劉晨 楊志軍 徐如祥 戴宜武 羅丹 孫移坤 王震

(1山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030000; 2北京陸軍總醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100000; 3河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境由多種基本因素構(gòu)成，對腫瘤的生存具有重要的作用。其中含氧量作用至關(guān)重要[1]。細(xì)胞微環(huán)境中含氧量變化會引起一系列細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)變化，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化、調(diào)亡及損傷修復(fù)等。由于腫瘤細(xì)胞過度增殖和高代謝，腫瘤細(xì)胞微環(huán)境處于低氧狀態(tài)[2]。

生物學(xué)功能的改變表現(xiàn)在以下方面：促進(jìn)腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、對放化療產(chǎn)生抵抗等。多種細(xì)胞因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)。

高代謝產(chǎn)生的乳酸和碳酸造成微環(huán)境的低PH值。許多研究都證實，低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor, HIF)在各種實體腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)。HIF在腦膠質(zhì)瘤的病理標(biāo)本和細(xì)胞培養(yǎng)中也存在的髙表達(dá)[3]。與之類似，Wnt通路相關(guān)蛋白的高表達(dá)也已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)，與腫瘤增殖、侵襲等密切相關(guān)。在黑色素瘤中進(jìn)一步證實低氧環(huán)境下Wnt通路被異常激活，并促使其下游靶點基因cyclin D1/C-myc激活, 刺激癌細(xì)胞增殖。可見，Wnt通路在細(xì)胞增殖過程中起到了重要的作用。

基于如上背景，本試驗探究低氧環(huán)境對以U87細(xì)胞為代表的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響，初步驗證經(jīng)典Wnt通路是否參與到細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)中。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

膠質(zhì)瘤U87及U251系細(xì)胞以含有10%胎牛血清(fatal bovine serum, FBS)的Eagle (Dulbecco's modified Eagle medium)改良常規(guī)貼壁培養(yǎng)，添加血清替代物，含有10% B27神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑(B27 NeuroMix, B27)、20 ng/mL表皮細(xì)胞生長因子(cottony-stimulating factor, EGF)、20 ng/mL成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)及10 ng/mL白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)的DMEM/F12(Dulbecco's modified Eagle medium: Nutrient Mixture F-12)培養(yǎng)懸浮細(xì)胞球。所有細(xì)胞均置于相應(yīng)恒溫培養(yǎng)箱中備用。

二、CCK-8實驗

取對數(shù)生長期生長良好的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個/mL，即以2×103個/孔的接種于96孔板中，設(shè)置5個復(fù)孔，置于相應(yīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于第 1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天取出，棄上清液，每孔加入含10% CCK-8的新鮮培養(yǎng)液100 μL，置于相應(yīng)培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2 h。2 h后取出，以酶標(biāo)儀于檢測各孔450 nm波長處的光密度(optical density, OD)值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

三、成球?qū)嶒?/h3>

取對數(shù)生長期生長良好的細(xì)胞，傳代方法制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)后，以干細(xì)胞條件培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/mL。以5×103/mL密度細(xì)胞懸液接種200細(xì)胞/孔組(40 μL 5×103/mL細(xì)胞懸液與160 μL含血清培養(yǎng)基混合)，將上述細(xì)胞懸液再稀釋10倍，以制備5×102/mL細(xì)胞懸液，接種100細(xì)胞/孔組(200 μL 5×102/mL細(xì)胞懸液與0 μL含血清培養(yǎng)基混合)于96孔板的各排，接種50細(xì)胞/孔組(100 μL 5×102/mL細(xì)胞懸液與100 μL含血清培養(yǎng)基混合)。每3 d添加50 μL新鮮干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，2 w后顯微鏡下計數(shù)直徑大于75 μm的懸浮細(xì)胞球(表1)。

表1 有限稀釋法 96孔板細(xì)胞梯度接種表

Tab 1 Cell inoculation table

Cells/holePremix1st(μL)2nd(μL)3rd(μL)4th(μL)5th(μL)6th(μL)7th(μL)8th(μL)9th(μL)10th(μL) 2005×103/mLcellsuspension40404040404040404040 culturemedium160160160160160160160160160160 1005×102/mLcellsuspension200200200200200200200200200200 culturemedium0000000000 505×102/mLcellsuspension100100100100100100100100100100 culturemedium100100100100100100100100100100

