，，

化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes,S.pyogenes)是一種常見的致病細菌，主要引起較嚴重的化膿性疾病，如侵襲性感染、急性風濕熱、風濕性心臟瓣膜病的后遺癥等[1]。研究發(fā)現(xiàn)它可以定植于人體血液中，并且能在其中建立自己獨特的生存機制[2-3]。

鐵離子是細菌代謝過程中所必需的元素之一，是許多蛋白或酶的輔助因子[4-5]，也是細菌致病性形成過程中較為關鍵的因素[6]。當細菌感染宿主并定植于宿主體內時，其生長必須從人體獲得鐵離子。然而，人體中的鐵離子在生理環(huán)境下是極度難溶的，加上很容易被人體內的鐵蛋白、含血紅素蛋白等多種鐵離子結合物緊密螯合，所以人體細胞內外游離存在的鐵離子非常有限[4-5]，這就導致細菌從人體獲得鐵離子的過程相當艱難。因此，為確保自身的生存，細菌演變出了多種鐵轉運系統(tǒng)以緩解鐵攝取的難題。

目前研究結果顯示ABC轉運系統(tǒng)是大多數細菌所含有的鐵攝取系統(tǒng)，在化膿鏈球菌中具有高度的保守性，它們是治療這些細菌引發(fā)的感染性疾病的疫苗候選物和藥物靶點[7-9]。在化膿性鏈球菌中，至今報導了3種攝取鐵離子的ABC系統(tǒng)，即 MtsABC、 HtsABC 和 FtsABCD，分別負責轉運鐵離子，血紅素和鐵色素[10-17]。現(xiàn)有研究大多集中在上述這3種鐵轉運系統(tǒng)，鐵轉運機制還存在很多不清楚的地方。而本文中研究的 Dps 樣過氧化物抗性蛋白(Dps-like peroxide resistance protein，Dpr)蛋白是化膿鏈球菌中已發(fā)現(xiàn)的除以上3種轉運系統(tǒng)之外的鐵結合蛋白，它屬于 DNA-binding protein from starved cells (Dps) 家族，該蛋白通過參與結合并轉運細菌體內的鐵離子來調節(jié)胞內過氧化氫的濃度，以此緩解細菌體內的氧化壓力[18-19]。此外，在肺炎鏈球菌中，dpr與其下游的幾個基因共同構成了一個操縱子，當dpr基因被敲除后，肺炎鏈球菌在小鼠鼻咽細胞中的定植能力明顯減弱，并且會在更短的時間內被清除。另外，Dpr蛋白也是變形鏈球菌定植牙齒表面的一個關鍵性因子[20-21]。盡管，Dpr 蛋白對化膿鏈球菌等細菌的生存和毒性起著至關重要的作用，但其作用的分子機制目前仍不清楚。

本研究基于前期成功構建的重組載體 PGEX-4T-1/GST-dpr(BL21)，對Dpr蛋白進行表達純化，并采用GST-Pull down和質譜聯(lián)用的方法篩選與Dpr相互作用的蛋白。同時，采用生物信息學手段分析鑒定的相互作用蛋白間的網絡通路關系，以探究 Dpr 蛋白在化膿鏈球菌中發(fā)揮作用的新機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株及質粒 本實驗所采用的菌株S.pyogenesM5005，重組表達載體 PGEX-4T-1/GST-dpr (BL21) 為本實驗室前期構建保藏。

1.1.2主要試劑 Glutathione Sepharose 4B親和層析填料，胰蛋白胨(Tryptone)、酵母膏(Yeast extract)、Todd-Hewitt Broth(肉湯)，瓊脂粉(Agar)，過硫酸銨，TEMED，NH4HCO3，Na2S2O3，DTT(二硫蘇糖醇)，IAA(碘乙酰胺)，TFA(三氟乙酸)，CAN(乙腈)，蛋白酶抑制劑 PMSF 和氨芐青霉素，親和層析柱，超濾濃縮管，一次性過濾膜器，胰蛋白酶等。

