梅盛前 肖 捷 李 放 余海平

（浙江省建德市第一人民醫(yī)院，浙江 建德 311600）

急性脊髓損傷（ASCI）是由脊髓受到嚴(yán)重的壓迫引起的，是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，能夠引發(fā)患者出現(xiàn)多功能障礙，嚴(yán)重的ASCI能夠?qū)е禄颊甙c瘓或死亡［1］。目前臨床上治療ASCI主要以手術(shù)治療和西藥輔助治療為主，不能從根本上減輕ASCI，且西藥不能改善ASCI后便秘癥狀。中藥以其安全、高效的特點在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用越來越廣泛［2］。黃芩莖葉黃酮（SSF）是從植物黃芩的莖葉中提取的黃酮類化合物，具有減輕炎癥損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)以及改善記憶障礙等多種作用［3］。還有研究表明，SSF能夠減輕局灶性缺血大鼠神經(jīng)元損傷［4］。然而SSF對ASCI大鼠神經(jīng)保護(hù)作用及對高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll樣受體4（TLR4）/核因子 κB（NF-κB）信號通路的影響尚未見報道，為此本研究對SSF對ASCI大鼠神經(jīng)保護(hù)作用及潛在的分子機(jī)制進(jìn)行探討，旨在為ASCI的臨床治療提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠72只，SPF級，雌雄各半，6～8 周齡，體質(zhì)量（140±20） g，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，許可證號：SYXK（京）2015-0001。

1.2 材料與儀器 SSF購自承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所；甲強(qiáng)龍（生產(chǎn)批號：150102，規(guī)格：40 mg）購自輝瑞制藥有限公司；兔抗鼠HMGB1、TLR4、NF-κB多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；SZ51奧林巴斯體視顯微鏡購自日本；Leica 1800切片機(jī)購自德國。

1.3 造模與分組 根據(jù)文獻(xiàn)資料［5］，按1 mL/100 g腹腔注射4%水合氯醛進(jìn)行麻醉，將大鼠以俯臥姿固定在手術(shù)臺上，背部剪毛消毒后，于背部中線切開，去除大鼠T9～T10椎板，用質(zhì)量為10 g的砝碼從5 cm高度自由落下，撞擊面直徑約為3 cm，以砝碼落下后大鼠出現(xiàn)搖尾反射、雙后肢及身體回縮撲動后雙后肢癱瘓為ASCI模型構(gòu)建成功。假手術(shù)組只去除T9～T10椎板，但不以重物撞擊。將造模成功的大鼠隨機(jī)分成5組，每組12只，分別命名為模型組、甲強(qiáng)龍組、SSF低劑量組、SSF中劑量組、SSF高劑量組。甲強(qiáng)龍組給予40 mg/（kg·d）甲強(qiáng)龍［6］，SSF 組按低、中、高劑量分別給予 SSF 50、100、200 mg/（kg·d） SSF［7］，所有大鼠均行腹腔注射治療，假手術(shù)組及模型組給予等量生理鹽水，持續(xù)治療4周。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）脊髓運(yùn)動功能（BBB）評分評定大鼠脊髓損傷情況［8］。各組大鼠膀胱排空后，晚上8點采用BBB評分法檢測各組大鼠行走及髖、膝、踝關(guān)節(jié)的協(xié)調(diào)情況，每天觀察時間為4 min。0～7分：評估恢復(fù)早期的后肢關(guān)節(jié)運(yùn)動；8～13分：評估恢復(fù)中期的步態(tài)和協(xié)調(diào)運(yùn)動；14～21分：評估運(yùn)動時爪子的精細(xì)運(yùn)動。2）HE染色檢測脊髓組織病理學(xué)變化。持續(xù)治療4周后，每組取9只大鼠進(jìn)行麻醉，于無菌條件下打開胸腔，暴露心臟，用4%多聚甲醛灌注固定，直至心臟變白，解剖椎管取出損傷段脊髓，置于10%的中性甲醛溶液固定4 h。每組取3只大鼠制作組織切片，切片厚度5 μm，脫蠟后用蘇木精染色 20 min，自來水洗滌1 min，稀氨水（1%）返藍(lán) 30 s，自來水洗滌 1 min，用1%的鹽酸酒精溶液分化1 min，自來水洗滌1 min，再用伊紅染色3 min左右，自來水洗滌1 min，將組織切片逐級脫水后，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于體視顯微鏡下觀察大鼠脊髓組織病理學(xué)變化情況。3）TUNEL檢測脊髓組織細(xì)胞凋亡情況。持續(xù)治療4周后，每組取3只大鼠脊髓組織制作石蠟切片，切片厚度5 μm。60℃烤片3 h，脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，然后將玻片浸入0.1 mol/L TBS溶液放置30 min，用PBS溶液沖洗后，然后滴加50 μL TUNEL反應(yīng)液，置于濕盒中37℃孵育1 h，用PBS溶液沖洗后，滴加3%的雙氧水10 min，用PBS溶液沖洗后，滴加50 μL Converter-POD，置于濕盒中37℃孵育1 h，DBA顯色后用蘇木素復(fù)染，將組織切片逐級脫水后，二甲苯透明，中性樹膠封片。正常細(xì)胞經(jīng)染色后呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞染色后呈黃褐色，凋亡指數(shù)＝凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。4）脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)水平。持續(xù)治療4周后，每組取3只大鼠脊髓組織，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），每孔上樣體積 20 μL，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min，分別滴加一抗，置于4℃下過夜，滴加二抗37℃放置1 h。顯影后采集圖像，并采用Gel-Pro analyzer4 軟件分析 HMGB1、TLR4、NF-κB 表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步比較采用q檢驗或Dunnett t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠BBB評分比較 見表1。模型組BBB評分顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）；甲強(qiáng)龍組和SSF組BBB評分顯著高于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組BBB評分與甲強(qiáng)龍組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組測脊髓組織病理學(xué)變化比較 見圖1。持續(xù)治療4周后，假手術(shù)組大鼠骨髓灰白質(zhì)交界清楚，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，且著色均勻，細(xì)胞核內(nèi)核仁清晰可見；模型組脊髓壞死嚴(yán)重，出現(xiàn)很多空腔，灰質(zhì)中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞核固縮；與模型組相比，甲強(qiáng)龍組和SSF組因壞死形成的空腔減少。

