康恩銘 章薇 章翔

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其患者的中位生存期僅有14個月左右[1]。DNA序列中胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(cytosine-phosphate-guanine, CpG)雙核苷酸的甲基化，可以通過影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性、改變基因穩(wěn)定性、重塑基因結(jié)構(gòu)從而對基因表達(dá)產(chǎn)生明顯的影響。目前對DNA甲基化研究最多的是啟動子內(nèi)CpG島(CpG island, CGI)甲基化。然而，只有大約70%的基因包含啟動子CGI，并且只有6.8%的CpG雙核苷酸位點在CGI中。GCI shores位于傳統(tǒng)CGI兩側(cè)2 kb范圍內(nèi)區(qū)域，其CpG密度較GCI相對較低。有研究證實，組織和腫瘤特異性的DNA差異甲基化在CGI shores區(qū)域發(fā)生更頻繁，而DNA甲基化也可以直接通過影響非CGI啟動子區(qū)域來改變腫瘤細(xì)胞的甲基化模式[2]。目前，CGI shores甲基化狀態(tài)與GBM患者預(yù)后的關(guān)系尚不明確。在本研究中，我們利用在線GBM數(shù)據(jù)庫，建立并驗證了與GBM患者臨床預(yù)后密切相關(guān)的基于7個基因(AP3B1, RGS16, PPM1M, ENPP4, GOLGB1, CACNA2D2, TMEM16)的啟動子所在GCI shores甲基化狀態(tài)的風(fēng)險評分方程，為進一步明確GBM甲基化改變模式以及探索GBM發(fā)病機制提供了有力依據(jù)。

對象與方法

一、GBM病例全基因組甲基化數(shù)據(jù)庫

GBM病例全基因組甲基化芯片數(shù)據(jù)和對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)均通過以下在線數(shù)據(jù)庫獲得：癌癥和腫瘤基因圖譜計劃數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas, TCGA)，數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址：https://cancergenome.nih.gov/?；虮磉_(dá)公共數(shù)據(jù)庫(Gene Experssion Omnibus, GEO)中的GSE36278系列和GSE60274系列，數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/。

本研究選取成人GBM病例的Illumina Human甲基化450 k芯片測量數(shù)據(jù)，排除生存資料不全以及OS<7 d的非死亡病例，最后納入TCGA病例組：136例，GSE36278病例組：37例，GSE60274病例組：62例。

二、甲基化芯片數(shù)據(jù)的處理

我們將各數(shù)據(jù)庫提供的所有235例甲基化表達(dá)芯片(Illumina Human 450 k)樣本的beta值數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為M值。隨后根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對探針進行篩選：去除包含SNP位點的探針和去除沒有UCSC位點信息的探針。在篩選后的探針中，我們選取了啟動子相關(guān)的CGI shores探針進行研究(n=16 792)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用生物計量研究分支測量(Biometric Research Branch-Array, BRB)軟件以及SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。甲基化探針的M值和病例組生存之間關(guān)系采用置換檢驗(permutation test)和單因Cox回歸模型分析法。置換檢驗根據(jù)10 000次隨機置換計算，并選取P<0.001做為顯著性統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。篩選后的位點應(yīng)用多元Cox回歸模型分析，以此建立風(fēng)險評分方程。我們使用實驗組的中位風(fēng)險評分值M將各病例組患者分成高風(fēng)險阻和低風(fēng)險組，隨后采用Kaplan-Meier檢驗對高風(fēng)險組、低風(fēng)險組分別進行生存期分析。

結(jié) 果

一、GBM病例的一般資料

本研究共納入235例來自TCGA數(shù)據(jù)庫(136例)，GEO數(shù)據(jù)庫(99例，其中GSE60274系列 62例及GSE36278系列37例)的成人GBM病例，其中男144例，女91例；235例患者的平均年齡為(55.2±13.1)歲。各數(shù)據(jù)庫病例的人口學(xué)特征及臨床資料詳見表1。

表1 所選GBM數(shù)據(jù)庫的患者臨床資料特征

Tab 1 Patients' characteristics of included GBM datasets

GBMdatasetsAllpatientsTCGAGSE36278GSE60274 Samplesize2351363762 Gender(male/female)144/9178/5819/1847/15 Age(x±s)55.2±13.160.1±12.844.2±10.051.0±9.5 TMZtherapy12593-32 Methylated/unmethylated54/7138/55-16/16

GBM: glioblastoma; TMZ: temozolomide.

