，， ，，， ，

抗生素的廣泛應(yīng)用對控制人和動物疫病發(fā)揮巨大作用，有力推動了醫(yī)學(xué)的發(fā)展，但近二十年來，隨著抗生素的大量使用，特別是無指征的濫用、過度治療以及頻繁更換使用，造成各種病原的耐藥率和耐藥程度越來越高，多重耐藥問題日益嚴(yán)重且不容忽視[1-4]。細(xì)菌耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，是當(dāng)今病原細(xì)菌學(xué)的一個(gè)重要內(nèi)容，也是指導(dǎo)藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、新藥研發(fā)及正確、合理使用抗生素的重要依據(jù)。

致病性大腸桿菌是臨床感染中最為常見的病原之一，能造成人和多種動物感染，其發(fā)病率一直位于細(xì)菌性疾病的首位[5]。作為人獸最為重要的病原之一，大腸桿菌的多重耐藥情況十分普遍，但不容忽視[6]。目前針對大腸桿菌多重耐藥的研究已經(jīng)取得一些進(jìn)展，有資料表明細(xì)胞膜通透性的改變與主動外輸系統(tǒng)的超量表達(dá)在大腸桿菌耐藥過程中發(fā)揮重要作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌外膜中存在的多種膜孔蛋白如OmpF[8]和OmpC[9]與多重耐藥密切相關(guān)。盡管研究人員在病原菌耐藥機(jī)制方面做了大量研究，但我們所發(fā)現(xiàn)的僅是冰山一角。

研究以大腸桿菌膜表面的大腸菌素受體蛋白CirA為研究對象，用Red同源重組方法構(gòu)建大腸桿菌cirA基因缺失株，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為探索大腸桿菌多重耐藥機(jī)制尋找合適疫苗靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 禽致病性大腸桿菌分離株CE129(O1∶K89)、pKD3、pKD46、pCP20以及pBR322質(zhì)粒由揚(yáng)州大學(xué)朱國強(qiáng)教授惠贈；鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)單曉楓教授惠贈。LATaqDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶及T4連接酶均購自TaKaRa(大連)； L-阿拉伯糖購自Sigma 公司；His標(biāo)簽單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、胎牛血清及DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibico公司。

1.2引物設(shè)計(jì) 引物P1、P2分別由前后兩部分組成，5′端加下劃線的部分與待敲除基因序列同源，3′端未加下劃線部分與質(zhì)粒 pKD3氯霉素抗性基因cat兩側(cè)序列互補(bǔ)，P3、P4為質(zhì)粒pKD46鑒定引物，P5、P6引物位于cirA基因開放閱讀框外側(cè)，用于缺失株的鑒定；P7、P8引物用于擴(kuò)增cirA基因完整開放閱讀框，構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒。所有引物序列由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 文章中涉及引物
Tab.1 Primers involved in this study

引物引物序列(5′?3′)長度/bpP1AAGACCTGCAGCGAAAACCGGTA?CAGAATCTGAAGGATGTCCT?CAAAGAAGTGCCTGGCGTGTAG?GCTGGAGCTGCTTCG1104P2TTTGACGTCTTTAGTCACCTGCCAG?GCCGCGCCGGTATTCCAGATGG?TATAACCGCCCGATGAATATCCTC?CTTAGP3ATGTTTAGGTTGAACCCTTTCGTAC2089/1596?/492??P4AGAAGCGATAATCCACTGCCATP5GGAATTCATGTTTAGGTTGAAC?CCTTTCGTAC(EcoRⅠ)1992P6CTAGCTAGCTCAGAAGCGATAATC?CACTGCC(NheⅠ)