2.3 各組脊髓組織細(xì)胞凋亡情況比較 見圖2，表2。持續(xù)治療4周后，模型組脊髓細(xì)胞凋亡率顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；甲強(qiáng)龍組和SSF組脊髓細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組脊髓細(xì)胞凋亡率與甲強(qiáng)龍組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠BBB評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠BBB評分比較（分，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與甲強(qiáng)龍組比較，#P＜0.05；與SSF低劑量組比較，◇P＜0.05；與SSF中劑量組比較，▲P＜0.05。 下同。

第14天 第28天20.57±3.02 20.73±3.17 6.52±1.31* 9.82±1.41*16.63±2.23△ 19.52±2.52△SSF 低劑量組 12 2.58±0.47△# 4.23±0.78△# 5.41±1.15△# 6.42±1.36△# 12.17±2.05△#SSF 中劑量組 12 5.51±1.23△#◇ 7.28±2.02△#◇ 9.36±1.78△#◇ 12.13±2.18△#◇ 15.86±2.31△#◇SSF 高劑量組 12 10.14±2.11△◇▲ 12.08±2.15△◇▲ 13.82±2.16△◇▲ 16.61±2.25△◇▲ 19.36±2.47△◇▲組 別 n假手術(shù)組 12模型組 12甲強(qiáng)龍組 12第1天 第3天 第7天19.32±3.12 19.73±3.07 20.42±3.15 0.75±0.13* 2.13±0.27* 3.75±0.54*10.06±2.06△ 12.21±2.13△ 13.92±2.15△

圖1 各組脊髓組織病理學(xué)變化（HE染色，400倍）

圖2 TUNEL檢測各組脊髓組織細(xì)胞凋亡情況（100倍）

2.4 脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)水平見圖3，表3。持續(xù)治療4周后，模型組脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB 表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；甲強(qiáng)龍組和SSF組脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB 表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組脊髓組織中 HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)水平與甲強(qiáng)龍組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 TUNEL檢測脊髓組織細(xì)胞凋亡情況（%，±s）

表2 TUNEL檢測脊髓組織細(xì)胞凋亡情況（%，±s）

細(xì)胞凋亡率6.57±1.34 78.47±5.47*15.72±1.73△SSF 低劑量組 12 57.36±4.13△#SSF 中劑量組 12 35.17±3.46△#◇SSF 高劑量組 12 15.61±1.92△◇▲組 別 n假手術(shù)組 12模型組 12甲強(qiáng)龍組 12