二、生存相關(guān)CGI shores探針篩選

由于GSE36278病例組樣本量較小，我們將TCGA病例組(n=136)和GSE36278病例組(n=37)合并為實驗組(n=173)。通過使用BRB軟件，對實驗組的GCI shores位點甲基化M值進行單因Cox回歸模型分析和置換檢驗。根據(jù)P<0.001標(biāo)準(zhǔn)，在16 792個CGI shores探針中得到112個與生存密切相關(guān)的探針。隨后在實驗組中對這112個探針的甲基化M值進行多元Cox回歸模型分析，根據(jù)P<0.01標(biāo)準(zhǔn)，最后得到7個與生期相關(guān)的探針位點(表2)。

表2 與實驗組病例生存相關(guān)的GCI shores探針

Tab 2 GCI shores probes were significantly associated with the overall survival in the training-set patients

ProbeIDCoefficientHRGeneTypeReportedfunctiononcancercells Groupdifference0.0591.061 cg24814117-0.2750.759AP3B1S_Shoreunknown cg25591868-0.2820.754RGS16S_Shoreimproveproliferation cg084386900.3541.424PPM1MN_Shoreunknown cg03113285-0.1640.849ENPP4S_Shoreunknown cg25340675-0.6680.513GOLGB1S_Shoreunknown cg25821785-0.3630.695CACNA2D2S_Shoreimproveproliferation,angiogenesis cg10822582-0.3000.741TMEM16S_Shoreimproveproliferation,migration,invasion

HR: harzad ratio.

三、基于7-CGI shores甲基化探針M值風(fēng)險評分方程的建立

根據(jù)cox結(jié)果的回歸系數(shù)建立了基于這7個探針位點的風(fēng)險評分方程：Risk score=(-0.275 M value of cg24814117)+(-0.282 M value of cg25591868)+(0.354 M value of cg08438690)+(-0.164 M value of cg03113285)+(-0.668 M value of cg25340675)+(-0.363 M value of cg25821785)+(-0.300 M value of cg10822582)。實驗組病例根據(jù)風(fēng)險評分的中位數(shù)的風(fēng)險值(M=4.4)分為低風(fēng)險組(n=86)和高風(fēng)險組(n=87)。高風(fēng)險組的生存時間(中位OS：8.5個月，95% CI：5.7～11.3月)明顯短于低風(fēng)險組(中位OS：16.2個月；95% CI：12.6～19.7個月)，χ2=41.365，P<0.001。

圖1 Kaplan-Meier檢驗7-GCI shores甲基化風(fēng)險評分與各病例組患者生存的關(guān)系

Fig 1 The relationship between 7-GCI shores methylation signature and the cumulative survival of patients of each group was detected by using Kaplan-Meier

A: Training-set (combined TCGA and GSE36278 group,n=173): high risk (n=87)vslow risk (n=86), χ2=41.365,P<0.001; B: TCGA group (n=136): high risk (n=72)vslow risk (n=64), χ2=35.685,P<0.001; C: GSE36278 group (n=37): high risk (n=15)vslow risk (n=22), χ2=5.193,P=0.023; D: Testing set (GSE60274,n=62): high risk (n=25)vslow risk (n=37), χ2=8.665,P=0.003.

The high-risk and low-risk group of patients are determined on the basis of the median risk score from the training set patients.