*一次重組擴(kuò)增片段大小，**二次重組擴(kuò)增片段大小

1.3大腸桿菌cirA基因缺失株的構(gòu)建 首先利用氯化鈣方法將pKD46轉(zhuǎn)入大腸桿菌CE129中，挑取氨芐青霉素抗性菌株接種于Amp抗性LB中，30℃培養(yǎng)，添加終濃度為30 mmol/L L-阿拉伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)，待菌液OD600值達(dá)到0.4～0.6時(shí)制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)。將P1、P2擴(kuò)增純化的打靶片段電轉(zhuǎn)化到制備好的感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)化條件為電壓1.8 kV，脈沖25μF，電阻200Ω，挑取氯霉素抗性菌落進(jìn)行鑒定。陽性菌落制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，導(dǎo)入pCP20質(zhì)粒，消除抗性標(biāo)記，最終得到目的菌株CE129ΔcirA(KO)。利用特異性鑒定引物進(jìn)行PCR，對基因缺失菌株進(jìn)行鑒定。此外利用試劑盒提取基因缺失株基因組DNA，利用鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物送交北京生工生物有限公司測序進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.4回補(bǔ)菌株構(gòu)建 提取大腸桿菌CE129基因組，以其為模板，利用P7、P8引物擴(kuò)增cirA基因完整開放閱讀框，將其克隆到pBR322質(zhì)粒上。將回補(bǔ)質(zhì)粒pBR322-cirA轉(zhuǎn)化至突變菌株中，構(gòu)建回補(bǔ)菌株(RS)。

1.5生長特性檢測 分別將大腸桿菌cirA基因缺失株和野生型菌株接種液體LB中，37 ℃培養(yǎng)過夜。用液體LB調(diào)節(jié)兩種菌液至OD600值達(dá)到一致。分別吸取兩種菌液按照1∶100比例接種新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃同步培養(yǎng)；每隔 0.5 h 取樣測定其在600 nm處吸光度，重復(fù)上述試驗(yàn)3次并繪制生長速率曲線。

1.6生化特性測定 利用梅里埃自動生化鑒定系統(tǒng)對大腸桿菌cirA基因缺失株和野生型菌株進(jìn)行生化特性比較：將待檢菌株于營養(yǎng)瓊脂上劃線培養(yǎng)，刮取菌落重懸于無菌生理鹽水，調(diào)整菌液濃度到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋謩e吸取40 L菌液滴于ID32E生化鑒定卡檢測孔中，特定孔需滴加滅菌石蠟厭氧培養(yǎng)，置于濕盒37 ℃培養(yǎng)16 h；將測試卡上機(jī)進(jìn)行鑒定。

1.7耐藥性鑒定 參照NCCLS藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，利用K-B紙片法對目的菌株進(jìn)行藥物敏感性測試，質(zhì)控菌為大腸桿菌菌株ATCC25922。分別將大腸桿菌cirA基因缺失株和野生型菌株接種液體LB中，37 ℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物調(diào)整至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋瑹o菌棉簽將細(xì)菌涂布于無抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)基表面貼上藥敏紙片，培養(yǎng)24 h測定藥敏紙片的抑菌圈直徑，以檢測抗生素對該菌的抑制程度。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果為測量平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.8生物被膜的檢測 參照文獻(xiàn)[10]，將各待檢菌株接種液體LB中30℃培養(yǎng)過夜，菌液按1∶100的比例轉(zhuǎn)接生物膜誘導(dǎo)培養(yǎng)基，再加入96 孔板中，150 L/孔。置于30℃恒溫?fù)u床(80 r/min)中培養(yǎng)24 h。小心棄掉菌液，蒸餾水洗去游離細(xì)菌，2%結(jié)晶紫室溫染色15 min，蒸餾水洗滌。用95%的乙醇將溶解結(jié)晶紫，測量OD600處吸光值。試驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用prism 5.0 軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1大腸桿菌cirA基因缺失株的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增含有cirA基因同源序列的打靶片段，純化后將其導(dǎo)入含有pKD46質(zhì)粒的CE129菌株感受態(tài)細(xì)胞，使氯霉素基因Cat替換目的基因cirA。經(jīng)抗性與PCR檢測(圖1)篩選得到陽性重組子CE129::Cat，進(jìn)一步將 pCP20 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到CE129::Cat菌株中，消除引入的Cat基因，經(jīng)PCR檢測(圖1)和序列測定后得到最終的基因缺失菌株。

圖1 大腸桿菌CE129ΔcirA基因缺失株驗(yàn)證Fig.1 Identification the knockout of cirA gene in E. coli strain CE129

2.2生長速率比較 繪制CE129野生型菌株、cirA基因缺失株及回補(bǔ)菌株的生長曲線，結(jié)果顯示(圖2)三者生長趨勢基本一致，生長速率無明顯差異。