圖3 各組脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)情況

表3 脊髓組織中 HMGB1、TLR4、NF-κB 表達(dá)水平（±s）

表3 脊髓組織中 HMGB1、TLR4、NF-κB 表達(dá)水平（±s）

HMGB1 TLR4 NF-κB 0.25±0.03 0.38±0.04 0.21±0.01 0.91±0.08* 1.17±0.12* 1.02±0.10*0.28±0.03△ 0.52±0.05△ 0.39±0.03△SSF 低劑量組 12 0.71±0.07△# 0.92±0.09△# 0.81±0.08△#SSF 中劑量組 12 0.48±0.06△#◇ 0.73±0.07△#◇ 0.60±0.06△#◇SSF 高劑量組 12 0.31±0.04△◇▲ 0.49±0.05△◇▲ 0.41±0.06△◇▲組 別 n假手術(shù)組 12模型組 12甲強(qiáng)龍組 12

3 討 論

ASCI是由外界沖擊和壓迫引起的脊髓神經(jīng)功能障礙，是一種高致殘性的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，嚴(yán)重威脅患者的身體健康和生命安全［9］。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界脊髓損傷發(fā)生率高達(dá)755例/百萬，每年的新增病例高達(dá)83例/百萬人，死亡人數(shù)約占其中的69%，近年來，隨著交通事故等不良事件的發(fā)生，ASCI的發(fā)生率逐年攀升［10］。脊髓損傷患者的臨床癥狀主要表現(xiàn)為局灶性出血、組織水腫以及炎性細(xì)胞浸潤［11］。其病理改變主要表現(xiàn)為灰質(zhì)和白質(zhì)損傷，甚至引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。因此，探究安全、高效的藥物是治療ASCI的重點。

甲強(qiáng)龍是治療ASCI的常用藥物，然而西醫(yī)治療ASCI具有一定的局限性。中醫(yī)對ASCI的發(fā)病機(jī)制具有更深的理解，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為ASCI是由外力損傷督脈導(dǎo)致氣血瘀阻，屬于“痿躄”“瘀證”“體惰”范疇［12］。 因此，中醫(yī)治療ASCI以活血化瘀、通脈活絡(luò)、益氣補(bǔ)血為主［13］。SSF是從中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，具有多種藥理活性。程建軍等研究表明，SSF通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡減輕β-淀粉樣蛋白所致的大鼠記憶障礙［14］。王玉梅等研究表明，SSF通過抑制腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子的生成改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能［15］。王玉梅研究表明還表明，SSF通過調(diào)控腦內(nèi)天門冬氨酸受體和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)發(fā)揮對腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用［16］。以上研究均表明，SSF具有減輕記憶障礙和神經(jīng)保護(hù)功能，推測SSF對ASCI大鼠也具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究表明，甲強(qiáng)龍組和SSF組BBB評分顯著高于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組BBB評分與甲強(qiáng)龍組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；HE染色結(jié)果顯示，模型組脊髓壞死嚴(yán)重，出現(xiàn)很多空腔，灰質(zhì)中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞核固縮；與模型組相比，甲強(qiáng)龍組和SSF組因壞死形成的空腔減少，以上結(jié)果提示，SSF對ASCI大鼠神經(jīng)具有保護(hù)功能。甲強(qiáng)龍組和SSF組脊髓細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組脊髓細(xì)胞凋亡率與甲強(qiáng)龍組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示SSF能夠抑制ASCI大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

SSF對ASCI大鼠神經(jīng)具有保護(hù)功能的作用機(jī)制尚未完全明確。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是細(xì)胞核內(nèi)重要的DNA結(jié)合蛋白，能夠調(diào)控DNA的重組、基因的復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄。近年來有研究表明，HMGB1是一種重要的免疫輔佐劑，能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞釋放免疫因子，進(jìn)而激活免疫應(yīng)答反應(yīng)，減輕機(jī)體炎癥損傷［17］。楊晶等研究表明，降低脊髓組織中HMGB1表達(dá)水平能夠減輕脊髓損傷后炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮對其神經(jīng)的保護(hù)作用［18］。TLR4和NF-κB是參與機(jī)體免疫反應(yīng)的重要的蛋白質(zhì)分子。張立才研究表明，通過抑制脊髓損傷大鼠TLR4炎癥通路能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)功能［19］。還有研究表明，抑制脊髓損傷大鼠NF-κB通路能夠抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)功能［20］。以上研究表明，HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本研究表明，甲強(qiáng)龍組和SSF組脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB 表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.05）；SSF高劑量組脊髓組織中 HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)水平與甲強(qiáng)龍組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示，SSF可能通過下調(diào)脊髓組織中HMGB1、TLR4、NF-κB表達(dá)水平，減輕炎癥損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)功能。

綜上所述，SSF對ASCI大鼠神經(jīng)具有保護(hù)作用，這一作用可能通過調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路實現(xiàn)的，為ASCI的臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

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