向力，陳紹娟，江淼，袁也，鄭飛，王露，張蕾，唐俊明,4(1湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰 44000；湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院；3十堰市太和醫(yī)院；4胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

骨骼肌萎縮是一種常見的生理和病理過程，其機(jī)制非常復(fù)雜[1]。隨著年齡的增長或在病理?xiàng)l件下，骨骼肌會(huì)發(fā)生損耗和萎縮，骨骼肌干細(xì)胞則能以增殖、分化的方式來實(shí)現(xiàn)骨骼肌的自我更新和修復(fù)[2,3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，肌肉萎縮可能與交感神經(jīng)過度興奮有關(guān)[4～6]。交感舒血管神經(jīng)興奮時(shí)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)是乙酰膽堿。但乙酰膽堿是否參與了骨骼肌干細(xì)胞增殖、分化過程，從而影響骨骼肌的自我更新或修復(fù)，尚不明確。2016年6月～2017年8月，我們采用連續(xù)單次給予乙酰膽堿模擬交感神經(jīng)興奮后效應(yīng)，觀察乙酰膽堿對(duì)骨骼肌干細(xì)胞增殖、分化的影響，探討乙酰膽堿是否通過影響骨骼肌自我更新或修復(fù)而參與骨骼肌萎縮過程。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 小鼠骨骼肌干細(xì)胞C2C12細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫。乙酰膽堿購自美國Sigma公司；TRIzol總RNA提取試劑購自Invitrogen公司；DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購自Thermo公司；配對(duì)盒基因7(Pax7)、生肌調(diào)節(jié)因子(MyoD)、肌細(xì)胞生成蛋白(MyoG)、生肌調(diào)節(jié)因子(MYf5)、GAPDH引物均由南京金斯瑞公司合成；肌球蛋白重鏈(MYH)(H-300)兔多克隆抗體，MyoG小鼠多克隆抗體，毒蕈堿樣乙酰膽堿受體亞型M1、M2、M3山羊多克隆抗體，M4、M5兔多克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗羊二抗，HRP標(biāo)記的抗小鼠二抗均購自Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的抗兔二抗，一抗、二抗稀釋液、封閉液均購自碧云天生物技術(shù)研究所；聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus發(fā)光試劑均購自Millipore公司。

1.2 C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化 將凍存的C2C12細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇，接種于75 cm2的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件為10%胎牛血清+高糖DMEM培養(yǎng)基即為增殖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖融合達(dá)80%～90%時(shí)，按照1∶3的比例傳代。傳代的C2C12細(xì)胞按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)，換用含有2%馬血清(HS)的DMEM分化培養(yǎng)基(DM)進(jìn)行成肌誘導(dǎo)分化，當(dāng)細(xì)胞分化5 d后，在光學(xué)顯微鏡下觀察見已經(jīng)形成典型的肌管，采用免疫熒光法檢測(cè)成肌細(xì)胞分化標(biāo)志物MYH、MyoG的表達(dá)均呈強(qiáng)陽性，表明成肌細(xì)胞培養(yǎng)成功。

1.3 C2C12細(xì)胞毒蕈堿樣乙酰膽堿受體亞型表達(dá)檢測(cè) ①實(shí)時(shí)定量PCR法。收集C2C12細(xì)胞，按TRIzol法分別提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，行分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR?PremixExⅡ法行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)毒蕈堿樣乙酰膽堿受體M1～M5亞型表達(dá)。引物序列：M1受體上游5′-CCTGAG-CTACCGAGCCAAG，下游 5′-CCCAACTAGGTATTGCCAGAAG-3′；M2受體上游5′-GGGACCTGTAGTGTGCGAC-3′，下游5′-GGGTAGGTTAGAGGTTTTGT-GAC-3′；M3受體上游5′-CCTCGCCTTTGTTTCCCAA-C，下游5′-TTGAGGAGAAATTCCCAGAGGT-3′；M4受體上游5′-ATGGCGAACTTCACACCTGTC-3′，下游 5′-CTGTCGCAATGAACACCATCT-3′；M5受體上游5′-TCAACGGCACCCCAGTAAATC-3′，下游5′-GGATGTAGGTCGTGTAGAGGTTC-3′；GAPDH上游5′-ATGACTCCACTCACGGCAAA-3′，下游5′-ATGATGACCCTTTTGGCTCC-3′。以GADPH為內(nèi)參，使用公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的差異倍數(shù)。②Western blotting法。取C2C12細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解、離心收蛋白，行BCA法進(jìn)行蛋白定量。按分組各上樣50 μg 蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)PVDF膜。用TBST配制的5%的脫脂奶粉低速搖床封閉40 min，分別放入含有α-Tubulin 、M1～M5受體等不同一抗的封閉袋中，4 ℃過夜，將條帶放入含有辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)孵育液中2 h。最后用化學(xué)發(fā)光法顯色，在BioRad蛋白成像儀成像，用Image J軟件測(cè)灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.4 乙酰膽堿對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響觀察

