切鑒定正確。將鑒定正確的質(zhì)粒進行測序,序列正確的重組質(zhì)粒命名為pGEX-6p-1-CVA6-VP1和pGEX-6p-1-CVA6-VP2,以上載體質(zhì)粒表達后,GST蛋白融合在各個病毒目的蛋白的N末端。

2.2 GST-VP1和GST-VP2融合蛋白的表達與純化將表達CVA6-VP1或CVA6-VP2的pGEX-6p-1載體轉(zhuǎn)化至E.ColiBL21(DE3),挑取單個菌落培養(yǎng),以IPTG誘導,分別收集誘導前后菌體并制備細菌裂解液。以SDS-PAGE對蛋白表達情況進行分析。由于GST蛋白標簽本身相對分子質(zhì)量約25×103,因此融合蛋白GST-VP1和GST-VP2相對分子質(zhì)量約55×103。如圖1A所示,誘導后樣品在預期位置可觀察到清晰的條帶,而未誘導的樣品在相應位置沒有大量的蛋白表達。超聲波破碎菌體后,分別收獲裂解液上清及沉淀進行SDS-PAGE電泳(圖1B),分析結(jié)果表明重組蛋白主要存在于破菌沉淀中,以包涵體形式存在。通過大型SDS-PAGE制備電泳分離目的蛋白并進行切膠回收純化,最終獲得用于抗體制備的重組VP1和VP2蛋白。

注：M：蛋白質(zhì)markers；(A)1-2：含重組質(zhì)粒的未誘導菌液(1：GST-VP1,2：GST-VP2)；3-4：含重組質(zhì)粒的IPTG誘導菌液(3：GST-VP1,4：GST-VP2)；(B)1-2：誘導菌液超聲破碎離心后的上清(1：GST-VP1,2：GST-VP2)；3-4：誘導菌液超聲破碎后離心的沉淀(3： GST-VP1,4：GST-VP2)；5-6：純化后的融合蛋白(5： GST-VP1,6：GST-VP2)圖1 GST-VP1和GST-VP2表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Note：M： protein markers；(A)Medium of BL-21(DE3)with pGEX-6p-1-CVA6-VP1 and pGEX-6p-1-CVA6-VP2 before(1,2)and after(3,4)induction,respectively；(B)1-2： The supernatants of cell lysates withpGEX-6p-1-CVA6-VP1 and pGEX-6p-1-CVA6-VP2 induced,respectively；3-4： The pellets of cell lysates with pGEX-6p-1-CVA6-VP1 and pGEX-6p-1-CVA6-VP2 induced,respectively； 5-6： the purified fusion protein： GST-VP1 and GST-VP2,respectivelyFig.1 Analysis of GST-VP1 and GST-VP2 fusion proteins by SDS-PAGE

2.3 WB鑒定多克隆抗體將抗CVA6 VP1或CVA6 VP2 抗血清分別以1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000及1∶8 000倍比稀釋作為一抗,每泳道以2μg純化的融合蛋白為檢測對象,進行 WB分析。結(jié)果表明抗血清在相對分子質(zhì)量55×103附近能檢測到符合預期大小的條帶,抗血清稀釋度達到1∶8 000時檢測結(jié)果仍為陽性。

為了檢測制備的抗CVA6 VP1和CVA6 VP2抗血清的特異性,首先以CVA6原型株Gdula在RD細胞上培養(yǎng)后的病毒收獲液為抗原,未感染病毒的RD細胞培養(yǎng)上清為陰性對照抗原。抗CVA6 VP1和抗CVA6-VP2兔抗血清均按1∶3 000稀釋進行WB。結(jié)果表明,抗CVA6 VP1兔抗血清與CVA6病毒蛋白能反應,在VP1蛋白相應位置(相對分子質(zhì)量35×103)附近有明顯條帶；同樣抗CVA6-VP2兔抗血清也能與CVA6病毒蛋白反應,在VP0蛋白(VP2+VP4)相應位置(相對分子質(zhì)量38×103)和VP2蛋白相應位置(相對分子質(zhì)量28×103)附近均有明顯條帶,而未感染細胞的泳道未出現(xiàn)相應條帶。