四、7-GCI shores風(fēng)險評分與TCGA病例組、GSE36278組和驗證組預(yù)后的關(guān)系

為減少假陽性結(jié)果，進一步驗證風(fēng)險評分方程對GBM患者預(yù)后的預(yù)測作用，我們分別使用風(fēng)險評分方程計算了各病例的風(fēng)險評分并用實驗組中位風(fēng)險值將TCGA病例組、GS36278病例組和實驗組GSE60274分成了高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。與實驗組結(jié)果相似，TCGA病例組中高風(fēng)險組(n=72)中位OS(8.1個月，95% CI：5.8～10.5個月)短于低風(fēng)險組(n=64)中位OS(20.1個月，95% CI：17.4～22.8個月)，χ2=35.685,P<0.001；GSE36278病例組中高風(fēng)險組(n=15)的中位OS(12個月，95% CI：11.5～12.5個月)短于低風(fēng)險組(n=22)的中位OS(15個月，95% CI：12.4～17.6個月)，χ2=5.193,P=0.023；驗證組GSE60274病例組中高風(fēng)險組(n=25)的中位OS(10.5個月，95% CI：7.8～13.1個月)短于低風(fēng)險組(n=37)的中位OS(16.0個月，95% CI：14.3～17.7個月)，χ2=8.665，P=0.003。

五、7-GCI shores風(fēng)險評分與患者年齡，MGMT啟動子甲基化狀態(tài)在預(yù)后評價中的關(guān)系

我們對所有使用替莫唑胺(temozolomide, TMZ)治療的病例(n=125)的年齡、MGMT啟動子甲基化狀態(tài)同7-GCI shores風(fēng)險評分一起進行多因素Cox回歸模型分析。結(jié)果表明7-GCI shores風(fēng)險評分是獨立于年齡和MGMT啟動子甲基化狀態(tài)的預(yù)后因素(表3)。而在對所有病例進行Cox回歸模型分析的結(jié)果也顯示7-GCI shores風(fēng)險評分是獨立于年齡的預(yù)后因素(P<0.001, HR: 1.93, 95% CI: 1.59～2.33)。

表3 多因素Cox回歸分析7-GCI shores風(fēng)險評分與年齡、MGMT啟動子甲基化狀態(tài)對生存的影響

Tab 3 Effect of 7-GCI shores signature, age and MGMT promoter methylation status on survival by multivariate Cox analysis

PrognosticfactorHR95%CIPvalue Patientsgroup1.6420.94～2.880.083 Age1.0351.01～1.060.006 Gender1.2670.76～2.160.363 MGMTpromotermethylationsta-tus0.4570.24～0.880.018 7-GCIshoressignature2.0541.52～2.77<0.001

HR: hazard ratio; CI: confidence interval.

討 論

全基因組甲基化水平的高通量檢測平臺已經(jīng)為建立大樣本病例甲基化組奠定了較好的基礎(chǔ)。使用模式分析TCGA等數(shù)據(jù)庫已發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤CGI甲基化表型(G-CIMP)，隨后，G-CIMP陽性和陰性表型所具有的分子基礎(chǔ)和染色體改變特點也被偶聯(lián)確認(rèn)[3]。然而，G-CIMP并不能完全解釋膠質(zhì)瘤的所有類型，其應(yīng)用具有一定的局限性。因此，研究非CGI甲基化改變模式對腫瘤的影響顯得甚為重要。CGI shores是CpG密度僅次于CGI的區(qū)域，然而其甲基化改變與GBM之間的關(guān)系目前尚無研究報道。