1.4.1 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 C2C12細(xì)胞傳代后，在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至50%融合時(shí)，分為對(duì)照組、乙酰膽堿1組、乙酰膽堿2組、乙酰膽堿3組、乙酰膽堿4組，分別加入乙酰膽堿0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，每隔1日換液1次，培養(yǎng)72 h。

1.4.2 細(xì)胞增殖情況檢測(cè) 采用CCK8法。取各組細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK8，孵育2 h。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm光密度值(OD值)，評(píng)價(jià)C2C12細(xì)胞增殖情況。

1.4.3 細(xì)胞增殖標(biāo)志基因Pax7表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法，進(jìn)一步驗(yàn)證乙酰膽堿是否影響C2C12細(xì)胞增殖。收集各組細(xì)胞，按TRIzol法提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，行分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR?PremixExⅡ法行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。引物序列：Pax7上游引物5′-TCTCCAAGATTCTG-TGCCGAT-3′，下游5′-CGGGGTTCTCTCTCTTATACT-CC-3′；GAPDH上游5′-ATGACTCCACTCACGGCAA-A-3′，下游5′-ATGATGACCCTTTTGGCTCC-3′。以GADPH為內(nèi)參，使用公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的差異倍數(shù)。

1.5 乙酰膽堿對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響觀察

1.5.1 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 取用2%HS誘導(dǎo)分化1 d后的C2C12細(xì)胞，分為對(duì)照2組、乙酰膽堿5組、乙酰膽堿6組、乙酰膽堿7組、乙酰膽堿8組，分別加入乙酰膽堿0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，每隔1日換液1次，培養(yǎng)5 d。

1.5.2 細(xì)胞分化情況檢測(cè) 采用光學(xué)顯微鏡觀察法。取各組細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肌管的形成情況。

1.5.3 細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。取各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，行分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR?PremixExⅡ法行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。引物序列：MyoD上游5′-CCACTCCGGGACATAGACTTG-3′，下游5′-AAAAGCGCAGGTCTGGTGAG-3′；MyoG上游5′-GAGACATCCCCCTATTTCTACCA-3′，下游5′-GCTCAGTCCGCTCATAGCC-3′；Myf5上游5′-GCCTTCGGAGCACACAAAG-3′，下游5′-TGACCTTC-TTCAGGCGTCTAC-3′；GAPDH上游5′-ATGACTCCA-CTCACGGCAAA-3′，下游5′-ATGATGACCCTTTTGGCTCC-3′。以小鼠GADPH為內(nèi)參，使用公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的差異倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 乙酰膽堿M1～M5受體表達(dá)比較 M2受體mRNA及蛋白表達(dá)均為最高，M3受體mRNA及蛋白表達(dá)均為最低(P均<0.05)。見表1。

表1 C2C12細(xì)胞乙酰膽堿M1～M5受體表達(dá)比較

注：與其他受體 mRNA表達(dá)比較，*P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞增殖情況比較 與對(duì)照組比較，乙酰膽堿1～4組各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

2.3 各組細(xì)胞增殖標(biāo)志基因Pax7表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，乙酰膽堿1～4組Pax7 mRNA 表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖及Pax7 mRNA 表達(dá)比較

2.4 各組細(xì)胞分化情況 光鏡下發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照2組相比，乙酰膽堿5組C2C12細(xì)胞分化明顯，且肌管數(shù)目略有增多；乙酰膽堿6～8組C2C12細(xì)胞分化呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，成熟肌管數(shù)目減少、分化被抑制，以乙酰膽堿8組分化為成熟肌管數(shù)目減少最明顯。

2.5 各組細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)比較 乙酰膽堿5、6組MyoG mRNA表達(dá)均高于對(duì)照2組(P均<0.05)。乙酰膽堿7、8組MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照2組，且乙酰膽堿8組MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表達(dá)均低于乙酰膽堿7組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照2組比較，*P<0.05；與其他乙酰膽堿組比較，#P<0.05。