進一步將實驗室純化后的CVA6 VLPs通過SDS-PAGE電泳和WB進行分析,SDS-PAGE電泳結(jié)果可見3條清晰條帶,和VP0、VP1、VP3位置相當,相對分子質(zhì)量分別約為38×103、35×103、26×103(圖2A)。同時通過WB檢測VLPs的蛋白表達情況,用抗CVA6-VP1和抗CVA6-VP2兔抗血清作為一抗,圖2B結(jié)果顯示,表達蛋白和多抗均有特異性反應,抗CVA6-VP1兔抗血清與CVA6 VLPs在VP1蛋白相應位置(相對分子質(zhì)量35×103)附近有明顯條帶；抗CVA6-VP2兔抗血清與CVA6 VLPs在VP0蛋白(VP2+VP4)相應位置(相對分子質(zhì)量38×103)有明顯條帶。以上結(jié)果表明所制備的多克隆抗體具有良好的特異性。

注：M. 蛋白質(zhì) markers；A.SDS-PAGE 結(jié)果；B.Western blot結(jié)果,一抗：抗CVA6-VP1或抗CVA6-VP2兔抗血清1∶3000稀釋圖2 純化CVA6 VLPs病毒蛋白的SDS-PAGE和Western blot檢測Note：M.Protein markers； A.SDS-PAGE profile； B.Western blot results,Rabbit anti-CVA6-VP1 or anti-CVA6-VP2 antiserum was used at a dilution of 1∶3000,respectively.Fig.2 Detection of viral proteins in purified CVA6 VLPs by SDS-PAGE and Western blot

2.4 IFA鑒定多克隆抗體CVA6(Gdula株)接種RD細胞,培養(yǎng)48 h后固定細胞,將抗CVA6 VP1和CVA6 VP2抗血清作為一抗進行IFA,抗血清分別以1：50、1∶100、1∶200 及 1∶400 倍比稀釋,結(jié)果感染CVA6的RD細胞有明顯的綠色熒光信號,抗血清稀釋度達到1∶400時檢測結(jié)果仍為陽性,而未感染CVA6的RD細胞則沒有綠色熒光信號(圖3為抗血清稀釋1∶100時,為適宜的IFA使用效價)。IFA結(jié)果表明抗CVA6-VP1和抗CVA6-VP2多克隆抗體均可特異性識別天然的CVA6抗原。

注：對感染或未感染CVA6 48 h后的RD細胞進行IFA；一抗：兔抗CVA6-VP1和CVA6-VP2多抗,1∶100稀釋圖3 抗CVA6-VP1和抗CVA6-VP2多克隆抗體的間接免疫熒光試驗鑒定Note：Indirect immunofluorescence assay using rabbit anti-CVA6-VP1 or VP2 antiserum against mock-infected and infected RD cells(rabbit antiserum at a dilution of 1∶100).Fig.3 Analysis of anti-CVA6-VP1 and anti-CVA6-VP2 polyclonal antibody by indirect immunofluorescence assay