四、單克隆實驗

取對數(shù)生長期生長良好的細(xì)胞，干細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，在稀釋細(xì)胞至5×102，即每100 μL約含50個細(xì)胞。2 μL移液槍吸取細(xì)胞懸液打點種植于96孔板。然后在倒置顯微鏡下觀察，如每孔1～2個細(xì)胞，則接種完96孔板。若細(xì)胞數(shù)過多或觀察不到細(xì)胞，則調(diào)整濃度，重新種植直至每孔中1～2個細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察96孔板，排除無細(xì)胞孔和多細(xì)胞孔，標(biāo)記單細(xì)胞孔，加培養(yǎng)液 200 μL。每3 d添加50 μL新鮮干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，2 w后顯微鏡下計數(shù)直徑大于75 μm的懸浮細(xì)胞球數(shù)目。

五、Western Blot

分別于常氧含量培養(yǎng)箱及低氧含量培養(yǎng)箱中培養(yǎng)U87細(xì)胞，48 h后終止。預(yù)冷PBS洗滌3次后，離心收集細(xì)胞，預(yù)冷細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰上放置5 min，4 ℃離心收集上清液并測定蛋白濃度。每孔20 mg等量蛋白于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(dodecyl sulfate sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素(nitrocellulose filter membrane, NC)膜，封閉雜交后于顯影儀顯影。圖像處理軟件Image J測算灰度值，繪制柱狀圖。

六、SYBR染料法定量定時反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(quantificational real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)

分別于常氧含量培養(yǎng)箱及低氧含量培養(yǎng)箱中培養(yǎng)U87細(xì)胞，48 h后終止，預(yù)冷PBS洗滌3次后，離心收集細(xì)胞，提取總mRNA含量并測定純度。用1 μg總RNA按試劑盒說明書操作生成cDNA，制備20 μL反應(yīng)體系(2 μL引物，6 μL水，2 μL cDNA，10 μL primemix)，置于7 500熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR檢測，2-ΔΔCt法計算靶基因相對表達(dá)水平。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

圖1 低氧及常氧環(huán)境下細(xì)胞的增殖活性隨培養(yǎng)時間的變化

Fig 1 The changes of proliferative activity of U87 cells when cultured under normoxia and hypoxia environment

Within a certain period of time (time≤5 d), the OD value of culture media of U87 cells that treated with CCK-8 rose steadily. When the incubation time overstepped a certain range (normoxia group>5 d, hypoxia group>5 d), the OD value declined sharply without a plateau in normoxia group, however, in hypoxia group it went into a platform (time: 5～6 d) firstly before decreased.

aP<0.05,vshypoxia group.

圖2 低氧及常氧環(huán)境下細(xì)胞成球?qū)嶒灱皢慰寺嶒灆z測細(xì)胞成球能力及單克隆形成效率檢測

Fig 2 The assessment about capability of sphere-forming with sphere formation assay and sphere formation efficiency with colony formation assay of U87 cells that cultured in normoxia and hypoxia environment

A: The number of mammospheres in different cell density (200 cells/hole, 100 cells/hole, 50 cells/hole) in hypoxia group was more than that in normoxia group; B: The sphere formation efficiency of U87 cells in hypoxia group was higher than that in normoxia group.

aP<0.05,vshypoxia group.

圖3 低氧環(huán)境對Wnt經(jīng)典通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

Fig 3 The effect of hypoxia environment on the expression of canonical Wnt/β-catenin pathway related genes The mRNA expression of β-cantenin and C-myc proto-oncogenes (C-myc) was up-regulated and the mRNA expression of GSK-3β was down-regulated.

aP<0.05,vshypoxia group.

圖4 低氧環(huán)境對Wnt經(jīng)典通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig 4 The effect of hypoxia environment on the expression of canonical Wnt/β-catenin pathway related proteins

A: With the pictures of bands, it could be observed directly that the protein expression of β-cantenin, C-myc increased and the protein expression of GSK-3β decreased; B: The gray value histogram provided more objective evidences to support the same results about that protein expression of β-cantenin and C-myc increased and the protein expression of GSK-3β decreased.

aP<0.05,vshypoxia group.