3 討論

骨骼肌由具有收縮能力的肌細(xì)胞組成，約占全身重量的40%，身體的幾乎任何活動(dòng)都是依靠骨骼肌的收縮來完成，骨骼肌的狀況直接影響人體的力量和耐力。既往研究認(rèn)為，肌肉的萎縮與失神經(jīng)、營養(yǎng)不良、廢用以及惡病質(zhì)有關(guān)[7]。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，心力衰竭、糖尿病患者常伴有交感神經(jīng)過度興奮的特征，與此同時(shí)伴有骨骼肌萎縮的癥狀。而骨骼肌的萎縮又進(jìn)一步惡化心力衰竭患者的運(yùn)動(dòng)康復(fù)、糖尿病患者骨骼肌對(duì)胰島素的抵抗[8,9]。研究顯示，心力衰竭時(shí)交感神經(jīng)過度興奮將引起骨骼肌的萎縮[9,10]。上述變化均顯示一個(gè)共同的特征，即交感神經(jīng)過度興奮與骨骼肌萎縮有關(guān)。但實(shí)際上，骨骼肌本身除了受運(yùn)動(dòng)神經(jīng)支配外，骨骼肌血管還受交感舒血管神經(jīng)支配，其共性是末梢釋放的均是乙酰膽堿，但乙酰膽堿在骨骼肌自我更新及損傷修復(fù)中的作用及其導(dǎo)致骨骼肌萎縮的機(jī)制至今不明。

既往研究更多的乙酰膽堿M1～M5受體在心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中的作用，而乙酰膽堿M受體在干細(xì)胞中的作用僅見零星報(bào)道，如發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿M3受體具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖的作用[11,12]，而M2受體具有抑制干細(xì)胞增殖而促進(jìn)干細(xì)胞分化的作用[13,14]。既往研究顯示，增加的cGMP或降低的cAMP有利于干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，C2C12細(xì)胞M2受體mRNA及蛋白表達(dá)均為最高，乙酰膽堿5組C2C12細(xì)胞分化明顯、有肌管形成，提示較低劑量的乙酰膽堿可促進(jìn)骨骼肌干細(xì)胞的分化；C2C12細(xì)胞M3受體mRNA及蛋白表達(dá)均為最低，且與對(duì)照組比較，乙酰膽堿1～4組各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖及Pax7 mRNA 表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示乙酰膽堿對(duì)C2C12細(xì)胞增殖活性沒有明顯影響，表明乙酰膽堿沒有影響C2C12細(xì)胞的增殖活性,可能與M3受體表達(dá)水平較低有關(guān)。以上結(jié)果表明，乙酰膽堿對(duì)C2C12細(xì)胞的增殖及分化的影響與其M2受體、M3受體有關(guān)。

胚胎期特異性的骨骼肌分化主要通過特異性骨骼肌轉(zhuǎn)錄因子決定的。其中，MyoD基因家族控制著肌細(xì)胞的增殖和分化，與肌纖維的數(shù)量、大小有著密切的關(guān)系[14]。MyoD基因家族可編碼多種不同的轉(zhuǎn)錄因子如MyoD、MyoG、Myf5、MRF4等，它們各自或協(xié)同控制著骨骼肌生成方面的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。而出生后，肌肉的使用程度與特異性的神經(jīng)支配決定了肌肉收縮性蛋白的組成和更新程度[14,15]。MyoD不僅可使靜止期的肌衛(wèi)星細(xì)胞向成肌細(xì)胞，而且能把多種類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，并促使成肌細(xì)胞融合、分化為成熟的肌纖維。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，交感神經(jīng)長期過度興奮時(shí)，表現(xiàn)出抑制骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化形成肌小管的能力[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿5、6組MyoG mRNA表達(dá)均高于對(duì)照2組，提示低濃度的乙酰膽堿更可能主要通過影響MyoG的表達(dá)而促進(jìn)成肌細(xì)胞向肌小管分化形成，這與本研究觀察到的乙酰膽堿5組細(xì)胞分化明顯、肌管數(shù)目略有增多相吻合。