1.2 方法

1.2.1化膿鏈球菌全蛋白的提取 將化膿鏈球菌M5005菌種按1%的量接種到含有5%的Todd-Hewitt 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床活化過夜。次日，取活化的菌株以1∶100 的體積比接種到新鮮的培養(yǎng)基中。相同條件培養(yǎng)細菌至OD600值為 0.8 左右時， 4 ℃，8 000 r/min 離心 10 min 收集菌體，用預冷的 1×PBS 重懸菌體，同樣的條件洗滌菌體沉淀，重復3次。所得的菌體加入 500 μL 裂解液(30 mmol/L Tris，2 mol/L thiourea，4% CHAPS，pH 8.0)混勻后置于液氮和 37 ℃條件下反復凍融3次，再使用細胞超聲破碎儀以 5 s 開，5 s 關的模式超聲破碎 5 min 充分裂解菌體，隨后加入 1% 的核酶以除去溶液中的核酸混合物，冰上靜置 30 min 后于 4 ℃，13 200 r/min 離心 30 min，取上清[22]。用 BCA 法測定其中的蛋白濃度后，置于 -80 ℃保存以備后續(xù)實驗使用[23]。

1.2.2GST-Pull Down[24]

1.2.2.1融合蛋白 GST-Dpr 及 GST 蛋白的獲取 根據實驗室前期構建的重組表達載體 PGEX-4T-1/GST-dpr(BL21) 以及確定的實驗條件獲得高純度的 GST-Dpr 融合蛋白[25]。同時，基于表達載體PGEX-4T-1/GST (BL21)，表達純化獲得GST蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度后[23]，將等量的GST-Dpr融合蛋白及GST蛋白分別與一定量的Glutathione Sepharose 4B親和層析填料孵育1 h，置于4 ℃保存。

1.2.2.2篩選Dpr的相互作用蛋白[26]按照1∶5的蛋白量比例將結合有GST及GST-Dpr融合蛋白的填料分別與細菌全蛋白進行孵育，其中，GST與細菌全蛋白組作為對照，所有的樣品置于旋轉儀上4 ℃孵育過夜。次日，于4 ℃，2 500 r/min，離心5 min后輕輕吸去上清，用預冷的1×PBS相同條件輕柔清洗沉淀4次，小心棄上清后每個樣品中加入50 μL 1×SDS樣品緩沖液，水浴煮沸10 min后進行SDS-PAGE凝膠電泳，之后對完成凝膠電泳后的膠塊進行銀染顯色[27]。顯色后的電泳膠塊使用Image Scanner掃描儀進行掃描，掃描參數設置為600 dpi，灰階，8位通道，掃描結果存儲為TIF格式。

1.2.2.3用于質譜鑒定的蛋白質樣品制備 對照3次獨立重復的 GST-Pull down 實驗結果，確定共同的差異條帶并標記，之后將其切成 1 cm左右的小塊置于編號相同的 1.5 mL 的 EP 管中進行膠內酶解[27]，即在經脫色去除膠塊中的銀離子后，對其中的蛋白質進行還原和烷基化，隨后加入適當的胰蛋白酶完成酶解的過程。最后，將濃縮凍干的樣品置于-80 ℃保存用于后續(xù)的質譜鑒定。

1.2.2.4LTQ 質譜鑒定 使用 75 μL A 液將干燥后的肽段進行溶解，之后使用 C18Trap 柱對其進行脫鹽，此外，還需用 C18(Michrom, Bioresources, Auburn, CA) 對肽段進行質譜前的進一步除鹽處理，處理后的溶液再次凍干后用 10 μL A 液溶解，上樣，用質譜 LTQ-Orbitrap 檢測。其中，A 液含 2% 的乙腈，0.1% 的甲酸，其余為超純水。質譜檢測完成后，用 SEQUEST 軟件在美國國立生物技術信息中心(NCBI)中檢索S.pyogenes化膿鏈球菌 M5005 數據庫，用于蛋白的搜庫鑒定，搜庫參數按照文獻[28]設置。

1.2.3質譜鑒定蛋白間的相互作用分析 使用 STRING 網站(http://string.embl.de/)進行在線預測并生成質譜鑒定的相互作用蛋白間的相互作用網絡圖。STRING 是目前比較常用的蛋白質相互作用分析軟件之一，能夠提供較為可信的分析結果。分析時所設置的參數如下：物種：化膿鏈球菌；可信度：0.40。在數據庫輸入欄中輸入質譜鑒定到的蛋白名稱，選擇化膿鏈球菌數據庫，自動生成蛋白質相互作用網絡圖[29]。