本研究選取了包含啟動子的GCI shores進行分析，最終得到了7個與GBM患者生存密切相關(guān)GCI shores。這7個GCI shores關(guān)聯(lián)的基因分別為銜接蛋白-3的β3A亞基(β1 subunit of adaptor protein-3, AP3B1)基因、G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白16(regulator of G protein signaling 16, RGS16)基因、Mg2+/Mn2+依賴的蛋白磷酸酶1M(protein phosphatase, Mg2+/Mn2+dependent 1M, PPM1M)基因、核苷酸內(nèi)焦磷酸酶/磷酸二酯酶4(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 4, ENPP4)基因、高爾基體蛋白B1(golgin B1, GOLGB1)基因、鈣離子電壓門控通道輔助蛋白亞基α2δ2(calcium voltage-gated channel auxiliary subunit α2δ2, CACNA2D2)基因、穿膜蛋白16(transmembrane protein 16, TMEM16)基因。其中，TMEM16基因編碼穿膜蛋白16(transmembrane protein16)，也被稱為Anoctamin，是一種鈣激活氯通道(calcium-activatedchloridechannels, CaCCs)蛋白，細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加可以激活其家族的Ano1(anoctamin1)從而調(diào)節(jié)唾液腺、氣管、胰腺、腸道、乳腺上皮細(xì)胞的分泌及細(xì)胞體積[4]。Ano1在不同級別膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)增加，將其敲除可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[5]。RGS16基因編碼GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein, GAP)，是GTP酶激活α亞族的G蛋白偶聯(lián)受體。在正?；蚰[瘤細(xì)胞中GAP負(fù)向調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT)，Rho家族蛋白A和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/趨化因子受體4 (stromal cell derived factor 1/chemokine receptor type 4, SDF-1/CXCR4)等癌基因通路，這些通路在多種惡性腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。乳腺癌患者中約有半數(shù)都會出現(xiàn)RGS16序列的不穩(wěn)定，敲除RGS16基因可增加乳腺癌細(xì)胞表皮生長因子表達(dá)并促進腫瘤細(xì)胞增殖[6]。另外，RGS16基因表達(dá)上調(diào)可能受到p53和pRb基因的調(diào)節(jié)從而增加胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，降低患者的生存期[7]。CACNA2D2基因編碼α2δ2蛋白，該基因位于腫瘤抑制基因簇的染色體3p21.3區(qū)域，該區(qū)域超甲基化或缺失在肺癌和胰腺癌中均有發(fā)生[8]。但是CACNA2D2基因?qū)δ[瘤的作用存在爭議，Carboni等研究發(fā)現(xiàn)CACNA2D2基因高表達(dá)可促進裸鼠的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長[9]。而在對前列腺癌的研究中，CACNA2D2基因卻表現(xiàn)出促癌作用，其表達(dá)增加可以激活前列腺癌細(xì)胞增殖，并增加血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)分泌[10]。AP3B1基因編碼銜接蛋白3 (adaptor related protein complex 3, AP-3)復(fù)合體的β3A亞基。AP-3復(fù)合體是異四聚體的復(fù)合體，系細(xì)胞質(zhì)中無所不在的蛋白，為生黑色素細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞分泌溶酶體所必須成分，神經(jīng)元缺乏AP-3復(fù)合體會導(dǎo)致突觸小泡分泌異常[11]。在乳腺癌和肝癌中，AP3B1基因表達(dá)受到抑癌miRNA mir-9的直接調(diào)控，不過其對癌細(xì)胞的影響并不清楚[12]。ENPP4基因編碼核苷酸內(nèi)焦磷酸酶/磷酸二酯酶4(ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 4, ENPP4)，屬于ENPP家族。ENPP家族可以啟動核苷二磷酸和核苷三磷酸的水解作用進而影響骨和軟骨軟化、核苷酸循環(huán)、細(xì)胞運動以及各種嘌呤和嘌呤受體相關(guān)通路[13]。其在小鼠骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型中表達(dá)異常[14]。GOLGB1基因位于染色體3q13，編碼高爾基體b1蛋白，是最大的高爾基復(fù)合體相關(guān)蛋白[15]。高爾基體蛋白在蛋白質(zhì)糖基化和胚胎發(fā)育中起作用，于骨髓增殖性腫瘤患者中GOLGB1基因可以和血小板轉(zhuǎn)化生長因子受體B形成融合基因[16]。以上基因中，部分已經(jīng)證實對某些腫瘤具有影響，但在它們GBM中的研究較少，仍需進一步的離體和在體研究來深入我們對其功能的理解。

在本研究中，我們建立并驗證了可以預(yù)測GBM患者生存的基于7個GCI shores區(qū)甲基化狀態(tài)的風(fēng)險評分方程。同樣，本風(fēng)險評分是獨立于年齡和MGMT啟動子甲基化狀態(tài)的GBM患者預(yù)后因素。使用該風(fēng)險評分方程可更為準(zhǔn)確的評估GBM患者的預(yù)后，并指導(dǎo)GBM患者個體化治療。本研究是第一個探索GCI shores甲基化狀態(tài)與GBM預(yù)后關(guān)系的報道，加深GCI shores甲基化模式的理解將有助于完善G-CIMP以外的GBM表型，為今后進一步完善GBM甲基化圖譜表明了新的方向。

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