3 討論

近年來CVA6引起的HFMD發(fā)病率正逐年持續(xù)升高。自2008年芬蘭開始,在歐洲、美洲、亞洲多個國家和地區(qū)都有CVA6相關HFMD的暴發(fā)流行[9-14]。尤其值得關注的是,CVA6引起的HFMD易發(fā)生非典型性皮疹和脫甲癥,且呈現(xiàn)成人發(fā)病率高和冬季發(fā)病的特點[15-17],稱為非典型HFMD。成熟CVA6感染性病毒顆粒由VP1、VP2、VP3和VP4蛋白組成,在病毒的裝配過程中,VP2和VP4由前體蛋白VP0裂解而來。CVA6病毒顆粒主要存在兩種形態(tài),空心顆粒(empty particle,EP)由蛋白VP0、VP1、VP3組成,實心顆粒(full particle,FP)由結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4組成,所以VP2是區(qū)別EP和FP的重要蛋白。而VP1是腸道病毒重要的衣殼蛋白,含有細胞受體分子結(jié)合位點,可能存在多個中和抗原表位區(qū)域,是藥物作用、免疫診斷和疫苗研制的靶蛋白。但目前關于CVA6的研究較少,市場上也沒有CVA6抗體,因而本研究制備VP1和VP2多克隆抗體為CVA6的相關研究提供工具和方法。

本研究將CVA6 VP1和VP2基因分別整合入pGEX-6p-1載體,然后導入大腸桿菌BL21-DE3菌株,IPTG誘導表達出GST融合蛋白,其主要以包涵體形式存在于細胞內(nèi),純化后獲得的高純度蛋白作為抗原免疫家兔后,制備的抗 CVA6-VP1和抗CVA6-VP2兔抗血清經(jīng)WB和IFA鑒定,證明可以檢測到CVA6-VP1或CVA6-VP2蛋白,并且兔抗血清WB的效價達1∶8000以上,IFA的效價達1∶400以上。

WB鑒定抗血清時,本研究首先用CVA6原型株Gdula在RD細胞上培養(yǎng)后的病毒收獲液為抗原,以未感染病毒的RD細胞培養(yǎng)上清為陰性對照抗原,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗CVA6 VP1和抗CVA6 VP2兔抗血清均能與CVA6病毒收獲液的蛋白反應,分別在VP1、VP0(VP2+VP4)和VP2蛋白相應位置有明顯條帶,而未感染細胞泳道未出現(xiàn)相應條帶,初步表明制備的抗血清能檢測到CVA6 VP1或VP2、VP0蛋白。但病毒收獲液中的蛋白成分復雜,為了進一步確認抗血清識別的蛋白,本研究將實驗室純化后的CVA6 VLPs同時進行SDS-PAGE和WB分析,本實驗用到的CVA6 VLPs是利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng),將含有CVA6病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因P1和蛋白酶基因3CD的重組桿狀病毒質(zhì)粒pBacmid-P1-3CD轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞,獲得重組桿狀病毒rBac-CVA6-P1-3CD,再利用重組桿狀病毒感染sf9昆蟲細胞,收獲上清,鑒定后對其進行純化,最終獲得CVA6 VLPs,其SDS-PAGE結(jié)果說明P1前體蛋白被3CD作用切割產(chǎn)生了 VP0(VP2+VP4)、VP1和VP3,同時結(jié)合WB檢測進一步證明本研究制備的抗CVA6-VP1抗血清能檢測到CVA6-VP1蛋白,抗CVA6-VP2兔抗血清能檢測到CVA6-VP0(VP2+VP4)蛋白。這兩個實驗表明本實驗所制備的抗CVA6-VP1和抗CVA6-VP2多克隆抗體適用于WB分析。IFA鑒定抗血清時,結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染CVA6的細胞有明顯的綠色熒光信號,而未感染CVA6的細胞則沒有綠色熒光信號,表明抗CVA6 VP1和抗CVA6 VP2多克隆抗體可特異性識別天然的CVA6抗原,可用于IFA分析。

綜上所述,該實驗制備了特異性較高的CVA6-VP1和CVA6-VP2兔多克隆抗體,可以用于WB和IFA法檢定CVA6的VP1和VP2抗原,為進一步研究CVA6奠定了基礎。同時本實驗成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-CVA6-VP1和pGEX-6p-1-CVA6-VP2,獲得了重組的CVA6 VP1和VP2蛋白,還可進一步研究CVA6的免疫原性及抗原表位,亦可為研究CVA6的致病機制、檢測試劑等提供參考。

利益沖突無