1.2.4Dpr 相互作用蛋白的功能分類 對于質譜鑒定到的相互作用蛋白我們使用 Gene Ontology (GO) 軟件和 Uniprot http://www.uniprot.org/[30]對其進行功能注釋，同時，采用 David 和 KEGG 軟件在線分析這些蛋白所參與的作用通路，分析過程中的數據庫均設定為化膿鏈球菌。

2 結 果

2.1獲得高純度的 GST-Dpr 融合蛋白 將保藏于-80 ℃的 PGEX-4T-1/GST-dpr (BL-21) 菌株按實驗室前期研究確定的實驗條件進行表達純化，獲得大量的 GST-Dpr 融合蛋白[25]。經 SDS-PAGE 凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)本次試驗得到的蛋白純度較高(圖 1)，可用于后序的 GST-Pull down 實驗。

1: 250 (kD) marker; 2: GST-Dpr fusion protein圖1 GST-Dpr 融合蛋白的電泳圖Fig.1 GST-Dpr analysis on SDS-PAGE gel

2.2金屬蛋白 Dpr 的 GST-Pull down 為了探究與金屬蛋白 Dpr 相互作用的蛋白，實驗中用 SDS-PAGE 凝膠電泳檢測經GST-Pull down 方法篩選后的作用結果(圖 2)顯示：與融合蛋白存在相互作用的蛋白量明顯多于對照組。用質譜鑒定凝膠塊中被酶解后的差異條帶，發(fā)現(xiàn)3 次生物學實驗中 26 個蛋白被重復鑒定到(表 1)。其中包括三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、乙酰輔酶 A 羧基轉移酶(AccD)、烯醇酶(Eno)等多種酶類，轉錄以及延長因子等，表明本實驗數據可信度較高。

1: Marker; 2: GST; 3: GST + whole protein; 4: fusion protein; 5: fusion protein + whole protein圖2 Dpr蛋白的GST-Pull down結果Fig.2 GST-Pull down of Dpr

2.3 利用生物信息學手段分析相互作用蛋白

2.3.1質譜鑒定蛋白的相互作用網絡 為了研究質譜鑒定的這些蛋白間的相互作用，用 String 在線分析得到他們與 Dpr 之間對應的相互作用關系網絡(圖 3)。網絡圖的結果顯示這些蛋白之間存在較

表1 質譜鑒定到的 GST-Pull down中的蛋白
Tab.1 Proteins in GST-Pull down identified with MS

序號蛋白編錄號1蛋白名2基因名蛋白理論分子量蛋白理論等電點蛋白得分值1Q99XR7假定烷基氫過氧化物酶ahpC18876．135．192262Q99ZD6假定氨基酸ABC轉運系統(tǒng)(ATP結合蛋白)SPy＿127521210．289．57423Q9A108雙組分反應調節(jié)因子vicR23950．365．62414P0C0G7三磷酸甘油醛脫氫酶gap34098．825．191695P69949烯醇酶eno44145．806．36446Q99ZX7假定羥基丁酮脫氫酶β鏈acoB33692．887．66437Q9A1H9小核糖體亞基GTP酶rsgA29430．534．85438P6890130S核糖體蛋白rpsB25878．575．192689P69946延長因子Gfus70227．349．574410Q99YW3異亮氨酸轉運RNA連接酶ileS94685．135．623711P0C0F3DNA聚合酶III的α亞基dnaE105138．044．6919212Q99YE0乙酰輔酶A羧基轉移酶accD29227．565．1917713Q9A1E3甲硫氨酸導入ATP結合蛋白metN35925．545．265414Q9A1Y4潛在的流產性感染噬菌體抗性蛋白abiR55512．075．0921715Q99YM3假定轉錄調控因子SPy＿163430242．414．837816Q9A1F2潛在的煙酸單核苷酸腺苷轉移酶nadD21311．765．624317Q99ZF2未知蛋白SPy＿125420093．955．1124418Q9A1M5調節(jié)蛋白vlg10046．975．1914819Q9A0H4ATP依賴性解旋酶/脫氧核糖核酸酶B亞基rexB108690．004．868520Q99Y41假定谷氨酰胺合成酶glnA45465．106．53821Q9A0L8假定轉錄調控因子SPy＿071524356．305．443822Q99ZG7假定賴氨酰氨肽酶NpepN85754．489．819623Q9A146鏈球菌肌球交叉反應抗原SPy＿047059875．915．1918624Q99Y65假定丙酮酸甲酸裂解酶pfl78650．564．658825P69952延長因子Tutuf40390．879．354626Q99YU7Dps樣過氧化物抗性蛋白dpr19334．805．19327