圖2 生長曲線測定Fig.2 Growth characteristics of CE129 related strains

2.3生化特性比較 利用ATB全自動生化鑒定系統(tǒng)對大腸桿菌CE129野生型菌株與cirA基因缺失株的生化反應(yīng)譜進(jìn)行測定，結(jié)果表明：二者生化反應(yīng)譜一致，均能夠利用葡萄糖、乳糖、鳥氨酸和賴氨酸。

2.4生物膜形成能力比較 將CE129野生型菌株與cirA基因缺失株分別接種到生物膜誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，對生物膜進(jìn)行結(jié)晶紫染色結(jié)果表明，cirA基因缺失后，大腸桿菌CE129生物膜形成能力明顯下降(圖3A)。進(jìn)一步通過96孔定量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)缺失株生物膜減少近60%，cirA基因回復(fù)后生物膜形成能力部分恢復(fù)(圖3B)。

圖3 大腸桿菌生物膜形成能力測定Fig.3 Biofilm formation assay of E.coli CE129 related strains

2.5大腸桿菌ΔcirA基因缺失株耐藥性分析 藥敏試驗(yàn)結(jié)果(見表 2)表明，相較于野生型菌株，大腸桿菌CE129ΔcirA基因缺失株對多種抗生素敏感增強(qiáng)，揭示cirA基因缺失對大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生影響。

表2 大腸桿菌CE129 ΔcirA基因缺失株和野生型菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果敏試驗(yàn)結(jié)果
Tab.2 Resistance to antibotics of E.coli CE129 ΔcirA mutant and wild-type strain

抗生素抑菌圈直徑/mmCE129CE129ΔcirA頭孢曲松鈉20．67±0．5821．33±0．58阿莫西林9．83±0．7619．67±0．58大觀霉素11．50±0．5016．33±0．29氧氟沙星10．67±0．5821．67±1．53氯霉素17．50±0．5025．17±1．04氟苯尼考11．67±0．5818．67±0．58阿米卡星13．67±0．5819．67±0．58慶大霉素12．33±0．5812．67±0．58

3 討 論

致病性大腸桿菌是一種重要的人獸共患病病原，也是臨床上最常見的病原之一，常在人和多種動物的引起多種類型的感染。長久以來針對大腸桿菌感染多以抗生素為主要治療手段，也取得了較好的治療效果，但近年，大腸桿菌多重耐藥菌株不斷涌現(xiàn)，出現(xiàn)了對幾種甚至幾十種抗生素均不敏感的耐藥菌株，給臨床用藥帶來極大的困難[6]。衛(wèi)生部全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(Mohnarin)及中國CHINET 2006-2011年間細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，大腸桿菌居于首位，其耐藥性問題日益引起人們關(guān)注[11]。多重耐藥大腸桿菌感染給養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展和人類身體健康帶來的公共衛(wèi)生問題，更是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)共同面臨的重要難題之一。

大腸桿菌耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，是多個(gè)基因、多重機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果。目前，在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的多重耐藥相關(guān)操縱子有marRAB[12]、soxRS[13]、crAB[14]、emrAB[15]等，其中mar操縱子研究最多，也是非常重要的耐藥調(diào)控因子。此外大腸桿菌外膜蛋白OmpF、LamB也被證實(shí)參與細(xì)菌耐藥過程[8, 16]。本研究中所涉及的CirA蛋白也是存在于大腸桿菌外膜表面的孔道蛋白，為大腸菌素的受體蛋白[17]，而關(guān)于該蛋白研究較少，僅局限于其受體功能。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)cirA與細(xì)菌耐藥相關(guān)，大腸桿菌cirA基因缺失后對多種抗生素敏感性顯著提高。大腸桿菌生物膜是細(xì)菌生長過程中分泌于胞外的成分，參與細(xì)菌應(yīng)對不利環(huán)境，有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生物膜能夠協(xié)助對抗抗生素的殺傷作用，因此本研究探索了cirA基因缺失對大腸桿菌生物膜的影響，結(jié)果表明基因缺失株的生物膜形成被明顯削弱，可能是其抗生素耐受能力降低的重要原因。本研究對大腸桿菌CE129菌株進(jìn)行基因缺失，缺失株的生長和生化特性未發(fā)生明顯改變，排除了生長和生化特性改變的干擾。

本研究利用Red同源重組方法構(gòu)建大腸桿菌cirA基因缺失株，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為探索大腸桿菌多重耐藥機(jī)制尋找合適疫苗靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1] 陳代杰.新世紀(jì)以來全球新型抗菌藥物研發(fā)及前沿研究進(jìn)展[J].中國抗生素雜志,2017,42(3):161-168.DOI:10.13461/j.cnki.cja.005843

[2] 黃勛,鄧子德,倪語星,等.多重耐藥菌醫(yī)院感染預(yù)防與控制中國專家共識[J].中國感染控制雜志,2015,14(1):1-9.