但在交感舒血管神經(jīng)興奮時(shí)，乙酰膽堿大量釋放所導(dǎo)致的乙酰膽堿濃度升高狀態(tài)對(duì)于骨骼肌干細(xì)胞的影響，是否與低濃度乙酰膽堿促進(jìn)分化的作用效果相同尚不明確。Myf5或MyoD均敲除的小鼠既不能生成骨骼肌，也無成肌細(xì)胞群[15]。而MyoG敲除的胚胎鼠具有幾乎正常數(shù)目的衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞，但不能向肌細(xì)胞分化;提示MyoG位于MyoD或Myf5的下游，在成肌細(xì)胞向肌小管分化形成的過程中具有獨(dú)特的功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，MyoD可結(jié)合MyoG等基因啟動(dòng)區(qū)發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄激活[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿7、8組MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照2組，且乙酰膽堿8組MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表達(dá)均低于乙酰膽堿7組，結(jié)合乙酰膽堿6～8組C2C12細(xì)胞分化呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)、以乙酰膽堿8組分化為成熟肌管數(shù)目減少最明顯的結(jié)果，考慮高濃度的乙酰膽堿具有強(qiáng)烈的抑制C2C12細(xì)胞分化的作用;表明乙酰膽堿大量釋放時(shí)可明顯抑制C2C12細(xì)胞的分化，可能與抑制細(xì)胞分化相關(guān)基因MyoG、MyoD、Myf5的表達(dá)有關(guān)?？梢?，交感舒血管神經(jīng)異常過度興奮時(shí)，其過多釋放的乙酰膽堿可抑制骨骼肌干細(xì)胞分化，而引起骨骼肌損傷或更新不足，可能是導(dǎo)致骨骼肌萎縮的機(jī)制之一。

綜上所述，高濃度乙酰膽堿可抑制C2C12細(xì)胞分化及其肌管形成，其機(jī)制可能與抑制分化相關(guān)基因MyoG、MyoD、Myf5的表達(dá)有關(guān)，可能是交感舒血管神經(jīng)興奮釋放大量乙酰膽堿后導(dǎo)致骨骼肌萎縮的內(nèi)在機(jī)制之一。

：

[1] Adams CM, Ebert SM, Dyle MC. Role of ATF4 in skeletal muscle atrophy[J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2017, 20(3):164-168.

[2] Powers SK, Lynch GS, Murphy KT, et al. Disease-induced skeletal muscle atrophy and fatigue[J]. Med Sci Sports Exerc, 2016,48(11):2307-2319.

[3] Tieland M, Trouwborst I, Clark BC. Skeletal muscle performance and ageing[J]. J Cachexia Sarcopenia Muscle, 2018,9(1):3-19.

[4] Hyatt JP, Roy RR, Baldwin KM, et al. Nerve activity-independent regulation of skeletal muscle atrophy: role of MyoD and myogenin in satellite cells and myonuclei[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2003,285(5):1161-1173.

[5] Aagaard P, Suetta C, Caserotti P, et al. Role of the nervous system in sarcopenia and muscle atrophy with aging: strength training as a countermeasure[J]. Scand J Med Sci Sports, 2010, 20(1):49-64.

[6] 陳紹娟,向力,江淼,等. 異丙腎上腺素在C2C12細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2017,39(9):1178-1187.

[7] Dutt V, Gupta S, Dabur R, et al. Skeletal muscle atrophy: potential therapeutic agents and their mechanisms of action[J]. Pharmacol Res, 2015,99:86-100.

[8] Pelletier R, Hamel F, Beaulieu D, et al. Absence of a differentiation defect in muscle satellite cells from DM2 patients[J]. Neurobiol Dis, 2009,36(1):181-190.

[9 ]Brum PC, Bacurau AV, Cunha TF, et al. Skeletal myopathy in heart failure: Effects of aerobic exercise training[J]. Exp Physiol, 2014,99(4):616-20.

[10] Lymperopoulos A, Rengo G, Koch WJ. Adrenergic nervous system in heart failure: Pathophysiology and therapy[J]. Circ Res, 2013,113(6):739-753.

[11] Fukushima K, Yamazaki K, Miyamoto N, et al. Functional characterization of acetylcholine receptors expressed in human neurons differentiated from hippocampal neural stem/progenitor cells[J]. J Biomol Screen, 2016,21(10):1065-1074.

[12] Tang JM, Yuan J, Li Q, et al. Acetylcholine induces mesenchymal stem cell migration via Ca2+/PKC/ERK1/2 signal pathway[J]. J Cell Biochem, 2012,113(8):2704-2713.

[13] Resende RR, Alves AS, Britto LR, et al. Role of acetylcholine receptors in proliferation and differentiation of P19 embryonal carcinoma cells[J]. Exp Cell Res, 2008,314(7):1429-1443.

[14] 鄧玉風(fēng), 黃億元, 尚麗娜,等. 穩(wěn)定表達(dá)Caveolin-3基因突變型P104L和P47L的C2C12骨骼肌細(xì)胞株的構(gòu)建[J].山東醫(yī)藥,2016,56(31):12-15.

[15] Zanou N, GaillyP. Skeletal muscle hypertrophy and regeneration: Interplay between the myogenic regulatory factors (MRFs) and insulin-like growth factors (IGFs) pathways[J]. Cell Mol Life Sci, 2013,70(21):4117-4130.