結(jié) 果

一、CCK-8細(xì)胞增殖活力實驗

膠質(zhì)瘤細(xì)胞于相應(yīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，分別于第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天測定兩組細(xì)胞450 nm波長處的OD值，并繪制增殖曲線。由增殖曲線可見：在一定時間范圍內(nèi)(培養(yǎng)時間小于5 d)細(xì)胞增殖，培養(yǎng)時間超出該范圍后(培養(yǎng)時間大于5 d)，常氧組細(xì)胞增殖活力迅速明顯下降(無平臺期)，低氧組細(xì)胞增值活力經(jīng)歷平臺期(第5～6天)后增殖活力下降。由增殖曲線可知，低氧組U87細(xì)胞的增殖活性明顯高于常氧組，且常氧組較早出現(xiàn)細(xì)胞增殖活性下降(圖1)。

二、細(xì)胞成球能力及單克隆形成能力檢測

將膠質(zhì)瘤細(xì)胞以不同梯度(200、100、50個/孔)接種于96孔板，相應(yīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 w。顯微鏡下計數(shù)96孔板各細(xì)胞梯度(200、100、50個/孔)每孔中直徑≥75 μm的細(xì)胞球數(shù)目。經(jīng)統(tǒng)計低氧組各細(xì)胞梯度計數(shù)所得細(xì)胞球數(shù)目明顯高于常氧組。將U87單細(xì)胞接種于96孔板后，每3 d添加50 μL新鮮干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，2 w后顯微鏡下計數(shù)直徑大于75 μm的懸浮細(xì)胞球，克隆形成率比=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)，經(jīng)計算統(tǒng)計低氧組細(xì)胞球形成效率明顯高于常氧組?？芍脱踅MU87細(xì)胞成球能力和單克隆形成能力高于常氧組(圖 2)。

三、PCR結(jié)果

PCR儀完成定量檢測后，2-ΔΔCt法計算靶基因相對表達(dá)水平。以常氧組mRNA表達(dá)為1，可見Wnt通路關(guān)鍵基因β-cantenin、C-myc mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，介導(dǎo)β-cantenin磷酸化的GSk3βmRNA表達(dá)下調(diào)(圖3)。

四、Western Blot結(jié)果

以圖像處理image J測算得各蛋白條帶灰度值，與內(nèi)參蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)。結(jié)果示W(wǎng)nt通路關(guān)鍵蛋白β-cateninmi，C-myc表達(dá)明顯增加，介導(dǎo)β-cantenin磷酸化的GSk3β蛋白表達(dá)表達(dá)量降低(圖4)。

討 論

在實體瘤中，低氧是一種很普遍的現(xiàn)象。腫瘤低氧微環(huán)境根據(jù)造成原因的不同，大體可以分為兩類，分別為慢性低氧，又稱為滲透限制型低氧和急性低氧，也稱為灌注限制型低氧。在實體腫瘤中，接近供氧血管的腫瘤細(xì)胞氧和營養(yǎng)物質(zhì)相對充足，細(xì)胞能迅速、正常生長；而遠(yuǎn)離血管的腫瘤組織由于迅速增殖與氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的矛盾，造成腫瘤細(xì)胞凋亡，瘤體內(nèi)形成壞死區(qū)。在腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)充足區(qū)與壞死去之間有一厚度為10～20 μm的細(xì)胞層，這一細(xì)胞層距距血管較遠(yuǎn)，氧彌散速率下降，供氧相對不足，成為慢性低氧區(qū)[4]。

在腫瘤微環(huán)境的研究中，缺氧一般指慢性缺氧。這一過程中腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)特性發(fā)生變化，有多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與，其中包括Wnt通路。Wnt蛋白家族在干細(xì)胞分化和組織胚胎學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，同時參與人及哺乳動物的生理穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[5]。Wnt信號通路大體分為兩類：一是經(jīng)典的Wnt信號通路，即Wnt蛋白與細(xì)胞表面的FZD(Frizzled, FZD)受體結(jié)合，抑制β-catenin降解，胞漿內(nèi)β-catenin累積，后轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核后與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因作用，最終促進(jìn)靶基因的表達(dá)[6]。另一種是非經(jīng)典Wnt信號通路，其又稱為非依賴β-catenin信號通路，主要以Wnt/Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為代表[7]。

經(jīng)典Wnt信號通路在生物進(jìn)化史都極為穩(wěn)定，其中β-catenin由胞質(zhì)向胞核的轉(zhuǎn)位被認(rèn)為是Wnt/β-catenin經(jīng)典通路激活的標(biāo)志。既往實驗證實，沒有被磷酸化降解的β-catenin轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，并與TCF/LEF相結(jié)合啟動下游基因。 β-catenin和Wnt-5A增高在子宮內(nèi)膜型卵巢癌中已被證實[8]。此外，β-catenin的異常積累與卵巢癌分級增加和生存率的下降呈正相關(guān)。 正常條件下內(nèi)源性的β-catenin大部分與胞膜上的E-cadherin等結(jié)合于粘連連接部位，介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附。部分β-catenin與糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)形成復(fù)合體，介導(dǎo)β-catenin磷酸化。Wnt通路激活時，GSK-3β的表達(dá)受到抑制。Wnt信號通路激活時，Wnt/卷曲蛋白FZD受體與調(diào)節(jié)因子相結(jié)合，導(dǎo)致其下游松散蛋白磷酸化，募集Axin蛋白，造成β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的降解減少，β-catenin蛋白逐漸積聚。積聚的β-catenin由胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子淋巴樣增強(qiáng)因子(the lymphoid enhancing factor, LEF)/T細(xì)胞因子(T-cell factor, TCF)家族結(jié)合，激活下游靶基因，如C-myc, cyclinD 1, matrix metalloproteinase-7等，進(jìn)一步調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲的發(fā)展。其中C-myc和cyclinD1的啟動子均有TCF的結(jié)合位點，并通過與TCF/β-catenin的復(fù)合體的結(jié)合，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期與增殖。抑制TGF表達(dá)可以下調(diào)C-myc和cyclinD 1的表達(dá)。