1，2來源于化膿鏈球菌數據庫

為緊密的相互作用，在與 Dpr 有相互作用的蛋白中，AccD 蛋白處于網路節(jié)點。而 AccD 蛋白屬于金屬結合蛋白，能夠起到金屬轉運的作用。此外，GAPDH 作為三羧酸循環(huán)中的關鍵酶參與生物體中各種相關代謝，并且具有血紅素結合能力[31]；假定氨基酸ABC轉運系統(tǒng)(ATP結合蛋白)SPy_1275則是 ABC 轉運系統(tǒng)中的蛋白，這些蛋白都具有相應的轉運鐵功能，也都出現(xiàn)在這一相互作用網絡中。

圖3 質譜鑒定的差異蛋白間相互作用網絡圖Fig.3 Protein-protein interaction network of the differential proteins identified with MS

2.3.2Dpr 相互作用蛋白的功能分析 為進一步探究這些相互作用蛋白的功能，用 Gene Ontology (GO) 注釋分析與 Dpr 蛋白存在直接或間接相互作用關系的蛋白，發(fā)現(xiàn)相互作用網中的這些蛋白大部分都具有結合離子、核酸、有機環(huán)化合物等配體的功能。此外，部分蛋白具有水解酶和 GTP 酶催化活性以及促進翻譯延長作用(圖 4)。這與 Dpr 蛋白已知的金屬結合以及能夠引起 DNA 損傷等特性一致，進一步說明本實驗數據的可靠性，也揭示Dpr蛋白可能也存在與其相互作用蛋白類似的功能。

圖4 Dpr 相互作用蛋白功能分析Fig.4 Functional classification of the proteins interacting with Dpr

2.3.3Dpr 相互作用蛋白通路分析 為了進一步分析這些相互作用蛋白參與的具體通路，經生物信息學軟件 David和 KEGG 分析發(fā)現(xiàn)這些相互作用蛋白主要集中在一些代謝通路，且主要參與碳代謝、丙酮酸代謝、糖代謝以及糖異生等生物途徑，暗示 Dpr 蛋白可能通過相互作用影響這些代謝通路，從而發(fā)揮其作用機制(圖 5)。

圖5 Dpr相互作用蛋白通路分析Fig.5 Metabolic pathways of proteins interacting with Dpr

3 討 論

鐵元素參與生物體中細胞的生物合成、代謝、翻譯等眾多生物途徑[32]，對各生物體的生存起著至關重要的作用。宿主應對化膿鏈球菌乃至其他細菌病原體的入侵時，應對的策略之一就是限制細菌的金屬鐵離子的攝入，減少細菌攝取生存環(huán)境中游離的鐵離子，鐵色素和血紅素鐵的量。而與此同時，致病菌為滿足自身的生存，也衍生出對抗宿主限制的措施，其中主要是通過快速和穩(wěn)定的金屬轉運系統(tǒng)，而蛋白 Dpr 也是化膿鏈球菌鐵轉運蛋白中的一種，它對細菌的生存及毒力具有重要作用。

Dpr 蛋白在細菌體內是如何發(fā)揮功能，與哪些蛋白相互作用，目前尚不清楚。本文通過 Pull down 與質譜連用的方法篩選可能與 Dpr 相互作用的蛋白，并通過生物信息學手段建立了相互作用網絡。網絡中的節(jié)點蛋白 AccD 是參與脂肪酸合成過程中的第一步關鍵酶的組成部分，在大腸桿菌中，羧基轉移酶通過結合編碼其亞基的 mRNA 來調節(jié)其自身的翻譯，這其中發(fā)揮結合作用的便是 AccD 中的鋅指結構，而且它也可以結合ATP，金屬和核苷酸[33]。此外，有研究在探究化膿鏈球菌中潛在的血紅素結合蛋白的過程中通過血紅素親和層析的方法同時鑒定到了 AccD 蛋白和 Dpr 蛋白[34]。說明 Dpr 蛋白可能通過與 AccD 蛋白結合而影響細菌的脂肪酸代謝。在上述研究中一同被鑒定到的血紅素結合相關蛋白 Eno，RpsB 和 Fus 等在本實驗中也同樣被鑒定到，表明本次研究中質譜鑒定的蛋白確實與血紅素存在直接或者間接的關系。