[3] 王娟,王新華,徐海.多重耐藥菌在人類、動物和環(huán)境的耐藥和傳播機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2016,56(11):1-10.DOI：10.13343/j.cnki.wsxb.20160044

[4] 侯芳,呂媛.不容忽視的細(xì)菌耐藥[J].中國抗生素雜志,2017,42(3):203-206.DOI:10.13461/j.cnki.cja.005849

[5] Terlizzi ME, Gribaudo G, Maffei ME. UropathogenicEscherichiacoli(UPEC) Infections: virulence factors, bladder responses, antibiotic, and non-antibiotic antimicrobial strategies[J]. Front Microbiol,2017,8(Article1566):1-23. DOI: 10.3389/fmicb.2017.01566

[6] 雷連成,韓文瑜,鄭丹,等.耐藥大腸桿菌的致病性與免疫原性[J].中國生物制品學(xué)雜志,2006,19(4):340-343.DOI：10.13200/j.cjb.2006.04.17.leilch.004

[7] Alibert S, N’Gompaza DJ, Hernandez J, et al. Multidrug efflux pumps and their role in antibiotic and antiseptic resistance: a pharmacodynamic perspective[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol,2017,13(3):301-309. DOI: 10.1080/17425255.2017.1251581

[8] Lim JA, Hong J, Kim J, et al. OmpF ofPectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorumPcc3 is required for carocin D sensitivity[J]. FEMS Microbiol Lett,2016,363(23):1-7. DOI:10.1093/femsle/fnw258

[9] Ghai I, Winterhalter M, Wagner R. Probing transport of charged beta-lactamase inhibitors through OmpC, a membrane channel fromE.coli[J]. Biochem Biophys Res Commun,2017,484(1):51-55. DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.01.076

[10] 姚豐華,董立偉,張鈺,等.腸炎沙門菌hcp基因?qū)ι锉荒ば纬傻挠绊懛治鯷J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014,36(7):534-537.

[11] 胡付品,朱德妹,汪復(fù),等.2011年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志,2012,12(5):321-329.DOI：10.16718/j.1009-7708.2012.05.002

[12] Zhang H, Gao L, Zhang J, et al. A novel marRAB operon contributes to the rifampicin resistance inMycobacteriumsmegmatis[J]. PLoS One,2014,9(8):1-13. DOI: 10.1371/journal.pone.0106016

[13] Lee JH, Lee KL, Yeo WS, et al. SoxRS-mediated lipopolysaccharide modification enhances resistance against multiple drugs inEscherichiacoli[J]. J Bacteriol,2009,191(13):4441-4450. DOI: 10.1128/JB.01474-08

[14] Zhang CZ, Chen PX, Yang L, et al. Coordinated expression of acrAB-tolC and eight other functional efflux pumps through activatingramAandmarAinSalmonellaentericaserovarTyphimurium[J]. Microb Drug Resist,2017,24(2):120-125.DOI: 10.1089/mdr.2017.0086

[15] Lin MF, Lin YY, Lan CY. Contribution of EmrAB efflux pumps to colistin resistance inAcinetobacterbaumannii[J]. J Microbiol,2017,55 (2):130-136. DOI: 10.1007/s12275-017-6408-5

[16] Lin XM, Yang MJ, Li H, et al. Decreased expression of LamB and Odp1 complex is crucial for antibiotic resistance inEscherichiacoli[J]. J Proteomics,2014,98(26):244-253. DOI: 10.1016/j.jprot.2013

[17] Zarate-Bonilla LJ, Del PP, Saenz-Suarez H, et al. Computational modeling and preliminary iroN, fepA, andcirA gene expression inSalmonellaEnteritidisunder iron-deficiency-induced conditions[J]. Poult Sci,2014,93(1):221-230. DOI: 10.3382/ps.2012-02993