在非經(jīng)典的Wnt通路中則不通過β-catenin-TCF/LEF 結(jié)合體調(diào)節(jié)下游調(diào)節(jié)分子，一般認(rèn)為非經(jīng)典通路同時具有轉(zhuǎn)錄與非轉(zhuǎn)錄途徑。非經(jīng)典Wnt通路又稱Wnt/Ca2+通路以FZD Wnt配體結(jié)合，通過G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-couple receptor)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活磷脂酶C，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶II(CaMKII)上調(diào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶蛋白。

本實驗過程中，以CCK-8實驗證明低氧環(huán)境下膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)，細(xì)胞成球?qū)嶒灱皢慰寺嶒炞C明膠質(zhì)瘤細(xì)胞自我更新能力及單克隆能力較常氧組細(xì)胞增強(qiáng)，通過PCR實驗及Western實驗證實Wnt/β-catenin經(jīng)典通路標(biāo)志蛋白β-catenin表達(dá)上調(diào)，而介導(dǎo)β-catenin磷酸化并進(jìn)一步降解的Wnt通路成員GSK-3β的表達(dá)受到抑制。作為是經(jīng)典Wnt通路下游靶蛋白C-myc明顯上調(diào)。C-myc是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1期到S期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖的重要癌基因。通過本次實驗初步推斷低氧微環(huán)境可能通過激活Wnt經(jīng)典通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。

但該實驗仍存在明顯不足，需進(jìn)一步實驗中補(bǔ)充完善。首先本實驗只對Wnt通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的可能性進(jìn)行了初步探討，尚不能完全明確，其次需進(jìn)一步研究上游調(diào)節(jié)因子及下游靶蛋白改變。目前研究已證實miRNA是短小的，高度保守的非編碼RNA分子，參與多種生理調(diào)節(jié)，如增殖，分化，凋亡，發(fā)育和代謝等。在各種研究中小分子RNA既可能是腫瘤生成促進(jìn)因子，也可能是腫瘤抑制分子[9]。本課題組擬于后續(xù)科研實驗中，通過小分子RNA干擾Wnt通路抑制因子GSK3β，而后通過CCK-8實驗，腫瘤成球?qū)嶒灥闰炞C膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及自我更新能力的提高，并通過Western實驗驗證經(jīng)小分子RNA-744處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt通路標(biāo)志性蛋白β-catenin表達(dá)增加，以進(jìn)一步驗證Wnt通路參與膠質(zhì)瘤增殖。其次，在進(jìn)一步實驗中，擬使用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞，采用熒光素標(biāo)記β-catenin抗體作為探針，分別檢測低氧組及常氧組細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)本，共聚焦顯微鏡管觀察β-catenin于細(xì)胞中定位，進(jìn)一步證實經(jīng)低氧處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中上調(diào)的β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，并利用熒光定量技術(shù)計算細(xì)胞各部分β-catenin的含量，為低氧組及常氧組膠質(zhì)瘤細(xì)胞β-catenin定位、定量提供更明確依據(jù)，證實低氧微環(huán)境通過增加β-catenin表達(dá)增加并促進(jìn)其細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而調(diào)控下游蛋白，即低氧微環(huán)境通過經(jīng)典Wnt通路參與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)。

總的來講，本次實驗可以初步推斷低氧微環(huán)境可能通過激活Wnt通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。Wnt經(jīng)典通路及非經(jīng)典通路對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響仍需要進(jìn)一步實驗的論證。通過對低氧環(huán)境對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用的影響研究，可以尋找微環(huán)境相關(guān)的以及微環(huán)境調(diào)節(jié)因子特異性的新的治療手段，為膠質(zhì)瘤的治療創(chuàng)造可能。

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