蛋白 Eno 是烯醇酶，糖酵解過程中的一個關鍵酶，起催化2-磷酸-甘油酸失水而生成磷酸烯醇丙酮酸的作用。有研究發(fā)現(xiàn)該酶具有晶狀體蛋白，熱激蛋白和原癌基因調控蛋白等多重功能，也可以參與多種病原生物對寄主組織的入侵和轉移過程。該蛋白也可以通過控制整合素的表達調控胰腺癌的粘附，侵襲和轉移[35]。而另一個糖酵解的關鍵蛋白——三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)， 在本實驗中也被鑒定到。GAPDH 作為生物體內各種代謝和生物合成的關鍵性酶，能夠參與糖酵解和糖異生，具有多種綁定活性，可以結合纖連蛋白，溶菌酶及細胞骨架蛋白等。它也作為致病菌和病毒中的一種重要的毒力因子幫助病原體在宿主體內進行定植[36-37]。而且，已有相關研究報道該蛋白作為血紅素結合蛋白，參與鐵離子的轉運過程[31]。Eno 和 GAPDH 蛋白能夠出現(xiàn)在 Dpr 蛋白的相互作用網絡中，表明 Dpr 蛋白可能通過與這兩個蛋白相互作用影響糖代謝通路，進而影響細菌的毒力。

蛋白 RpsB 屬于 Rps 家族，是一種核糖體蛋白，可以作為翻譯延長因子潛在的操縱子[38]。而Fus 蛋白為核糖體延長因子可以促進細菌蛋白合成中的遷移過程，該蛋白本身極易被氧化，而當其被氧化后，會伴隨細胞中 GTP 酶活性增強和核糖體與延長因子的分離，與此同時，細胞中長肽段的量明顯多于短的肽段[39-40]。此外，另一個延伸因子 Tuf 蛋白在 Dpr 的相互作用網絡中也被鑒定到。介于上述3個與翻譯相關的蛋白在本研究中同時作為 Dpr 相互作用蛋白被篩選到，因此，我們推測 Dpr 蛋白可能與細菌的翻譯過程相關。

另外，Ahpc 蛋白是組成烷基氫過氧化物還原酶的亞基，能夠緩解過氧化物對細菌的毒害作用，幫助細菌免受 ROS 的毒害，而且 Ahpc蛋白也有助于腸菌素的高效合成[41-42]，說明 Dpr 可能與 Ahpc 相互作用發(fā)揮抗氧化的功能，這與 Dpr 蛋白已被報道具有緩解細菌體內氧化壓力的功能相符，進一步表明本研究數據的可靠性。

4 結 論

本研究在前期構建的 PGEX-4T-1/GST-dpr(BL-21) 重組表達載體的基礎上，表達并純化得到高純度的 GST-Dpr 融合蛋白，利用 GST-Pull down 實驗篩選可能與 Dpr 結合的蛋白，經質譜鑒定后總共得到 26 個蛋白，利用生物信息學手段分析發(fā)現(xiàn)，這 26 個蛋白中有 15 個蛋白與化膿鏈球菌金屬結合蛋白 Dpr 存在直接或間接的相互作用關系。其中大部分相互作用蛋白都有結合金屬離子的功能，這與 Dpr 蛋白結合并轉運金屬鐵離子的特點存在類似性。綜合以上研究，Dpr 蛋白可能通過與這些蛋白相互作用參與細菌的代謝通路，翻譯過程以及氧化應激，進而影響到細菌的定植和毒力等。

(感謝何慶瑜教授為該研究提供高水平的質譜平臺，感謝對本文中質譜實驗給予相應技術指導的銀興峰老師。)

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